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LA ACETILACIÓN DE CROMATINA Y LA EXPRESIÓN DE
GENES DEPENDIENTES DE CREB EN LA PATOLOGÍA DE LA
ENFERMEDAD DE HUNTINGTON
Investigador principal:
Dr. Angel Luis Barco Guerrero
Institut de Neurociències UMH
Duración: 3 años
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1. Resumen
La enfermedad de Huntington (EH) es un desorden neurodegenerativo
heredable originado por una extensión del trinucleótido CAG en la secuencia
codificante del gen de la huntingtina (Htt). Estudios recientes indican que
una característica importante de esta enfermedad es la desregulación
transcripcional, que podría estar originada por el secuestro de la proteína
CBP (CREB-binding protein) en los agregados intracelulares de Htt mutante
(mHtt). CBP desempeña un papel doble en transcripción, como coactivador
transcripcional de distintos factores de transcripción, incluyendo CREB, y
como acetil-transferasa de histonas (HAT). La relevancia de esta segunda
actividad en la patología de la EH se ha puesto de manifiesto en diversos
estudios que demuestran que la acetilación de histonas está reducida en
modelos de la enfermedad y que el tratamiento con inhibidores de
deacetilasas de histonas (HDACi) reduce la patología.
El objetivo de este proyecto era investigar la contribución de la
desregulación de la expresión génica dependiente de CREB, y de la
reducción de CBP y de la acetilación de la cromatina en la patología de la
EH, así como evaluar el potencial terapéutico de distintos mecanismos
compensatorios de la reducción de actividad HAT.
2. Resultados
a. La expresión génica dependiente de CREB, neurodegeneración y
EH
El análisis interdisciplinar de ratones modificados genéticamente con niveles
alterados de actividad CREB (bien con un exceso o una reducción de la
misma) llevado a cabo por nuestro grupo, ha demostrado que el control
temporal preciso de la expresión génica dependiente de CREB es un
requerimiento esencial para la viabilidad neuronal y que cualquier
desequilibrio en esta cascada de transducción de señales puede dar lugar a
un proceso neurodegenerativo (Jancic et al., 2009; Lopez de Armentia et
al., 2007). Para avanzar más en esta línea de investigación y explorar las
2
conexiones entre la neurodegeneración causada por cambios en CREB y la
EH, una enfermedad previamente vinculada a la desregulación de CREB,
comparamos los perfiles de expresión génica observados en mutantes CREB
con los obtenidos en modelos murinos de EH. Nuestro análisis reveló una
coincidencia relativamente pequeña entre ambas condiciones (Valor et al.,
2010). Los cambios comunes a ambos tipos de mutantes incluían dianas
directas de CREB, tales como c-fos y prodinorfina. Nuestros resultados en
mutantes de CREB tienen otra implicación importante para la EH, ya que
demuestran los peligros asociados a una manipulación prolongada de esta
cascada de transducción de señales, lo que había sido propuesto con
anterioridad como posible estrategia terapéutica para la EH.
b. CBP y acetilación de histonas en modelos celulares y murinos de
la EH
Nuestro análisis exhaustivo del estado de acetilación de histonas en
distintos modelos de la EH ha demostrado, tanto in vitro como in vivo, que
la expresión de mHtt en neuronas no conlleva necesariamente un cambio en
el estado global de acetilación de las histonas nucleosomales. Por otra
parte, hemos generado y caracterizado ratones en los cuales hemos
eliminado la actividad acetil-transferasa de histonas de CBP específicamente
en neuronas posmitóticas del cerebro anterior y hemos observado que la
pérdida de CBP causa una reducción dramática de la acetilación de histonas,
particularmente de las histonas H2A y H2B. Sorprendentemente, estos
animales no muestran ninguna pérdida aparente de neuronas incluso 8
meses después de la eliminación de CBP (Valor et al., 2011). Estos
resultados indican que la relación entre acetilación de histonas y
neurodegeración es más compleja de lo que pensábamos y abre la
posibilidad de que los efectos beneficiosos de los HDACi no se deban a su
acción sobre las histonas, sino sobre sustratos no histónicos, como factores
de transcripción y proteínas del citoesqueleto.
