Download tgf-beta para mejorar la recuperacion de las neuronas.

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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kInt. Cl. : A61K 38/00
11 Número de publicación:
2 133 333
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ESPAÑA
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 92925330.0
kFecha de presentación : 20.11.92
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 625 050
kFecha de publicación de la solicitud: 23.11.94
T3
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54 Tı́tulo: TGF-beta para mejorar la recuperación de las neuronas.
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73 Titular/es: GENENTECH, INC.
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72 Inventor/es: Gluckman, Peter;
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74 Agente: Ponti Sales, Adelaida
30 Prioridad: 22.11.91 NZ 240696
460 Point San Bruno Boulevard
South San Francisco California 94080, US
AUCKLAND UNISERVICES LIMITED
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.09.99
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 133 333 T3
16.09.99
Aviso:
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Nikolics, Karoly y
Williams, Christopher
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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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ES 2 133 333 T3
DESCRIPCION
TGF-beta para mejorar la recuperación de las
neuronas.
Campo de la invención
Esta invención hace referencia al tratamiento
o prevención de lesiones en el sistema nervioso
central (SNC) y hace referencia en particular al
tratamiento que comprende el incremento de la
concentración del factor de crecimiento beta 1
transformador (TGF-β1) y/o análogos del mismo
en el sistema nervioso central del paciente para
tratar una lesión o enfermedad que cause daños
en las células del SNC, en particular las células
neuronales no colinérgicas y/o las células gliales.
Antecedentes de la invención
Después de agresiones por asfixia, traumáticas, tóxicas, degenerativas, metabólicas, isquémicas o hipóxicas al sistema nervioso central
(SNC) del hombre, puede darse como resultado
un cierto grado de lesión neural. Por ejemplo,
dicha lesión neural puede tener lugar en casos de
asfixia perinatal asociada con sufrimiento fetal intraparto como tras desprendimiento de placenta,
oclusión del cordón umbilical o asociado con retraso del crecimiento uterino; asfixia perinatal
asociada con fallo de la resucitación adecuada
o apnea; lesiones neurales severas asociadas con
un percance de ahogamiento de sumersión, inhalación de monóxido de carbono, intoxicación por
amonı́aco gaseoso u otros gases, paro cardı́aco,
colapso, coma, meningitis, hipoglucemia, o estado epiléptico; episodios de asfixia cerebral asociada con cirugı́a de derivación coronaria; anoxia
o isquemia cerebral asociada con ataque súbito,
episodios de hipotensión, crisis de hipertensión;
trauma cerebral; o enfermedades degenerativas
cerebrales como la enfermedad de Alzheimer y la
esclerosis múltiple.
Dicho daño neural puede implicar diferentes
tipos celulares del SNC. Por ejemplo, leucomalacia periventricular, una lesión que afecta los oligodendrocitos periventriculares considerada generalmente como una consecuencia de lesión hipoxicisquémica al cerebro pretérmino. Bejar, y col.,
Am. J. Obstet. Gynecol., 159:357-363 (1988);
Sinha, y col., Arch. Dis. Child., 65:1017-1020
(1990); Young, y col., Ann. Neurol., 12: 445448 (1982). Además, los cuerpos celulares de las
neuronas colinérgicas están ausentes en muchas
regiones del córtex de los primates (Mesulam, y
col., Neurosci., 12:669-686 (1984)) y ratas (Brownstein, y col., en Handbook of Chemical Neuroanatomy, Classical Transmitters in the CNS, pág.
