Download Trabajo final del curso: “Diseño, ejecución y reporte de
Document related concepts
Transcript
Trabajo final del curso: “Diseño, ejecución y reporte de experimentos de retrotranscripción seguida de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT qPCR)” Lic. Elina Vanesa García MIQE Checklist Item a chequear Diseño experimental Definición de los grupos experimentales y controles Importancia E Número dentro de cada grupo E Ensayo llevado a cabo por un servicio o por laboratorio del investigador? Agradecimiento a contribuciones de autor Muestra Descripción D Volúmen/masa de muestra procesada D Microdisección o macro disección Procedimiento de procesado E Detalle Grupo experimental: Cultivo de células epiteliales de oviducto bovino cultivadas en presencia de proteína recombinante humana BMP-5 a diferentes tiempos (0, 12 y 24 hs). Grupo control: Cultivo de células epiteliales de oviducto bovino cultivadas en presencia del vehiculizante del compuesto a diferentes tiempos (0, 12 y 24 hs). n = 4 muestras tratadas por cada tiempo de incubación (0, 12 y 24 hs) n= 4 muestras controles por cada tiempo de incubación (0, 12 y 24 hs) Realizado por el laboratorio D E E Células epiteliales de oviducto bovino cultivadas en presencia o ausencia de la proteína recombinante humana. El cultivo se realiza en placa de 24 wells, 106 células en volumen final de 800 ul de medio TCM 199 + ATB + 10% BSA suplementado con 100 ng/ml de BMP-5 o no. El cultivo se lleva a cabo en estufa gasificada a 38,5ºC, 100% humedad y 5% CO2 106 células sembradas inicialmente x well, luego de las incubaciones se toma todo el volumen del well, se centrifuga, se lava, se descarta sobrenadante y se calcula el peso del pellet por diferencia de peso con un tubo tarado, y se adiciona 1 ml de Trizol hasta 20 mg. N/A Se centrifuga el volumen total de cada well experimental, se lava con PBS, se descarta el sobrenandante y se trabaja con el pellet celular. Al mismo se le adiciona 1 ml de Trizol e inmediatamente se vortexea para disgregar la muestra. Si se congeló, cómo y E cuán rápido? Se se fijó, con qué y E cuán rápido? Condiciones y duración E del almacenamiento de las muestras Extracción de ácidos nucleicos Procedimiento y/o E instrumentos Las muestras lisadas se reservan a -80°C hasta su procesamiento para la extracción del ARN. N/A Nombre del kit y detalles de modificaciones Origen de los reactivos adicionales utilizados E TRIzol Reagent (Invitrogen, Cat. 15596-026), sin modificaciones respecto al protocolo del fabricante. D Cloroformo (Ciccareli pro-analisis); Isopropanol (Cicarelli pro-analis); Etanol Absoluto (Cicarelli pro-analisis); Agua libre de RNasa tratada con DEPC Detalles del tratamiento con DNAsa o RNAsa E Evaluación de la contaminación (DNA o RNA) E Cuantificación de ácidos nucleicos Instrumento y método Pureza (A260/A280) E Rendimiento Integridad del RNA: método/instrumento D E 1 ug del ARN obtenido fue tratado con 1 ul de DNAsa (RQ1 Rnasa-free DNasa - Promega) en un volumen final de reacción de 20 ul. La digestión del ADN se llevó a cabo durante 30' a 37°C. La reacción se detuvo con 1 ul de DNasa Stop Solution (Promega) seguido de una incubación de 10 min a 65ºC para la inactivación de la enzima. Se realizaron controles de la retro-transcripción sin enzima (RT minus controls) para verificar la ausencia de ADN en las muestras de ARN. Para ello 1 ug de ARN de cada muestra fue procesado como una muestra normal en el paso de RT, excepto que no se agregó la transcriptasa reversa a la mezcla de reacción. La concentración de ARN fue determinada por medida de la absorbancia a 260 nm en espectrofotómetro. Espectrofotómetro UV