Download Tests genéticos más simples en humanos con la - Mi portal

En busca de tests genéticos más simples: el HRM
Joaquín Royo Cárcamo
Dpto. Biología Celular y Genética. Universidad de Alcalá
Muchas veces habremos leído que un gen causa una cierta enfermedad. En
realidad lo correcto sería decir que el causante es una variante de ese gen, por lo general
debido a que funciona de modo defectuoso. A las variantes de los genes se les llama
alelos y el objetivo de los tests genéticos es determinar si entre las dos copias de cada
gen que cada uno tenemos nos ha tocado en suerte cargar con algún alelo que pueda
causar problemas. Como estos tests suelen tener que hacerse en muchos individuos
siempre se busca a la hora de diseñarlos compatibilizar la fiabilidad con el uso de
técnicas simples y económicas. Aquí vamos a presentar la conocida como análisis por
HRM (“High-Resolution Melting”) que utilizamos en nuestro grupo del Departamento
de Biología Celular y Genética de la UAH en un aparato RotorGeneQ (Qiagen).
El HRM se basa en que el DNA está formado por dos cadenas (por eso se dice
que es un dúplex) unidas por enlaces cuya fuerza depende de su secuencia. Recordemos
que hay cuatro componentes en el DNA: A, G, C y T, que pueden aparecer en cualquier
orden (la secuencia de ese DNA) pero que siempre se unen mediante enlaces de A o G
en una cadena con T o C, respectivamente, en la otra. Esos enlaces pueden romperse
simplemente subiendo la temperatura hasta unos 90-95ºC, entonces las cadenas se
separan por completo y se dice que el DNA está desnaturalizado. Si luego bajamos la
temperatura podrán volver a unirse las cadenas para tornar al dúplex de partida: el DNA
ha renaturalizado. En el HRM se sube poco a poco la temperatura mientras se mide con
precisión el proceso de desnaturalización que tiene lugar. Al calentar aparecen pequeñas
burbujas entre las cadenas que con el aumento de temperatura van creciendo y
juntándose hasta acabar separándolas por completo. Por tanto, la proporción de zona
desnaturalizada en cada molécula aumentará al subir la temperatura y lo importante es
que el modo en que eso ocurra variará con su secuencia. Para poder seguir el proceso de
desnaturalización mientras tiene lugar se añade a la muestra un compuesto de los
conocidos como fluróforos, que cuando se iluminan con luz de un determinado color
son capaces de emitir luz de otro diferente (fluorescen). Los fluróforos empleados en
HRM sólo se unen al DNA dúplex y sólo así unidos emiten una intensa fluorescencia.
En consecuencia, a medida que avance el proceso de desnaturalización serán menores el
número de esas moléculas unidas al DNA y la fluorescencia que produzcan.
Para usar la técnica del HRM hay que empezar por separar el gen que nos interesa
de los otros miles del genoma. Para eso sirve el PCR, una técnica de uso corriente en los
laboratorios de biología molecular que nos permite no sólo encontrar la aguja del gen en
el pajar del genoma sino también producir muchas copias de ella. Con el PCR se
amplifica una pequeña región (alrededor de 100 pb) en torno a un punto donde difieran
los alelos a reconocer, basta con que contenga un único cambio en la secuencia de
nucleótidos: lo que se conoce como un SNP. Todas las moléculas obtenidas en el PCR,
en el que ya se incluye el fluoróforo que servirá luego para seguir el HRM, serán iguales
si el individuo portaba únicamente un alelo, es decir, si era homocigótico, pero de dos
tipos diferentes si el individuo tenía dos alelos distintos, era heterocigótico. A
continuación se someten las muestras a un ciclo rápido de desnaturalización y
renaturalización de modo que nada cambia con las procedentes de individuos
homocigóticos. Pero en las de un heterocigoto aparecerá, aparte de los dos tipos
preexistentes de moléculas correspondientes a cada alelo, un tercero nuevo formado por
una cadena de un alelo y otra del otro: un heterodúplex. Recordemos que en este
heterodúplex habrá una posición, la correspondiente al SNP, en la que la secuencia de
ambas hebras será diferente: eso afectará bastante a su comportamiento en el HRM.
Se pasa entonces al HRM ya anteriormente descrito. Es importante destacar, por
tratarse de una de las grandes ventajas de esta técnica, que todo el proceso, desde el
PCR hasta el HRM, tiene lugar ininterrumpidamente dentro de la misma máquina y en
los mismos tubos, lo que agiliza el proceso y evita errores o contaminaciones.
Convenientemente procesadas por un programa informático, las gráficas de cambio de
fluorescencia con la temperatura tendrán formas claramente diferentes para el caso de
moléculas procedentes de ambos alelos o del heterodúplex que surge de un individuo
heterocigoto. El análisis se facilita notablemente si se incluyen muestras control que
contengan cada uno de los alelos del gen que se quieren identificar y con las que
comparar los resultados. En nuestro aparato pueden analizarse de esta forma hasta 100
muestras simultáneamente en menos de 3 horas.
Como demostración de su potencial hemos empleado esta técnica para determinar
la presencia del alelo normal o del Leyden del factor V de coagulación sanguínea y del
alelo normal o del 20210G>A de la protrombina (ambos factores de riesgo para la
trombosis venosa) en muestras obtenidas en prácticas de laboratorio de las licenciaturas
de Medicina y Biología de la UAH (Fig. 1). También hemos comprobado que las
muestras control correspondiente a cada alelo pueden obtenerse desde DNA clonado en
bacterias mediante técnicas convencionales de ingeniería genética, lo que permite
disponer de cantidades ilimitadas de cualquier alelo, por raro que sea en la población a
analizar. Indicar por último que el HRM se puede usar no sólo en tests genéticos sino
también para localizar dónde está una mutación en el genoma o para identificar regiones
metiladas relacionadas con fenómenos epigenéticos.
SNP
WT
G
C
WT
A
T
m
G
T
heterodúplex
m
het
Fig. 1 Resultado de un análisis de HRM en que se puede distinguir claramente el
comportamiento del DNA procedente de individuos homocigotos (WT y m) y
heterocigotos (het) para los alelos normal y mutante de la protrombina. Las muestras
control para cada caso son las trazadas con líneas de puntos, el resto vienen de
individuos humanos. El heterocigoto identificado en este análisis está señalado con una
punta de flecha. En el esquema se muestra el SNP que distingue ambos alelos y la
distorsión en el heterodúplex obtenido tras la desnaturalización/renaturalización del
producto del PCR en un individuo heterocigoto.