23-53 (Elsevier, 1984)). El daño en la corteza
cerebral por trauma, asfixia, isquemia, toxinas o
infección es frecuente y puede causar déficits sensoriales, motores o cognitivos. En el SNC, las
células gliales, que no son células neuronales, son
necesarias para la función normal del SNC. Los
infartos son un componente principal del daño
inducido por isquemia hipóxica y la pérdida de
células gliales es un componente esencial del infarto. La esclerosis múltiple está asociada con la
pérdida de mielina y oligodendrocitos, de modo
similar, la enfermedad de Parkinson está asociada
con la pérdida de neuronas dopaminérgicas. Se ha
publicado que diversos factores de crecimiento se
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inducen después de la isquemia hipóxica transitoria en el cerebro. Después de las convulsiones
postasfixia, el proto-oncogen c-fos se induce en las
neuronas supervivientes y en las células gliales en
las regiones infartadas. Gunn, y col., Brain Res.,
S31: 105-116 (1991). La sı́ntesis del factor de
crecimiento nervioso(NGF) se incrementa tras la
hipoxia o tras convulsiones en el hipocampo y en
la corteza cerebral. Lorez, y col., Neurosci. Lett.,
98:339-344 (1989); Gall y col., Science, 245:758761 (1989). Sin embargo, se conoce poco el papel
de las citocinas en la lesión cerebral. Se ha demostrado que las células gliales producen varias
citocinas incluyendo la interleucina 3 (IL-3) y la
interleucina 6 (IL-6). Se ha publicado que la interleucina 1 (IL-1) aumenta en el lı́quido cefalorraquı́deo después de un traumatismo craneal en
el hombre. McClai, y col., J. Lab. Clin. Med.,
110:48-54 (1987).
El factor de crecimiento beta transformador
(TGF-β) es otro ejemplo de una citocina y es
un polipéptido multifuncional implicado en la regulación de la respuesta celular o tisular frente
a una lesión o estrés. Para una revisión general de TGF-β y sus acciones, ver Sporn, y col.,
Science, 233:532-534 (1986); Sporn y col., J. Cell
Biol., 105:1039-1045 (1987); Sporn, y col., Nature,
3232: 217-219 (1988); y Sporn, y col., en Peptide
Growth Factors and Their Receptors I, pág. 419472 (Springer-Verlag, 1990). El TGF-β se halla
en diversos tejidos animales, como el hueso, las
plaquetas y la placenta; y se han descrito los procedimientos para la purificación del polipéptido
a partir de dichas fuentes naturales, ası́ como
también para su producción en cultivo de células
recombinantes. Ver, por ejemplo, Assoian, y col.,
J. Biol. Chem., 258:7155-7160 (1983); Frolik, y
col., Proc. Nat. Acad. Sci., 80:3676-3680 (1983);
Heimark, y col., Science, 233: 1078-1080 (1986);
Sporn, y col., patente americana U.S. 5.104.977;
Derynck, y col., Nature, 316:701-∗ ∗ ∗(1985); Derynck, y col., patente americana U.S. 4.886.747.
Existen diversas formas moleculares de TGFβ, incluyendo aquellas formas comúnmente referidas como TGF-β1 (Derinck, y col., Nature,
316:701-∗ ∗ ∗(1985)), TGF-β2 (deMartin, y col.,
EMBO J., 3673-∗∗∗(1987); Madison, y col., DNA,
7:1-8 (1988)), TGF-β3 (Jakowlew, y col., Mol.
Endocrin., 2:747-755 (1988); Ten Dijke, y col.,
Proc. Nat. Acad. Sci., 85:4715-4719 (1988); Derynck, y col., EMBO J., 7:3737-∗ ∗ ∗(1988)), TGFβ4 (Jakowlew, y col., Mol. Endocrin. 2:11861195 (1988) y TGF-β5 (Kondaiah, y col., J. Biol.
Chem., 265:1089-∗ ∗ ∗(1990).
Es un objetivo de la invención proporcionar
un tratamiento o una prevención del daño o lesión
del SNC. La invención se basa en la investigación
sobre el papel y los efectos del TGF-β en el SNC,
llevada a cabo con éxito por los inventores.
La patente internacional WO91/02067 describe la utilización de un grupo de citocinas que
incluyen el TGFβ1 para regular la expresión del
NGF in vitro en el cultivo de astrocitos e in vivo
en el cerebro de ratas, con el objetivo de tratar
diversos trastornos neurológicos.
Resumen de la invención
Según ello, la invención proporciona en un
primer aspecto la utilización de TGF-β1 o un
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análogo de TGF-β1 activo biológicamente en la
preparación de un medicamento para el tratamiento de lesiones del sistema nervioso central en
donde la lesión afecta a las células neuronales no
colinérgicas y/o las células gliales.