La pureza del ARN obtenido fue estimada mediante el cociente de la absorbancia obtenida a 260 nm sobre la obtenida a 280 nm. Solo se trabajó con muestra cuyos valores estaban comprendidos entre 1,8 – 2,0. N/A La integridad del ARN fue evaluada por la relación entre las intensidades de bandas de 18S y 28S luego de electroforesis en geles de agarosa al 1,5% en buffer TAE 1X (Tris acetato 40 mM pH 8; EDTA 1 mM) teñidos con Syber Safe. Las corridas electroforéticas fueron realizadas en el amortiguador TAE mencionado E D Las muestras se almacenaron a -80°C como máximo hasta 1 semana antes de la extracción de ARN. El ARN total se extrajo utilizando TRIzol Reagent (Invitrogen) siguiendo las indicaciones del fabricante. El ARN purificado fue disuelto en 20 ul de agua tratada con DEPC y guardado a -80°C. previamente, a una intensidad de corriente constante de 80 mA. Sólo las muestras con una relación 28S/18S > 1,7 fueron usadas. RIN/RQI o Cq de transcriptos 3' o 5' Trazas de electroforesis Ensayo de inhibición Transcripción reversa Condiciones completas de reacción Cantidad de RNA y volumen de reacción Priming oligonucleótido (si son específicos de genes) y concentración Transcriptasa reversa y concentración Temperatura y tiempo Fabricante de reactivos y números de catálogo E D E E E No realizado No se realizó ningún ensayo específico para descartar inhibición. La curva estandar fue considerada suficiente para descartar la presencia de inhibidores de la actividad de retro-transcriptasa o de la PCR. Aproximadamente 0,5 ug de ARN extraído fueron desnaturalizados a 70°C durante 5 minutos en un volumen de final de 13,5 µl conteniendo agua estéril libre de nucleasas y 0,5 ug de cebador oligo dT y random primer. Transcurrido el tiempo, los tubos se enfriaron rápidamente 2 min en hielo para evitar la renaturalización de las hebras de ARN. A continuación se añadieron 11,5 µl de una mezcla de reacción para transcripción reversa compuesta por: 5 ul de Buffer 5X M-MLV Reverse Transcriptase (Promega) (Tris-HCl 83,33 mM, pH 8,3; KCl 125 mM; MgCl2 5 mM; DTT 16,67 mM ); 5 ul de mezcla de dinucléotidos trifosfato o dNTPs (Invitrogen) (0,83 mM de cada uno: dATP, dTTP, dCTP y dGTP; 1 ul ( 200 U/ul) de la enzima transcriptasa reversa M-MLV (Virus de la leucemia murina de Moloney, Promega) y 0,5 ul de agua libre de ARNasas completando de este modo un volumen final de reacción de 25 ul. La mezcla de reacción se homogeneizó bien y se sometió a un ciclo de síntesis de ADNc a 42ºC durante 90 minutos y una etapa final de desnaturalización de la enzima a 94ºC durante 2 minutos. Los ADNc obtenidos finalmente se reservaron a -20ºC hasta ser utilizados. Para las muestras de control negativo de transcripción, el volumen de enzima fue reemplazado por agua. Cantidad de ARN: 500 ng; Volumen de reacción: 25 ul E OligodT 0,5 ug/ul Random primers 25 pmoles/ul E 1 ul ( 200 U/ul) de la enzima transcriptasa reversa MMLV (Promega – M170A) Especificado en "Condiciones completas de reacción" DNase (Promega, M610A); dNTP Mix (Promega U1240); M-MLV (Promega, M170A) E D Cqs con y sin transcripción reversa D Los Cq obtenidos para los genes de interés con transcripción reversa estaban comprendidos entre 20 – 30 Cq mientras que para los controles sin transcripción reversa (RT(-) control), en aquellos tubos que se detectó señal la misma presentaron Cq > 38, teniendo más de 8 Cq de diferencia con los Cq de las muestras analizadas. Condiciones de D almacenamiento del cDNA Información del target de la qPCR Símbolo del gen E Número de acceso de la secuencia E Localización del amplicón D Tamaño del amplicón E Búsqueda in silico de especificidad (BLAST, etc) E