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Trabajo final del curso: “Diseño, ejecución y reporte de experimentos de retrotranscripción
seguida de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT qPCR)”
Lic. Elina Vanesa García
MIQE Checklist
Item a chequear
Diseño experimental
Definición de los grupos
experimentales y
controles
Importancia
E
Número dentro de cada
grupo
E
Ensayo llevado a cabo
por un servicio o por
laboratorio del
investigador?
Agradecimiento a
contribuciones de autor
Muestra
Descripción
D
Volúmen/masa de
muestra procesada
D
Microdisección o macro
disección
Procedimiento de
procesado
E
Detalle
Grupo experimental: Cultivo de células epiteliales de
oviducto bovino cultivadas en presencia de proteína
recombinante humana BMP-5 a diferentes tiempos (0,
12 y 24 hs).
Grupo control: Cultivo de células epiteliales de
oviducto bovino cultivadas en presencia del
vehiculizante del compuesto a diferentes tiempos (0,
12 y 24 hs).
n = 4 muestras tratadas por cada tiempo de
incubación (0, 12 y 24 hs)
n= 4 muestras controles por cada tiempo de
incubación (0, 12 y 24 hs)
Realizado por el laboratorio
D
E
E
Células epiteliales de oviducto bovino cultivadas en
presencia o ausencia de la proteína recombinante
humana. El cultivo se realiza en placa de 24 wells, 106
células en volumen final de 800 ul de medio TCM 199
+ ATB + 10% BSA suplementado con 100 ng/ml de
BMP-5 o no. El cultivo se lleva a cabo en estufa
gasificada a 38,5ºC, 100% humedad y 5% CO2
106 células sembradas inicialmente x well, luego de las
incubaciones se toma todo el volumen del well, se
centrifuga, se lava, se descarta sobrenadante y se
calcula el peso del pellet por diferencia de peso con un
tubo tarado, y se adiciona 1 ml de Trizol hasta 20 mg.
N/A
Se centrifuga el volumen total de cada well
experimental, se lava con PBS, se descarta el
sobrenandante y se trabaja con el pellet celular. Al
mismo se le adiciona 1 ml de Trizol e inmediatamente
se vortexea para disgregar la muestra.
Si se congeló, cómo y
E
cuán rápido?
Se se fijó, con qué y
E
cuán rápido?
Condiciones y duración
E
del almacenamiento de
las muestras
Extracción de ácidos nucleicos
Procedimiento y/o
E
instrumentos
Las muestras lisadas se reservan a -80°C hasta su
procesamiento para la extracción del ARN.
N/A
Nombre del kit y
detalles de
modificaciones
Origen de los reactivos
adicionales utilizados
E
TRIzol Reagent (Invitrogen, Cat. 15596-026), sin
modificaciones respecto al protocolo del fabricante.
D
Cloroformo (Ciccareli pro-analisis); Isopropanol (Cicarelli
pro-analis); Etanol Absoluto (Cicarelli pro-analisis); Agua
libre de RNasa tratada con DEPC
Detalles del tratamiento
con DNAsa o RNAsa
E
Evaluación de la
contaminación (DNA o
RNA)
E
Cuantificación de ácidos
nucleicos
Instrumento y método
Pureza (A260/A280)
E
Rendimiento
Integridad del RNA:
método/instrumento
D
E
1 ug del ARN obtenido fue tratado con 1 ul de DNAsa
(RQ1 Rnasa-free DNasa - Promega) en un volumen
final de reacción de 20 ul. La digestión del ADN se
llevó a cabo durante 30' a 37°C. La reacción se detuvo
con 1 ul de DNasa Stop Solution (Promega) seguido de
una incubación de 10 min a 65ºC para la inactivación
de la enzima.
Se realizaron controles de la retro-transcripción sin
enzima (RT minus controls) para verificar la ausencia
de ADN en las muestras de ARN. Para ello 1 ug de ARN
de cada muestra fue procesado como una muestra
normal en el paso de RT, excepto que no se agregó la
transcriptasa reversa a la mezcla de reacción.
La concentración de ARN fue determinada por medida
de la absorbancia a 260 nm en espectrofotómetro.
Espectrofotómetro UV
La pureza del ARN obtenido fue estimada mediante el
cociente de la absorbancia obtenida a 260 nm sobre la
obtenida a 280 nm. Solo se trabajó con muestra cuyos
valores estaban comprendidos entre 1,8 – 2,0.