El término “tratar” cuando se utiliza aquı́
hace referencia al efecto de una reducción en la
gravedad del daño al SNC, mediante la reducción
del infarto y la pérdida de células gliales, células
neuronales no colinérgicas, u otras células neuronales, padecido después de una lesión en el SNC.
Abarca la minimización de dicho daño tras una
agresión al SNC.
Preferentemente, el TGF-β1 y/o análogos de
éste son para la administración directa al paciente. Alternativamente, puede utilizarse un
compuesto, que tras la administración al paciente,
incremente la concentración activa de TGF-β1 o
la de los análogos que tienen lugar de forma natural del TGF-β1 en el SNC del paciente. Por ejemplo, se pueden administrar las proteı́nas de unión
al TGF-β1 de regulación positiva, o los análogos
de éste que tienen lugar de forma natural.
Preferentemente, las composiciones farmacéuticas descritas aquı́ son para la administración
durante el periodo que abarca desde el momento
de la agresión a 100 horas después del daño en
el SNC y más preferentemente de 0,5 a 8 horas
después de la agresión en el SNC.
En una realización de la invención, dicho
TGF-β1 y/o un análogo o análogos de éste se
administran mediante inyección cerebro ventricular lateral en el cerebro de un paciente durante
el periodo que incluye desde el momento que se
produce el daño en el SNC a 8 horas más tarde.
En otra realización, el TGF-β1 y/o un análogo
o análogos de éste se administran a través de una
derivación en el ventrı́culo cerebral de un paciente
durante el periodo que incluye desde el momento
que se produce la agresión en el SNC a 8 horas
más tarde.
En otra realización, el TGF-β1 y/o un análogo
o análogos de éste se administran de forma periférica en un paciente para pasar al ventrı́culo
lateral del cerebro durante el periodo que incluye
desde el momento que se produce la agresión en
el SNC a 8 horas más tarde. Preferentemente,
es el propio TGF-β1 el que se administra mediante inyección al ventrı́culo cerebral lateral o
mediante la utilización de la desviación insertada
quirúrgicamente.
Preferentemente, las composiciones farmacéuticas se administran de acuerdo con el patrón del
daño o tiempo transcurrido después de la agresión
producida en el SNC.
Preferentemente, la dosificación varı́a desde
aproximadamente 0,0001 a 100 µg de TGF-β1 o
dicho análogo o dicho compuesto que incrementa
la concentración de éste por cada 100 gramos de
peso corporal.
El TGF-β1 puede utilizarse sólo o en combinación con otros agentes terapéuticos, que incluyen otros factores de crecimiento diseñados para
mejorar frente a la pérdida de células del SNC
como glias y neuronas no colinérgicas.
Por “prevenir” se entiende una reducción de
la gravedad del daño del SNC sufrido después de
una agresión en el SNC y puede incluso incluir la
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inhibición de los sı́ntomas del daño en el SNC.
En otra realización, la invención proporciona
la utilización de TGF-β1 o un análogo de TGFβ1 activo biológicamente en la preparación de
un medicamento para el tratamiento de la lesión
en el sistema nervioso central en donde la lesión
afecta las células neuronales no colinérgicas y/o
las células gliales y en donde el medicamento comprende adicionalmente el IGF-1.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra dibujos compuestos que
ilustran la distribución del ARNm del TGF-β1
tras la hipoxia isquémica para el Ejemplo 1.
La Figura 2 es un histograma que ilustra
la pérdida neuronal para las ratas tratadas con
TGF-β1 y ratas control en el Ejemplo 2.
La Figura 3 es un histograma que ilustra
la pérdida neuronal para las ratas tratadas con
TGF-β1 y ratas control en el Ejemplo 3.
Descripción de las realizaciones preferidas
La invención hace referencia a la utilización
del TGF-β1 o de un análogo del TGF-β1 activo
biológicamente en la preparación de un medicamento para el tratamiento de lesión en el sistema
nervioso central, en donde la lesión afecta a las
células neuronales no colinérgicas y/o células gliales.
