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Fitopatología Molecular
Curso 2012
BIOLOGÍA MOLECULAR DE
BACTERIAS FITOPATOGÉNICAS
Sumario
Interacciones planta-bacteria
La planta y su sistema defensivo
Bacterias fitopatógenas
Regulación de factores de virulencia
Estrategias para desarrollar resistencia a
bacterias mediante ingeniería genética
- Genes de resistencia
- Quorum quenching
Referencias
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Interacciones planta-bacteria
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Interacciones
planta-bacteria
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Eventos de señalización
que regulan la interacción planta-bacteria
Modificado de: Keen, Nat. Biotechnol., 1999.
La interacción
planta-bacteria
no siempre
determina el
desarrollo de
una enfermedad
• No se produce enfermedad cuando:
- La planta atacada no puede proveer los requerimientos
. necesarios para la multiplicación del patógeno (resistencia
. de no-hospedante)
- La planta posee defensas estructurales o bioquímicas
. preformadas. Sólo los patógenos especializados
. completan una infección exitosa
- Se gatillan los mecanismos defensivos inducibles de la
. planta y el patógeno resulta restringido en la zona inicial
. de la infección (resistencia específica)
- Las condiciones externas cambian y el patógeno muere
. antes de llegar a una etapa en que la infección es
. irreversible
• Se produce enfermedad cuando:
- Las condiciones externas son desfavorables
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
- Las defensas preformadas son inadecuadas
- La planta no detecta al patógeno y por ende no se producen
. respuestas defensivas inducidas (o se producen tardíamente)
La especificidad
del patógeno
bacteriano y de
los genes de
resistencia de
la planta
determinan
diferentes tipos
de interacción
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Agrios, Plant Pathology, 1997.
El modelo gen
por gen explica
los casos de
compatibilidad de
incompatibilidad
planta-patógeno
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
El modelo de resistencia “gen por gen” (Flor, ca. 1940)
Modificado de: Keen, Ann. Rev. of Gen., 1990.
Para que exista resistencia (incompatibilidad) se requiere un gen Avr
del patógeno y un gen R de la planta, ambos dominantes. En presencia
de los alelos recesivos ocurre la enfermedad (compatibilidad)
La planta y su sistema defensivo
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
El sistema inmune en plantas
1) Inmunidad inducida por moléculas asociadas al patógeno (PTI):
Receptores de membrana (PRRs) que reconocen MAMPS o PAMPs. Ej.
Flagelina.
2) Inmunidad inducida por efectores del patógeno (ETI):
-Directo reconocimiento a través de NB-LRR proteínas (R)
ETI es una respuesta tipo PTI pero acelerada y amplificada que induce
resistencia y en general HR
Modelo de zigzag que cuantifica la respuesta de defensa
Jones and Dangl, 2006 nature. 444: 323
Localización
de proteínas
de resistencia
y esquema
de sus
dominios
funcionales
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.
Modelo de interacción proteína R/factor de avirulencia:
hipótesis de la “proteína guardiana”
Interacción
Adaptado de: Loh et al., Curr. Opin. in Biotechnol., 2002.
La planta y su sistema defensivo
Respuesta Hipersensible (HR) y Resistencia Sistémica Adquirida (SAR)
en el sistema de genes RPS2-avrRPt2/RPM1-avrRPM1
Adaptado de: Mackey et al., Cell, 2003.
Las respuestas
defensivas
inducibles por
patógenos
comprenden
diversos
mecanismos
moleculares
Procesos defensivos inmediatos, locales y sistémicos
comprendidos en una respuesta inducible
Adaptado de: Lamb et al., Ann. Rev. of Plant Physiol. and Plant Mol. Biol., 1997.
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Respuesta
defensiva
- Engrosamiento de la pared celular
- Inducción de genes involucrados en la síntesis
de metabolitos secundarios
- Síntesis de tioninas
- Síntesis de proteínas relacionadas con la defensa
a patógenos
- Síntesis de ácido salicilico
Inducción de Resistencia
Sistémica Adquirida (SAR)
Genes involucrados en resistencia local a patógenos
Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.
