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ANEXO:
Fundamentos Biológicos
Se desarrollará en este apartado unas nociones de biológica molecular básica
necesarias para la comprensión del funcionamiento de las construcciones que se
detallarán más adelante.
Comenzaré por incluir unas definiciones de los entes partícipes y las relaciones que se
crean entre ellos. Tras esto, haremos un estudio de las cinéticas de las reacciones
intervinientes.
Este anexo pretende servir de base para aquellos cuyas nociones de la biología
molecular no son suficientes, y están extraídos del libro Biología, de Curtis [12].
ANEXO: Fundamentos Biológicos
I
II
ANEXO: Fundamentos Biológicos
Contenido del Anexo:
1. Definiciones de Entes Biológicos ............................................................................... V
2. La expresión genética ............................................................................................. VIII
Dogma Central de la Biología Molecular ................................................................ VIII
3. La regulación de la expresión genética ..................................................................... X
Operón ....................................................................................................................... X
Fago Lambda.............................................................................................................. X
4. Otras reacciones biológicas ...................................................................................... XI
Proteólisis ................................................................................................................. XI
ARN Antisentido ....................................................................................................... XI
5. Cinéticas Enzimáticas ............................................................................................. XIII
Michaelis-Menten .................................................................................................. XIII
Inhibición enzimática............................................................................................... XV
Cinéticas no Michaelianas ..................................................................................... XVII
ANEXO: Fundamentos Biológicos
III
IV
ANEXO: Fundamentos Biológicos
1. Definiciones de Entes Biológicos
Proteína
Compuesto orgánico complejo constituido por una o más
cadenas polipeptídicas, cada una formada por muchos (100 o
más) aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.
Enzima
Molécula de proteína globular que acelera una reacción química específica. Son
proteínas con la capacidad de manipular a otras moléculas.
Proteasa
Son enzimas que pueden romper los enlaces de las cadenas de polipéptidos. Sirven para
controlar el nivel de proteínas no deseadas. El proceso por el que estas enzimas
realizan la digestión de las proteínas, se conoce como Proteolisis.
ADN (Ácido Desoxirribonucleico)
El portador de la información genética en las células,
compuesto por dos cadenas complementarias de nucleótidos
enrolladas en una doble hélice, capaz de autorreplicarse y de
dirigir la síntesis de RNA.
ARN (Ácido Ribonucleico)
Clase de ácidos nucleicos caracterizada por la presencia del
azúcar ribosa y la pirimidina uracilo; incluye ARNm, ARNt y
ARNr. El ARN es el material genético de muchos virus.
ARN Mensajero (ARNm)
Un tipo de moléculas de ARN, cada una de las cuales es complementaria de una hebra
de ARN. Lleva la información genética del cromosoma a los ribosomas, donde se
traduce a proteína.
ARN de Transferencia (ARNt)
Clase de ARN pequeños con dos sitios funcionales; uno reconoce un aminoácido
específico activado; el otro lleva el triplete de nucleótidos (anticodón) para ese
aminoácido. Cada tipo de ARNt acepta un aminoácido activado específico y lo
transfiere a una cadena polipeptídica naciente, según lo especifica la secuencia de
nucleótidos del ARNm que está siendo traducido.
ANEXO: Fundamentos Biológicos
V
ARN Ribosómico (ARNr)
Tipo de molécula de ARN que se encuentra junto con proteínas características en los
ribosomas; se transcribe a partir del ADN de los bucles de cromatina que forman el
nucléolo.
ARN Antisentido (ARNas)
Un ARNm antisentido es complementario a un ARNm endógeno. Su función es la de
bloquear la expresión de un gen, ya que se adhiere al ARNm y no permite que este
pueda ser traducido.
Ribosoma
Organela pequeña compuesta por proteína y ácido ribonucleico; sitio de traducción en
la síntesis de proteínas; en las células eucarióticas, unido frecuentemente al retículo
endoplásmico.
Gen
Molécula de DNA que desempeña una función específica, tal como codificar una
molécula de RNA o un polipéptido.
Cromosoma
La estructura que lleva los genes. Los
cromosomas
eucarióticos
son
filamentos o bastones de cromatina
que aparecen contraídos durante la
mitosis y la meiosis y que en otros momentos están contenidos
en un núcleo. Los cromosomas procarióticos consisten en un
círculo de ADN con el que se asocian varias proteínas.
Operón
Unidad de expresión y regulación de genes bacterianos. En el cromosoma bacteriano,
un segmento de ADN que consiste en un promotor, un operador y un grupo de genes
estructurales adyacentes que codifican para proteínas involucradas en una vía
metabólica. Los genes estructurales se transcriben en una sola molécula de ARNm y su
transcripción es regulada por una proteína represora.