N/A
La integridad del ARN fue evaluada por la relación
entre las intensidades de bandas de 18S y 28S luego
de electroforesis en geles de agarosa al 1,5% en buffer
TAE 1X (Tris acetato 40 mM pH 8; EDTA 1 mM) teñidos
con Syber Safe. Las corridas electroforéticas fueron
realizadas en el amortiguador TAE mencionado
E
D
Las muestras se almacenaron a -80°C como máximo
hasta 1 semana antes de la extracción de ARN.
El ARN total se extrajo utilizando TRIzol Reagent
(Invitrogen) siguiendo las indicaciones del fabricante.
El ARN purificado fue disuelto en 20 ul de agua tratada
con DEPC y guardado a -80°C.
previamente, a una intensidad de corriente constante
de 80 mA. Sólo las muestras con una relación 28S/18S
> 1,7 fueron usadas.
RIN/RQI o Cq de
transcriptos 3' o 5'
Trazas de electroforesis
Ensayo de inhibición
Transcripción reversa
Condiciones completas
de reacción
Cantidad de RNA y
volumen de reacción
Priming oligonucleótido
(si son específicos de
genes) y concentración
Transcriptasa reversa y
concentración
Temperatura y tiempo
Fabricante de reactivos
y números de catálogo
E
D
E
E
E
No realizado
No se realizó ningún ensayo específico para descartar
inhibición. La curva estandar fue considerada
suficiente para descartar la presencia de inhibidores
de la actividad de retro-transcriptasa o de la PCR.
Aproximadamente 0,5 ug de ARN extraído fueron
desnaturalizados a 70°C durante 5 minutos en un
volumen de final de 13,5 µl conteniendo agua estéril
libre de nucleasas y 0,5 ug de cebador oligo dT y
random primer. Transcurrido el tiempo, los tubos se
enfriaron rápidamente 2 min en hielo para evitar la
renaturalización de las hebras de ARN. A continuación
se añadieron 11,5 µl de una mezcla de reacción para
transcripción reversa compuesta por: 5 ul de Buffer 5X
M-MLV Reverse Transcriptase (Promega) (Tris-HCl
83,33 mM, pH 8,3; KCl 125 mM; MgCl2 5 mM; DTT
16,67 mM ); 5 ul de mezcla de dinucléotidos trifosfato
o dNTPs (Invitrogen) (0,83 mM de cada uno: dATP,
dTTP, dCTP y dGTP; 1 ul ( 200 U/ul) de la enzima
transcriptasa reversa M-MLV (Virus de la leucemia
murina de Moloney, Promega) y 0,5 ul de agua libre
de ARNasas completando de este modo un volumen
final de reacción de 25 ul. La mezcla de reacción se
homogeneizó bien y se sometió a un ciclo de síntesis
de ADNc a 42ºC durante 90 minutos y una etapa final
de desnaturalización de la enzima a 94ºC durante 2
minutos. Los ADNc obtenidos finalmente se
reservaron a -20ºC hasta ser utilizados. Para las
muestras de control negativo de transcripción, el
volumen de enzima fue reemplazado por agua.
Cantidad de ARN: 500 ng; Volumen de reacción: 25 ul
E
OligodT 0,5 ug/ul
Random primers 25 pmoles/ul
E
1 ul ( 200 U/ul) de la enzima transcriptasa reversa MMLV (Promega – M170A)
Especificado en "Condiciones completas de reacción"
DNase (Promega, M610A); dNTP Mix (Promega
U1240); M-MLV (Promega, M170A)
E
D
Cqs con y sin
transcripción reversa
D
Los Cq obtenidos para los genes de interés con
transcripción reversa estaban comprendidos entre 20
– 30 Cq mientras que para los controles sin
transcripción reversa (RT(-) control), en aquellos tubos
que se detectó señal la misma presentaron Cq > 38,
teniendo más de 8 Cq de diferencia con los Cq de las
muestras analizadas.
Condiciones de
D
almacenamiento del
cDNA
Información del target de la qPCR
Símbolo del gen
E
Número de acceso de la
secuencia
E
Localización del
amplicón
D
Tamaño del amplicón
E
Búsqueda in silico de
especificidad (BLAST,
etc)
E
Pseudogenes,
retropseudogenes, u
otros homólogos?