Genes involucrados en resistencia sistémica a patógenos
Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.
Elicitor
Detection
Linear β 1-3 glucan
Necrotrophic
pathogen
Jasmonic
acid
Ethylene
Flagellin
Biotrophic
pathogen
Salicylic
acid
Biotroph resistance
Necrotroph resistance
Biotroph susceptibility
PDF 1.2
PR 1
Necrotroph susceptibility
Las Bacterias y los PAMPs (pathogenassociated molecular pattern) Inducen el cierre
estomático
Bacterias fitopatogenas
Bacterias y PAMPs
Bacterias fitopatógenas
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Las TOP 10
bacterias
Fitopatógena
s segun MPP
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.
Pseudomonas syringae pv.
tomato
Mansfield et al., Mol Plant Pathol.
2012 Aug;13(6):614-629.
Ralstonia solanacearum
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.
Agrobacterium tumefaciens
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.
Xanthomonas oryzae (oryzae)
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.
Xanthomonas campestris pathovars
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.
XANTHOMONAS AXONOPODIS
Xanthomonas axonopodis pv. manihotis
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.
Infección por
Xanthomonas
axonopodis
(cancro de
los cítricos)
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Daniels. IRL Press, 1993.
Síntomas de cancrosis en fruto, hoja y ramas de un Citrus.
Erwinia amylovora
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 ;13(:614-629.
http://www.atlasplantpathogenicbacteria.it/Erwini
a%20amylovora.pdf
Xylella fastidiosa
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.
Dickeya (dadantii and solani))
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.
Pectobacterium carotovorum (and P.
atrosepticum)
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.
Esquema de
una bacteria
fitopatógena
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Principales componentes de la ultraestructura
de una bacteria fitopatógena típica
Adaptado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
Bacterias fitopatógenas
Microscopía
electrónica
de una
célula de
Xhantomonas
con un flagelo
polar
500
nm
Microscopía
electrónica
de una
célula de
Pseudomonas
con flagelos
lofotricos
Microscopía electrónica de barrido de células
de Pseudomas syringae adheridas a la
superficie de un fruto de peral. Pueden
observarse las fimbrias que sirven como
elementos de unión.
Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
Ciclo biológico
de una bacteria
fitopatógena
con fase epífita
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
Bacterias fitopatógenas observadas al microscopio de barrido
Ingreso y dispersión de fitobacterias por aperturas naturales
2 m
Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
Microscopía de barrido de la superficie
del envés de una hoja de peral.
Se observan numerosas bacterias
colonizandola cavidad subestomática
Tomado de: Agrios, Plant pathology, 1997.
Pseudomonas syringae pv. morsprunorum exudando
de los estomatas de hojas de cerezo infectadas
Micrografías de bacterias fitopatógenas
La mayor parte de las bacterias fitopatógenas se acumula
en el espacio extracelular o en el tejido vascular
A
B
A
B
Tomado de: Agrios, Plant pathology, 1997.
Microscopía electrónica de Xanthomonas
campestris colonizando una hoja
de Brassica. Las bacterias están
generalmente rodeadas de un polisacárido
extracelular (EPS) y proliferan en estrecho
contacto con las paredes celulares (CW)
Microscopía electrónica de una sección longitudinal (A)
y transversal (B) de Pseudomonas syringae pv tabaci
en el espacio intercelular del mesófilode hojas de tabaco.
Factores bacterianos requeridos
para la patogenicidad
FITOTOXINAS
SIDEROFOROS
EXOPOLISACARIDOS
GENES
BACTERIA
EXOENZIMAS
hrp
FITOHORMONAS
BACTERIOCINAS
Genes hrp
Büttner D, Bonas U EMBO J. 2002 Oct 15;21(20):5313-22.
Genes hrp
Büttner D, Bonas U EMBO J. 2002 Oct 15;21(20):5313-22.