VI
ANEXO: Fundamentos Biológicos
Promotor
Segmento específico de ADN al cual se une la ARN polimerasa para iniciar la
transcripción del ARNm desde un operón.
Represor
En genética, una proteína que se une al operador impidiendo que la ARN polimerasa se
una al promotor y transcriba los genes estructurales del operón; lo codifica un gen
conocido como regulador.
Plásmido
En los procariotas, una molécula de ADN circular, pequeña,
extracromosómica, de replicación independiente.
Procariota
Célula que carece de núcleo y orgánelas limitadas por
membrana.
Bacteria Escherichia Coli (E. Coli)
Organismo procariota, sin núcleo celular definido,
perteneciente al género de las enterobacterias. Fue descrita
por primera vez en 1885 por Theodore von Escherich, y es
probablemente el organismo más estudiado.
ANEXO: Fundamentos Biológicos
VII
2. La expresión genética
La expresión genética y su regulación es la idea en la que se basa nuestro dispositivo y
por tanto será preciso definirla y profundizar en los agentes que intervienen además
de los mecanismos que nos hará posible controlarla y modificarla.
Dogma Central de la Biología Molecular
Se describe mediante un proceso de dos etapas,
transcripción y traducción. De esta manera es como se
transforma el código genético en la proteína que
recoge.
La información que almacena una cadena de ADN se
divide en genes. Un gen codificador de proteínas
consiste en un promotor (secuencia de pares de bases
que especifica donde debe comenzar la transcripción), seguido de la secuencia de
codificación de la proteína (secuencia codificante de la proteína) y de un terminador
(secuencia que especifica el final de la transcripción).
Fig. Esquema de la estructura de un gen
La Transcripción es la síntesis de una copia de ARN a partir de un segmento de ADN. El
ARN se sintetiza mediante la enzima ARN polimerasa. Cuando la enzima encuentra un
promotor, recorre la cadena del gen, a medida que crea una cola tras de si con el
código ya transcrito. A la molécula de ARN que se crea tras esta etapa se llama ARN
mensajero (ARNm). Finalmente, la molécula formada se separa del ADN al encontrarse
un una secuencia terminadora
La Traducción es la síntesis de la cadena de polipéptidos (proteína) especificado en el
ARNm. Cuando el ARN mensajero encuentra un ribosoma, éste lo recorre y sitúa los
polipéptidos necesarios de acuerdo a la secuencia que lee. Finalmente, se separan el
ARNm y el ribosoma tras crearse la proteína correspondiente.
VIII
ANEXO: Fundamentos Biológicos
Hay que destacar que, aunque cada molécula nombrada tiene una vida, tras la
traducción, la molécula de ARNm está de nuevo disponible para realizar una nueva
copia si, eventualmente, se encontrase con un ribosoma. Al igual ocurre con el
ribosoma.
ANEXO: Fundamentos Biológicos
IX
3. La regulación de la expresión genética
Los mecanismos naturales de los que hacemos uso para poder controlar la expresión
de proteínas se basan en la represión o inhibición, e inducción.
La represión genética es el mecanismo por el que se inhibe la transcripción de un
promotor y de su secuencia génica. Esto ocurre de varias maneras en la naturaleza, sin
embargo, en nuestro caso, la forma de conseguir tal objetivo es obstaculizando
físicamente la unión primera entre el promotor y la enzima transcriptora.
La inducción por tanto, se refiere al mecanismo contrario. Un agente, normalmente
una enzima, elimina la barrera posible entre el promotor y la ARN polimerasa.
Mientras la represión inhibe la transcripción, es la inducción a través de un inductor, la
que la reactiva.
El tipo de regulación natural que dará lugar a nuestro esquema es el de Operón.
Operón
Los genes estructurales del operón codifican un grupo de proteínas funcionalmente
relacionadas. La transcripción es controlada por secuencias en el promotor y en el
operador, adyacentes a los genes estructurales y capaces de unir proteínas específicas.
El promotor contiene una posición de unión para la ARN polimerasa. El operador es el
sitio de unión para un represor, proteína codificada por otro gen, el regulador. Cuando
el represor se une a la molécula de ADN en el sitio operador, la ARN polimerasa no
puede iniciar la transcripción del ARNm. Cuando el represor no está presente, la ARN
polimerasa puede unirse y comenzar su movimiento a lo largo del cromosoma,
permitiendo que ocurra la transcripción y la síntesis de proteínas.
El Operón Lac Será el operón específico con el que trabajamos. Fue el primer operón
en ser estudiado y comprendido. En la bacteria Escherichia Coli es requerido para el
transporte y metabolismo de la lactosa.
Fago Lambda
Los fagos son virus que afectan únicamente a las bacterias. En nuestro caso, usamos un
mecanismo del fago lambda, ya que éste virus afecta la bacteria Escherichia Coli, y
produce una proteína represora llamada cI. Se conoce como proteína lambda dado su
origen. el represor actúa como inhibidor de la transcripción insertándose en un sitio
específico del genoma.