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c. Reducción de la patología de la EH mediante el incremento de la
acetilación de histonas
Hemos utilizado 3 estrategias distintas para examinar el efecto de un
aumento de la acetilación de histonas en el modelo murino de la EH N171HD82Q:
1. Tratamiento farmacológico con el HDACi butirato sódico: distintas
concentraciones de este compuesto fueron administradas a grupos de
ratones N171-HD82Q y controles hermanos de camada, mediante su
adición al agua, en comida líquida o inyectados intraperitonealmente.
Posteriormente, evaluamos el nivel de acetilación global de las histonas
nucleosomales en muestras procedentes de distintas regiones del cerebro
relevantes en la EH a distintos tiempos después de iniciarse el tratamiento,
en los que no observamos cambios globales. Esta línea de investigación
sigue en desarrollo. Para complementar estos estudios, también
examinamos el efecto de este compuesto en la fisiología de neuronas
hipocampales en cortes de cerebro de ratón. Observamos que el butirato
sódico potencia la fase tardía de la LTP, pero no tiene ningún efecto en la
transmisión sináptica, la excitabilidad neuronal y las propiedades intrínsecas
de las neuronas.
2. Exposición a largo plazo al enriquecimiento ambiental (EA): en el
paradigma de EA, los animales se mantienen en jaulas de gran tamaño con
juguetes y estímulos varios en lugar de permanecer en las convencionales
jaulas de laboratorio. Un estudio reciente por un colaborador del grupo ha
demostrado que el EA aumenta el nivel de acetilación de las histonas en el
hipocampo de manera global, lo cual podría dar lugar a una reducción de la
patología en un modelo murino de la enfermedad de Alzheimer (Fischer et
al., 2007, Nature 447, 178-182). Para comprobar si un fenómeno similar
podría también tener lugar en el caso de la patología de la EH, examinamos
el impacto del EA en ratones N171-HD82Q. Seguimos la evolución de la
patología mediante distintos ensayos durante las 12 semanas de
tratamiento y observamos que el EA causó un retraso en la evolución de los
síntomas, como los temblores, y la muerte del animal, aunque otros
síntomas como la pérdida de peso y la aparición de agregados no fueron
alterados por este tratamiento. La interacción entre EA y EH bien podría
tener lugar a nivel transcripcional, ya que hemos observado en un estudio
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paralelo que el EA induce una fuerte y bien definida respuesta
transcripcional que incluye la sobreexpresión de varios genes importantes
para la supervivencia neuronal (Lopez-Atalaya et al., remitido para su
publicación).
3. Aumento mediante técnicas genéticas de la actividad HAT: esta tercera y
ambiciosa estrategia está aún desarrollándose. Hemos diseñado en el
contexto de este proyecto dos estrategias para sobreexpresar la actividad
HAT y consiguientemente aumentar el nivel de acetilación de las histonas
neuronales, tanto in vitro como in vivo: transgénesis y transducción con
lentivirus de una construcción que codifica una proteína de fusión entre el
dominio HAT de CBP, la proteína fluorescente GFP y una señal de
localización nuclear. La evaluación de la eficacia de estas estrategias está
en marcha.
d. Patología cerebelar en la EH
La caracterización de alteraciones neuropatológicas en el cerebro de ratones
N171-HD82Q ha proporcionado un hallazgo interesante que no estaba
previsto en el plan original. En estos ratones hay una expresión muy fuerte
de mHtt en el cerebelo, primero en la capa de células de Purkinje y
después en la capa granular, que correlaciona con la progresión de los
síntomas. Aunque en general se considera que la patología cerebelar tiene
un papel menor en la EH, la atrofia del cerebelo es una característica clave
de las formas de EH de inicio muy temprano. Por lo tanto, la investigación
en ratones N171-HD82Q puede ser especialmente importante para entender
esta variante, relativamente rara, de la enfermedad. Es más, dado que
algunas ataxias cerebelo-espinales afectan principalmente al cerebelo y
están también originadas en una extensión de poliglutaminas (en genes
distintos de la Htt), los hallazgos en esta línea de investigación pueden
resultar también relevantes para esas enfermedades. Por todo ello, hemos
decidido explorar en más detalle los cambios en el cerebelo de ratones
realizando experimentos con micromatrices de DNA cuyo análisis sigue en
marcha.