Conocidos efectores de Xanthomonas y otros fitopatogenos
Sabine Kay and Ulla Bonas. Current Opinion in Microbiology 2009, 12:37–43
Sabine Kay and Ulla Bonas. Current Opinion in Microbiology 2009, 12:37–43
Código de unión al ADN de los efectores TAL
Heidi Scholze and Jens Boch. 2010. Virulence 1:5, 428-432
Las Bacterias y los PAMPs (pathogenassociated molecular pattern) Inducen el cierre
estomático
Fitotoxinas producidas por Pseudomonas spp
Bender et al., MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS,1999, p. 266–292
Los estomas entonces….
-Las células guardianas pueden percibir a las bacterias y para ello el
receptor FLS2
-Para evitar la respuesta inmune que involucra a las células guardianas la
bacteria produce factores de virulencia específicos que le permiten reabrir
los estomas como una estrategia importante de patogenicidad.
-Los estomas, como parte de un sistema inmune integral, actúan como
barreras de infecciones bacterianas.
Síntomas de algunas enfermedades bacterianas
Infección de tubérculos de papa
por Streptomyces scabies (escaras)
Infección de tubérculos de papa por Erwinia
carotovora subsp. atroséptica (podredumbre blanda)
Tomado de: Scnaad et al. APS Press, 2001.
Regulación de factores de virulencia
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Un gran número
de bacterias
Gram– se
comunican
sintetizando,
secretando y
respondiendo a
compuestos
difusibles
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Quorum sensing
• Mecanismo de comunicación comunitario detectado
. para diversas especies de bacterias
• Capacidad de los microorganismos de percibir y
. responder a la densidad poblacional a través de la
. producción de moléculas difusibles de reducido peso
. molecular
Moléculas señal: acil-homoserin lactonas (AHSLs)
El incremento de una población bacteriana determina una
elevada concentración de factores difusibles
Regulación génica dependiente de la densidad poblacional
Modificado de: Fuqua et al., Curr. Opin. in Microbiol. 1998.
El mecanismo
de quorum
sensing es
mediado por
moleculas
difusibles
como las acilhomoserin
lactonas
Modelo simplificado de la transducción
de señales en quorum sensing
Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Célula bacteriana: proteína I (azul), responsable de la síntesis de las señales
difusibles de acil-homoserin lactona (A-HSL; óvalos verdes). La proteína R
(rojo), sufre un cambio conformacional cuando se une a la señal A-HSL; actúa
entonces como regulador transcripcional, alterando su afinidad por secuencias
promotoras específicas de los genes regulados por HSLs (“lux” box) .
Componentes
de la red
sensorial de
regulación
en Ralstonia
solanacearum
Regulación de factores de virulencia
en Ralstonia solanacearum
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Modificado de: Scel, Annu. Rev. Phytopathol.,2000.
Otros sistemas de regulación de virulencia en bacterias
Regulación en Xanthomonas campestris
Gentileza de J. Maxwell Dow
Baja densidad celular
No/bajo DSF
RpfC
H-HisK
D-Rec RpfF
RpfG D-Rec
HD-GYP
Alta densidad celular
DSF
RpfC
H-HisK
HPt
D-Rec
H
H-HPt
DSF
RpfF
RpfG D-Rec
HD-GYP
Baja produccion de DSF
Autoinduccion de DSF sintesis
No sintesis de factores de virulencia
De
Factores de virulencia
RpfG
D-
Rec
HD-GYP
Degradación enzimática
Reduce los niveles de di-GMP cíclico
di-GMP Cíclico
Formación o dispersión
de Biofilm
di-GMP Cíclico
Sínthesis de enzimas extracelulares ,
síntesis de EPS
Formación de biofilm
Motility
Ryan et al 2006. PNAS 103: 1123-1134.
Estrategias para desarrollar resistencia
a bacterias mediante ingeniería genética
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
La expresión del gen BS2 en tomate confiere
resistencia a Xanthomonas campestris pv vesicatoria
Transgénico BS2
Crecimiento bacteriano [log ufc/cm2)]
Control
Tomado de: Tai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999.