X
ANEXO: Fundamentos Biológicos
4. Otras reacciones biológicas
Durante el desarrollo del documento, aparecen otros procesos biológicos que no
pertenecen propiamente a la regulación genética. Estas son las siguientes.
Proteólisis
Los procesos por proteólisis contemplan las degradaciones de proteínas mediante
enzimas específicas llamadas proteasas. La digestión intracelular, se produce cuando
una proteasa se encuentra con la proteína.
ARN Antisentido
Una hebra complementaria de un ARNm permite la inhibición de la molécula de ARNm
a la que es análoga. El ARN antisentido se “aparea” con su ARNm complementario
formando una molécula de doble hebra que puede no traducirse y termina
degradándose enzimáticamente.
Para comprender mejor el efecto de un ARN antisentido, incluyo una breve
explicación:
El ADN está compuesto de una serie de módulos, llamadas bases. Hay 4 tipos de bases
nitrogenadas: adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T), que se colocarán una
tras otras en una determinada disposición. Una cadena de ADN se asocia con otra
cadena de ADN complementaria formando uniones entre parejas de bases. Las
uniones posibles son: Citosina-Guanina y Adenina-Timina y viceversa, Guanina-Citosina
y Timina-Adenina. De esta manera se forman las cadenas de doble hélice (una por cada
cadena de ADN) de pares de bases (uniones C↔G, A↔T).
Cuando ocurre la transcripción, la doble hélice se “abre” habilitando la lectura de una
de las cadenas de ADN. A medida que la ARN polimerasa comienza a leer la cadena, va
creando una cola con la misma cadena transcrita. Al terminar, el segmento formado se
llama ARN mensajero. La terminología usada (transcripción, ARN mensajero) hace
referencia lo siguiente. Una cadena de ARN no tiene las mismas bases o nucleótidos
que el ADN, sino que usa en vez de la Timina (T) el Uracilo (U). Cuando la ARNp crea su
cola, las ribonucleótidos son los complementarios uno a uno, es decir, C↔G, A↔U
ANEXO: Fundamentos Biológicos
XI
Si una cadena de ADN fuese algo así
A-C-G-T-C-A-A-C-C-T-T
La cadena de ARN mensajero será
U-G-C-A-G-U-U-G-G-A-A
U-G-C-A-G-U-U-G-G-A-A
Entendido esto, un ARN antisentido es
A-C-G-U-C-A-A-C-C-U-U
precisamente el complementario de la
cadena de ARN. Fíjese que es igual que la cadena de ADN primera excepto porque
aparece el U de uracilo en vez de la T de timina.
Así, se consigue que la cadena de ARN mensajera no pueda ser leída ni traducida.
XII
ANEXO: Fundamentos Biológicos
5. Cinéticas Enzimáticas
Michaelis-Menten
Estas cinéticas fueron estudiadas por Leonor Michaelis y Maude Menten, que crearon
modelos que ajustaban la velocidad de acción de estos procesos.
Lejos de querer hacer un estudio de la cinética enzimática, expondré brevemente el
mecanismo que reproducen las reacciones inherentes en nuestro sistema.
Las enzimas catalizan las reacciones para las que se existen específicamente. Para que
pueda operar necesita de un sustrato, con el que se una, para generar productos. Una
vez se completa, la enzima queda liberada para servir de catalizador a otros sustratos.
Haciendo un símil con un proceso ingenieril, las enzimas actúan como agentes
nucleantes al igual que lo hacen las impurezas o paredes del recipiente durante la
solidificación de materiales fundidos. Ofrecen un sitio donde la energía necesaria para
continuar esa etapa es menor.
La cinética de Michaelis-Menten proporciona el siguiente planteamiento.