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3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados
finales obtenidos
La ejecución de este proyecto ha proporcionado nuevos datos que resultan
de gran importancia para entender la etiología de la EH y los fundamentos
de nuevas terapias experimentales. Pueden ser, por tanto, de gran
relevancia para los miles de familias que sufren esta devastadora
enfermedad neurodegenerativa. Hemos abordado la reciente hipótesis que
propone que cambios epigenéticos en la cromatina desempeñan un papel en
neurodegeneración y que drogas que afectan el balance entre la acetilación
y la deacetilación de histonas tiene un gran potencial neuroprotector y
neurorrestaurador. Nuestros resultados indican que la relación entre
acetilación de histonas y neurodegeneración es más complejo de lo
esbozado en estudios recientes, ya que no existe una relación directa entre
la deficiencia en CBP y la hipoacetilación de histonas neuronales y la
neurodegeneración. Nuestros experimentos han revelado que la acetilación
global de histonas no está afectada en algunos modelos de la EH y
demostrado que la reducción severa del estado de acetilación no conlleva la
muerte neuronal. Estas observaciones exigen una revisión de la hipótesis
epigenética de la EH y abren la posibilidad de que las dianas terapéuticas de
los HDACi no sean histonas, sino otro tipo de proteínas, como factores de
transcripción o proteínas del citoesqueleto. Además, las herramientas
genéticas generadas en el contexto de este proyecto serán esenciales en
estudios futuros para examinar la eficacia de manipular el estado de
acetilación de proteínas en el tratamiento de la EH.
4. Publicaciones
Barco A, Lopez de Armentia M and Alarcon JM.
Synapse-specific stabilization of plasticity processes: The synaptic tagging
hypothesis revisited ten years later.
Neurosci Biobehav Rev. 32(4):831-51. Factor d’impacte 2009 (IF): 7,8.
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Viosca J, Lopez de Armentia M, Jancic D and Barco A (2009).
Enhanced CREB-dependent gene expression increases the excitability of
neurons in the basal amygdala and primes the consolidation of contextual
and cued fear memory.
Learn Mem 16(3): 193-197. IF: 4,1.
Viosca J, Malleret G, Bourtchouladze R, Benito E, Vronskava S, Kandel ER
and Barco A (2009).
Chronic enhancement of CREB activity in the hippocampus interferes with
the retrieval of spatial information.
Learn Mem 16(3): 198-209. IF: 4,1.
Jancic D, Lopez de Armentia M, Valor LM, Olivares R and Barco A (2009).
Inhibition of cAMP-response element binding protein reduces neuronal
excitability and plasticity, and triggers neurodegeneration.
Cerebral Cortex 19(11): 2535-47. IF: 7,0.
Viosca J, Schuhmacher A, Guerra and Barco A (2009).
Germ line expression of H-RasG12V causes neurological deficits associated
to Costello syndrome.
Genes Brain Behav 8(1): 60-71. IF: 3,8.
Sanchis-Segura C, Lopez-Atalaya JP and Barco A (2009).
Selective boosting of transcriptional and behavioral responses to drugs of
abuse by histone deacetylase inhibition.
Neuropsychopharmacology 34(13):2642-54. IF: 7,0.
Benito E and Barco A (2010).
CREB's control of intrinsic and synaptic plasticity: Implications for CREBdependent memory models.
Trends Neurosci 33(5): 230-40. IF: 12,8.
7
Valor LM, Jancic D, Lujan R and Barco A (2010).
Ultrastructural and transcriptional profiling of neuropathological
misregulation of cAMP-response element binding protein function.
Cell Death Differ 17(10):1636-44. IF: 8,2.
Valor LM and Barco A (2010).
Hippocampal gene profiling: Toward a systems biology of the hippocampus.
Hippocampus. Nov 15, disponible on-line. IF: 3,9.
Valor LM, Pulopulos MM, Jimenez-Minchan M, Olivares R, Lutz B and Barco A
(2011).
Ablation of CBP in forebrain principal neurons causes modest memory and
transcriptional defects and a dramatic reduction of histone acetylation, but
does not affect cell viability.
J Neurosci 31(5): 1652-63. IF: 7,2.
Lopez-Atalaya JP, Ciccarelli A, Viosca J, Jimenez-Minchan M, Canals S.,
Giustteto M and Barco A.
CBP is required for environmental enrichment-induced neurogenesis and
cognitive enhancement. (Remitido.)
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