Alineamiento de
secuencias
D
Análisis de estructura
secundaria del amplicón
Localización de cada
primer por exón o intrón
D
D
E
-20ºC
ACTB: Beta actina Bos Taurus
GAPDH: Bos taurus glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase
ID1: Bos taurus inhibitor of DNA binding 1
ID2: Bos taurus inhibitor of DNA binding 2
ACTB: NM_173979
GAPDH: NM_001034034
ID1: NM_001097568
ID2: NM_001034231
ACTB: 806 – 956
GAPDH: 450 – 567
ID1: 489 - 626
ID2: 459 - 603
ACTB: 150 pb
GAPDH: 117 pb
ID1: 145 pb
ID2: 138 pb
El diseño y la especificidad de los oligos fue verificada
usando NCBI Primer-BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/),
empleando como base de datos de referencia la base
ARNm y el organismo Bos taurus.
No presenta
Se chequeó realizó mediante el programa BLASTN
empleando como base de datos de referencia la base
ARNm del organismo Bos taurus.
No se realizó
Los primers fueron diseñados para que hibriden entre
exones contiguos, flanqueando intrones para evitar la
amplificación de ADN genómico.
ACTB: Exón 3 y 4 – Intrón de 961 pb
GAPDH: Exón 2 y 3 – Intrón de 1787 pb
ID1: Exón 1 y 2 – Intrón 180 pb
Que variantes de
splicing son detectadas?
E
Información de los oligos de la qPCR
Secuencias de primers
E
ID2: Exón 2 y 3 – Intrón 1126 pb
Según lo documentado en la NCBI RefSeq RNA
database, los genes estudiados no presentan variantes
de splicing
ACTB: Forward 5´ - GAG CTA CGA GCT TCC TGA CG - 3´
Reverse 5´ - GGG CAG TGA TCT CTT TCT GC - 3´
GAPDH: Forward 5´- AGATGGTGAAGGTCGGAGTG – 3 ´
Reverse 5´- GAAGGTCAATGAAGGGGTCA – 3´
ID1:
Forward 5´- ACTCTCAACGGCGAAATCGG – 3´
Reverse 5´- AGCACTTATTCCTCTCGCCC – 3´
ID2:
Forward 5´- CGACATCAGCATCCTGTCCTT – 3´
Reverse 5´- AGAGCCTGTGGATTTGTTGTT – 3´
Número de
identificación del
RTprimerDB
Secuencias de sonda
Localización e identidad
de modificaciones
Fabricante de los
oligonucleótidos
Método de purificación
Protocolo de qPCR
Condiciones completas
de reacción
D
No presentan
D
E
No se utilizó sonda
D
Invitrogen Argentina
D
Desalados
E
Volumen de reacción y
cantidad de cDNA/DNA
Concentración de
primers, (sonda), Mg2+
E
Las reacciones de PCR fueron realizadas en un
termociclador CFX96 (Bio-rad) en un volumen final de
20 ul conteniendo 5 ul de cDNA dilución 1/10, 10 ul de
SYBR Green Master Mix 2X (Bio-rad), 2 ul de la mix de
primer (500 nM) y 3 ul de agua grado PCR. La reacción
de PCR fue iniciada con una incubación de 1 minuto a
95°C, seguida de 50 ciclos de 95°C por 15 segundos,
58°C durante 30 segundos y 72°C por 30 segundos. Se
incluyó para todos los casos un paso adicional para el
análisis de curva de melting. Se incluyó controles
negativos sin muestra para descartar contaminación
de los reactivos. La eficiencia de amplificación y el
coeficiente de correlación de la curva estándar de
cada gen se determinó empleando 5 diluciones 1/2 de
un ADNc estándar a partir de una dilución inicial de
1/20. Todas las reacciones fueron realizadas por
duplicado.
Volumen de reacción: 20 ul; cantidad de cDNA: 5 ul de
una dilución 1/10
500 nM Primers; 3 mM MgCl2; 0,2 mM dNTP
E
y dNTPs
Concentración e
identidad de la
Polimerasa
Identidad de buffer/kit y
fabricantes respectivos
Composición química
exacta del buffer
Aditivos (SYBR Green I,
DMSO, etc.)