𝑘1 𝑘2
𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆 → 𝐸 + 𝑃
𝑘−1
Esta ecuación no contempla la reversión del paso del complejo a producto. Esta
suposición no es crítica y simplifica mucho la formulación del producto:
𝑑[𝐸𝑆]
= 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝐸𝑆 − 𝑟𝑜𝑡𝑢𝑟𝑎 − 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜
𝑑𝑡
𝑑[𝐸𝑆]
= (𝑘1 · ([𝐸𝑡 ] − [𝐸𝑆]) · [𝑆]) − 𝑘−1 [𝐸𝑆] − 𝑘2 [𝐸𝑆]
𝑑𝑡
Asumiendo régimen permanente,
𝑑[𝐸𝑆]
=0 →
𝑑𝑡
[𝐸𝑆] =
𝑘1 · ([𝐸𝑡 ] − [𝐸𝑆]) · [𝑆] = 𝑘−1 [𝐸𝑆] + 𝑘2 [𝐸𝑆]
𝑘1 [𝐸𝑡 ][𝑆]
𝑘1 [𝑆] + 𝑘−1 + 𝑘2
ANEXO: Fundamentos Biológicos
[𝐸𝑆] =
[𝐸𝑡 ][𝑆]
[𝑆] + 𝐾𝑚
XIII
Así podemos calcular la producción de producto como:
𝑣=
𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝐾𝑚 + [𝑆]
𝐾𝑚 =
𝑘2 + 𝑘−1
𝑘1
Cinética de Michaelis-Menten
Vmax
1
V
V
0.8
Vmax/2
0.6
0.4
0.2
Km
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
[S]
Ecuación de Michaelis-Menten, una ecuación de velocidad para reacciones enzimáticas
de sustrato único. La constante de Michaelis K m se define como la concentración a la
que la velocidad de reacción es la mitad de la V max .
𝐾𝑚
= 𝑇𝑖𝑒𝑛𝑒 𝑢𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜. 𝑆𝑒 𝑒𝑣𝑎𝑙ú𝑎 𝑎 𝑙𝑎 𝑚𝑖𝑡𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑉𝑚𝑎𝑥
𝑉𝑚𝑎𝑥
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛
= 𝑈𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 �
� . 𝑉𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑚á𝑥𝑖𝑚𝑎 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑
𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜
XIV
ANEXO: Fundamentos Biológicos
Inhibición enzimática
Explicado anteriormente en los apartados de Regulación génica y Operón, es el
mecanismo por el que controlamos la expresión génica o más concretamente la acción
enzimática, se produce ha través de la inhibición.
Los inhibidores pueden clasificarse en 2 grupos funcionales:
-
Irreversibles
-
Reversibles: competitivos y no competitivos
Atendiendo a las características de la regulación génica del operón Lac, nuestro
estudio debe situarse dentro de los reversibles y competitivos ya que el inhibidor se
une con la enzima. Esto tiene un significado en las cinéticas de Michaelis-Menten vistas
anteriormente.
Comencemos estudiando las reacciones que se producen:
En la imagen se aprecia como la unión entre enzima e inhibidor no
permite al sustrato adherirse, cortando así la transformación del
sustrato en producto.
Esto provoca una variación en la constante llamada de Michaelis K m .
𝑣=
𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
[𝑆] + 𝐾𝑚 �1 +
[𝐼]
𝐾𝑖 �
Vemos como el término que lleva ahora adosada la constante 𝐾𝑚 es la unidad en el
caso de que no haya inhibidor, y como su presencia provoca un aumento aparente del
valor de la contante de Michaelis.
ANEXO: Fundamentos Biológicos
XV
Cinética de Michaelis-Menten con Inhibición
Vmax
1
Michaelis-Menten sin Inhibición
V
0.8
Michaelis-Menten con Inhibición
0.6
0.4
0.2
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
[S]
XVI
ANEXO: Fundamentos Biológicos
Cinéticas no Michaelianas
Se le da este nombre a un tipo de reacciones enzimáticas que dan lugar a unas curvas
con trazado sigmoideo, provocado por el concepto de cooperatividad y alosterismo.
Los primeros estudios que se realizaron de las proteínas cooperativas los realizo Hill en
1910. La idea que subyace tras la cooperatividad es la unión de varias enzimas para
realizar la inhibición e implica una ralentización del proceso.
De nuevo sucede lo mismo que en el apartado anterior, se modifica la constante de
Michaelis. Sin embargo, Hill plantea un nuevo modelo muy parecido al de las cinéticas
enzimáticas comunes.
La reacción de unión:
𝐸 + 𝑆1 → 𝐶1 + 𝑆2 → ⋯ → 𝐸 + 𝑃
𝐸 + 𝑛𝑆 → 𝐸𝑆𝑛 → 𝐸 + 𝑃
Sea la reacción de cooperatividad, donde la cinética por ella expresada es:
𝑣=
El trazado de esta curva es la siguiente:
𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]𝑛
𝐾𝐻 + [𝑆]𝑛
Cinética enzimática cooperativa
1
Cooperatividad Positiva
V
Michaelis-Menten
0.8
Cooperatividad Negativa
0.6
0.4
0.2
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
[S]
En la imagen se puede observar la variación respecto a la cinética de MichaelisMenten. Además podemos identificar dos estados diferentes:
ANEXO: Fundamentos Biológicos
XVII
Cooperatividad positiva: la unión al sustrato es más fácil medida que se acerca la
enzima a la saturación. La evolución de este comportamiento es sigmoidal
Cooperatividad negativa: la unión al sustrato es más difícil a medida que la enzima
satura. La evolución es hiperbólica.
XVIII
ANEXO: Fundamentos Biológicos