Pseudogenes, retropseudogenes, u otros homólogos? Alineamiento de secuencias D Análisis de estructura secundaria del amplicón Localización de cada primer por exón o intrón D D E -20ºC ACTB: Beta actina Bos Taurus GAPDH: Bos taurus glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ID1: Bos taurus inhibitor of DNA binding 1 ID2: Bos taurus inhibitor of DNA binding 2 ACTB: NM_173979 GAPDH: NM_001034034 ID1: NM_001097568 ID2: NM_001034231 ACTB: 806 – 956 GAPDH: 450 – 567 ID1: 489 - 626 ID2: 459 - 603 ACTB: 150 pb GAPDH: 117 pb ID1: 145 pb ID2: 138 pb El diseño y la especificidad de los oligos fue verificada usando NCBI Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/), empleando como base de datos de referencia la base ARNm y el organismo Bos taurus. No presenta Se chequeó realizó mediante el programa BLASTN empleando como base de datos de referencia la base ARNm del organismo Bos taurus. No se realizó Los primers fueron diseñados para que hibriden entre exones contiguos, flanqueando intrones para evitar la amplificación de ADN genómico. ACTB: Exón 3 y 4 – Intrón de 961 pb GAPDH: Exón 2 y 3 – Intrón de 1787 pb ID1: Exón 1 y 2 – Intrón 180 pb Que variantes de splicing son detectadas? E Información de los oligos de la qPCR Secuencias de primers E ID2: Exón 2 y 3 – Intrón 1126 pb Según lo documentado en la NCBI RefSeq RNA database, los genes estudiados no presentan variantes de splicing ACTB: Forward 5´ - GAG CTA CGA GCT TCC TGA CG - 3´ Reverse 5´ - GGG CAG TGA TCT CTT TCT GC - 3´ GAPDH: Forward 5´- AGATGGTGAAGGTCGGAGTG – 3 ´ Reverse 5´- GAAGGTCAATGAAGGGGTCA – 3´ ID1: Forward 5´- ACTCTCAACGGCGAAATCGG – 3´ Reverse 5´- AGCACTTATTCCTCTCGCCC – 3´ ID2: Forward 5´- CGACATCAGCATCCTGTCCTT – 3´ Reverse 5´- AGAGCCTGTGGATTTGTTGTT – 3´ Número de identificación del RTprimerDB Secuencias de sonda Localización e identidad de modificaciones Fabricante de los oligonucleótidos Método de purificación Protocolo de qPCR Condiciones completas de reacción D No presentan D E No se utilizó sonda D Invitrogen Argentina D Desalados E Volumen de reacción y cantidad de cDNA/DNA Concentración de primers, (sonda), Mg2+ E Las reacciones de PCR fueron realizadas en un termociclador CFX96 (Bio-rad) en un volumen final de 20 ul conteniendo 5 ul de cDNA dilución 1/10, 10 ul de SYBR Green Master Mix 2X (Bio-rad), 2 ul de la mix de primer (500 nM) y 3 ul de agua grado PCR. La reacción de PCR fue iniciada con una incubación de 1 minuto a 95°C, seguida de 50 ciclos de 95°C por 15 segundos, 58°C durante 30 segundos y 72°C por 30 segundos. Se incluyó para todos los casos un paso adicional para el análisis de curva de melting. Se incluyó controles negativos sin muestra para descartar contaminación de los reactivos. La eficiencia de amplificación y el coeficiente de correlación de la curva estándar de cada gen se determinó empleando 5 diluciones 1/2 de un ADNc estándar a partir de una dilución inicial de 1/20. Todas las reacciones fueron realizadas por duplicado. Volumen de reacción: 20 ul; cantidad de cDNA: 5 ul de una dilución 1/10 500 nM Primers; 3 mM MgCl2; 0,2 mM dNTP E y dNTPs Concentración e identidad de la Polimerasa Identidad de buffer/kit y fabricantes respectivos Composición química exacta del buffer Aditivos (SYBR Green I, DMSO, etc.) Fabricante de placas/tubos y número de catálogo E Hot start iTaq DNA polimerasa provista en la mix de reacción iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, 1708880) E iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, 1708880) D Indicada por el fabricante iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, 1708880) SYBR® Green I Nucleic Acid Gel Stain (Invitrogen) E D - Parámetros de termociclación completa E Setup de la reacción (manual/robótico) Fabricante de los instrumentos de qPCR Validación de la qPCR Evidencia de optimización (de gradiente) D Especificidad (gel, secuencia, fusión o digestión) E Para SYBR Green I, Cq del NTC E Curvas de calibración con pendiente e intersección y E Eficiencia de la PCR calculada a partir de la curva E - Placas 96 well: Low profile 96-well unskirted plates with clear wells (x 25 unid) (MLL-9601, Bio-rad) - Film óptico: Microseal B adhesive seals, optically clear (MSB-1001, Bio-rad) Desnaturalización inicial: 95°C por 1 minuto, luego 50 ciclos a 95°C durante 15 segundos, 58°C durante 30 segundos y a 72°C por 30 segundos Manual E CFX96 Real-Time PCR Detection System (Catalog. 1855096, Bio-Rad) D Se analizó la eficiencia de amplificación de los cebadores en un gradiente de 54-62°C, mediante PCR convencional. La temperatura óptima de anealing seleccionada fue de 58°C. Análisis de curvas de melting, en rampa desde 60°C a 95°C en 23 minutes, donde la fluorescencia es medida continuamente. La amplificación específica del gen fue confirmada por una banda única en electroforesis en gel de agarosa 1,5% teñido con Syber Safe. Los controles sin molde (sin cDNA en la PCR) fueron corridos para cada gen para detectar amplificación inespecífica y dimerización de primers. Los fragmentos amplificados fueron clonados y secuenciados para verificar la identidad. La señal de amplificación fue muy tardía (Cq>38) y por lo tanto hubo una gran diferencia entre los valores de Cq del control negativo y todas las muestras de cDNA. ACTINA: y = -3.33x + 15.893; GAPDH: y = -3.45x + 29.735 ID1: y = -3.35x + 28.753; ID2: y = -3.33x + 31.573; ACTINA: y = 99,6% GAPDH: 97,4% ID1: y = 98,8% ID2: y = 99,6% CIs para eficiencia de PCR o SE r2 de la curva de calibración D Rango dinámico lineal E Variación del Cq en el LOD CIs a través del rango Para multiplex, eficiencia y LOD de cada ensayo Análisis de datos Programa de análisis de qPCR (orígen, versión) Método de determinación del Cq E Identificación de outliers y disposición Resultados para NTCs Justificación del número y elección de los genes de referencia Descripción del método de normalización Número y concordancia de las réplicas biológicas Número y estadio de las replicas técnicas (transcripción reversa o qPCR) Repetitibilidad (variación intraensayo) Reproducibilidad (variación interensayo, CV) Power análisis? E E ACTINA: 0,907 GAPDH: 0,983 ID1: 0,986 ID2: y 0,907 En promedio, el rango dinámico lineal fue considerado tomando en cuenta la linealidad de las curvas estándar, con diluciones seriadas 1/2 del cDNA desde 10-2 a 10-6. D E N/A E Software Bio-Rad CFX Manager 2.1 (2.1.1022.0523) E El método para la determinación de la linea de cuantificación (Cq) se determinó empleando el setting manual del Software Bio-Rad CFX Manager 2.1 (2.1.1022.0523) No hubo outliers E E E La señal de amplificación fue muy tardía (Cq>38) Los genes de referencia se seleccionaron en base a lo descripto en la literatura. Fueron verificados usando el cálculo del M y CV -delta_delta_Ct D 3 réplicas biológicas E Todas las reacciones de qPCR fueron realizadas por duplicado y repetida 2 veces. E Desviación estándar de los duplicados: 0,1 – 0,3/0,5 D D Métodos estadísticos para significancia de los resultados E Software (orígen, versión) Publicación de los Cq o datos crudos con RDML E D La expresión relativa de los ARNm de los genes analizados para la muestra control y tratada fueron analizadas mediante el método comparativo de análisis del t-student. Una probabilidad <0,05 fue considerada estadìsticamenente diferente. Sigma Stat 3.5 (3.5.0.54)