Fabricante de
placas/tubos y número
de catálogo
E
Hot start iTaq DNA polimerasa provista en la mix de
reacción iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, 1708880)
E
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, 1708880)
D
Indicada por el fabricante iQ SYBR Green Supermix
(Bio-Rad, 1708880)
SYBR® Green I Nucleic Acid Gel Stain (Invitrogen)
E
D
-
Parámetros de
termociclación completa
E
Setup de la reacción
(manual/robótico)
Fabricante de los
instrumentos de qPCR
Validación de la qPCR
Evidencia de
optimización (de
gradiente)
D
Especificidad (gel,
secuencia, fusión o
digestión)
E
Para SYBR Green I, Cq
del NTC
E
Curvas de calibración
con pendiente e
intersección y
E
Eficiencia de la PCR
calculada a partir de la
curva
E
- Placas 96 well: Low profile 96-well unskirted plates
with clear wells (x 25 unid) (MLL-9601, Bio-rad)
- Film óptico: Microseal B adhesive seals, optically
clear (MSB-1001, Bio-rad)
Desnaturalización inicial: 95°C por 1 minuto, luego 50
ciclos a 95°C durante 15 segundos, 58°C durante 30
segundos y a 72°C por 30 segundos
Manual
E
CFX96 Real-Time PCR Detection System (Catalog. 1855096, Bio-Rad)
D
Se analizó la eficiencia de amplificación de los
cebadores en un gradiente de 54-62°C, mediante PCR
convencional. La temperatura óptima de anealing
seleccionada fue de 58°C.
Análisis de curvas de melting, en rampa desde 60°C a
95°C en 23 minutes, donde la fluorescencia es medida
continuamente. La amplificación específica del gen fue
confirmada por una banda única en electroforesis en
gel de agarosa 1,5% teñido con Syber Safe. Los
controles sin molde (sin cDNA en la PCR) fueron
corridos para cada gen para detectar amplificación
inespecífica y dimerización de primers. Los fragmentos
amplificados fueron clonados y secuenciados para
verificar la identidad.
La señal de amplificación fue muy tardía (Cq>38) y por
lo tanto hubo una gran diferencia entre los valores de
Cq del control negativo y todas las muestras de cDNA.
ACTINA: y = -3.33x + 15.893;
GAPDH: y = -3.45x + 29.735
ID1: y = -3.35x + 28.753;
ID2: y = -3.33x + 31.573;
ACTINA: y = 99,6%
GAPDH: 97,4%
ID1: y = 98,8%
ID2: y = 99,6%
CIs para eficiencia de
PCR o SE
r2 de la curva de
calibración
D
Rango dinámico lineal
E
Variación del Cq en el
LOD
CIs a través del rango
Para multiplex,
eficiencia y LOD de cada
ensayo
Análisis de datos
Programa de análisis de
qPCR (orígen, versión)
Método de
determinación del Cq
E
Identificación de outliers
y disposición
Resultados para NTCs
Justificación del número
y elección de los genes
de referencia
Descripción del método
de normalización
Número y concordancia
de las réplicas biológicas
Número y estadio de las
replicas técnicas
(transcripción reversa o
qPCR)
Repetitibilidad
(variación intraensayo)
Reproducibilidad
(variación interensayo,
CV)
Power análisis?
E
E
ACTINA: 0,907
GAPDH: 0,983
ID1: 0,986
ID2: y 0,907
En promedio, el rango dinámico lineal fue considerado
tomando en cuenta la linealidad de las curvas
estándar, con diluciones seriadas 1/2 del cDNA desde
10-2 a 10-6.
D
E
N/A
E
Software Bio-Rad CFX Manager 2.1 (2.1.1022.0523)
E
El método para la determinación de la linea de
cuantificación (Cq) se determinó empleando el setting
manual del Software Bio-Rad CFX Manager 2.1
(2.1.1022.0523)
No hubo outliers
E
E
E
La señal de amplificación fue muy tardía (Cq>38)
Los genes de referencia se seleccionaron en base a lo
descripto en la literatura. Fueron verificados usando el
cálculo del M y CV
-delta_delta_Ct
D
3 réplicas biológicas
E
Todas las reacciones de qPCR fueron realizadas por
duplicado y repetida 2 veces.
E
Desviación estándar de los duplicados: 0,1 – 0,3/0,5
D
D
Métodos estadísticos
para significancia de los
resultados
E
Software (orígen,
versión)
Publicación de los Cq o
datos crudos con RDML
E
D
La expresión relativa de los ARNm de los genes
analizados para la muestra control y tratada fueron
analizadas mediante el método comparativo de
análisis del t-student. Una probabilidad <0,05 fue
considerada estadìsticamenente diferente.
Sigma Stat 3.5 (3.5.0.54)