Días después de la inoculación
Xcv (+ avrBS2)
Xcv (+ avrBS2)
Transformación
de arroz
con el gen
de resistencia
Xa21
control
transgénicas
control
transgénicas
Resistencia a la
infección de
Xanthomonas oryzae pv.
oryzae en plantas
transformadas con el
gen Xa21
A: cultivar Minghui 63-12
B: cultivar IR72-82
C
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Zhang et al., Nature Biotech. 2000.
La interferencia
de la
comunicación
entre bacterias
es una posible
estrategia
de resistencia
antimicrobiana
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Posibles blancos y estrategias para interferir en la
comunicación entre bacterias (quorum quenching)
Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.
Mecanismos que afectan la regulación
mediada por homoserin lactonas
Enzimas degradadoras de A- HSLs
Organismo
Variovax paradoxus
Bacillus sp. 240B1
Molécula
Función
Actividad aminoacilasa
DegradaA-HSLs
A-HSLs lactonasa
Gen aiiA
Degrada A-HSLs
Moléculas imitadoras de las A- HSLs
Delisea pulchra
Furanonas halogenadas
Se unen a receptores de A-HSLs
Inhibenquorum sensing
Plantas superiores
(arroz, arveja, etc)
Diferentes compuestos
Afectan sistema de quorum
sensing
Organismos A-HSLs oportunistas
Salmonella enterica
(patógeno humano)
Homólogos de proteína Lux-R
Noproducen A- HSLs
Reconocen las A -HSLs
producidas por otros org.
Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.
Transformación de plantas de papa con el gen
de acil homoserin lactonasa (aiiA) de Bacillus spp.
Cortes transversales de tubérculos de papa
inoculados con Erwinia carotovora.
A la izquierda: tubérculo de planta no transformada.
A la derecha: tubérculo de planta transformada con el
gen aiiA.
Inoculación de hojas con Erwinia carotovora SCG1.
Arriba: hojas de plantas de tabaco transformadas con el gen aiiA
Abajo: hojas de plantas de tabaco control no transformadas
Tomado de: Dong et al., Nature, 2001.
Las plantas
que expresan
N-acil-homo
serin lactona
exhiben
mayor
resistencia
a Erwinia
carotovora
A
B
A: detalle de una hoja
de una planta
transgénica infectada
con Erwinia carotovora
B: hoja de una planta
luego de la infección
Porcentajes de
infección observados
para dos líneas
transgénicas (barras
verde y anaranjada) y
de una planta control,
no transgénica (barra
violeta).
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Mae et al., MPMI, 2001.
Referencias
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Carmona, M.J., Molina, A., Fernández, J.A., López-Fando, J. J. and
García Olmedo, F. Expression of the thionin gene from barley in tobacco
confers enhanced resistance to bacterial pathogens. The Plant Journal,
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De Gray, G., Rajasekaran, K., Smith, F., Sanford, J. and Daniell, H.
Expression of an antimicrobial peptide via the chloroplast genome to
control phytopathogenic bacteria and fungi. Plant Physiology, 127:852862, 2001.
Dong, Y.H., Wang, L.H., Xu, J.L., Zhang, H.B. and Zhang, L.H.
Quenching quorum-sensing-dependent bacterial Infection by an N-acyl
homoserine lactonase. Nature, 411:813-817, 2001.
Fray, R.G. Altering Plant-Microbe interactions through artificially
manipulating bacterial Quorum-sensing. Annals of Botany, 89:245-248,
2002.
Loh, J., Pierson, E.A., Pierson, L.S., Stacey, G. and Chatterjee, A.
Quorum sensing in plant-associated bacteria. Current Opinion in Plant
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Mae, A., Montesano, M., Koiv, M. and Palva, E.T. Transgenic Plants
producing the bacterial pheromone N-acyl-homoserine lactone exhibit
enhanced resistance to the bacterial phytopathogen Erwinia carotovora.
Molecular Plant-Microbe Interactions, 14:1035-1042, 2001.
Tai, T.H., Dahlbeck, D., Clark, E.T., Gajiwala, P., Pasion, R., Whalen,
M.C., Stall, R.E. and Staskawicz, B.J. Expression of the Bs2 pepper
gene confers resistance to bacterial spot disease in tomato. Proceedings
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