Por ejemplo, el paciente puede haber sufrido
una asfixia perinatal o una asfixia cerebral o una
isquemia asociada a un ataque súbito u otros
ejemplos no limitantes de agresiones neurales que
se han descrito más arriba. En estas circunstancias, es deseable reducir o eliminar los sı́ntomas
de daño neural.
El daño en el SNC puede cuantificarse por
ejemplo mediante el nivel de déficit neural permanente de la función cognitiva y/o la propensión de
trastornos convulsivos.
Es deseable que la concentración de TGF-β1
y/o análogos de éste en el sistema nervioso central y en el cerebro del paciente en particular se
incremente con el fin de tratar el daño neural.
Según ello, se puede administrar el TGF-β1 y/o
análogos de éste directamente al paciente. TGFβ1 hace referencia al factor de crecimiento beta1 transformador. Los “Análogos” (o “análogos
activos biológicamente”) de TGF-β1 hacen referencia a los compuestos que ejercen un efecto
biológicamente similar al del TGF-β1 y que incluyen los análogos que se producen de forma natural (p.ej., TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, TGF-β5) o
cualquiera de los análogos sintéticos de TGF-β1.
Estos compuestos pueden derivarse de humanos
u otros animales. El TGF-β1 y los análogos se
pueden purificar a partir de fuentes naturales o
producirse mediante técnicas del ADN recombinante.
Alternativamente, se pueden administrar compuestos que, tras la administración al paciente,
incrementan la concentración activa de TGF-β1
y/o análogos de éste que se producen de forma
natural en el sistema nervioso central. Por “concentración activa” se entiende la concentración
biológica de TGFβ-1 y/o análogos en el sistema nervioso central del paciente para ejercer
un efecto sobre la lesión neural.
El TGF-β1, sus análogos y los compuestos que
aumentan las concentraciones activas de éste se
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pueden administrar de forma central o sistémica.
Deseablemente, las composiciones se administran
directamente al SNC del paciente y en particular
a la región donde haya tenido lugar el daño más
importante. Según ello, las composiciones se administraran directamente al cerebro o al lı́quido
cefalorraquı́deo mediante técnicas que incluyen la
punción ventricular lateral a través de una trepanación o fontanela anterior, lumbar o cisternal
osimilar. Las composiciones también se administran por vı́a intravenosa, intracefalorraquı́dea, intratraqueal o intrasinovial. Además, se pueden
administrar con otros agentes o factores de crecimiento, por ejemplo, el factor de crecimiento
semejante a la insulina 1 (IGF-1).
Para la prevención o el tratamiento de la
lesión del SNC, la dosificación adecuada de TGFβ1 o uno de sus análogos o un compuesto capaz
de aumentar las concentraciones fisiológicas del
TGF-β1, dependerá del tipo de lesión a tratar,
como se definió anteriormente, de la gravedad y
curso del daño, si tales composiciones de TGFβ1 se administran con propósitos preventivos o
terapéuticos, de la terapia previa, de la historia
clı́nica del paciente y la respuesta a las composiciones de TGF-β1 y de la discreción del médico
encargado. Las composiciones de TGF-β1 se administran de modo adecuado al paciente en una
sola vez o durante una serie de tratamientos.
Los ejemplos anteriores muestran que la expresión de TGF-β1 después de una agresión neural sigue un curso temporal especı́fico y tiene lugar en áreas especı́ficas del cuerpo. Según ello, las
composiciones deberı́an administrarse de acuerdo
con el patrón de lesión en el SNC y consiguiente
tiempo transcurrido desde la agresión a fin de producir los resultados más deseables.
Las composiciones pueden administrarse por
ejemplo aproximadamente de las 0,5 a 100 horas después de una agresión. Alternativamente,
la composición puede administrarse antes de una
agresión potencial en el SNC (p.ej., antes de cirugı́a de desviación cardı́aca) a fin de prevenir o
reducir el grado de daño neural sufrido tras la
agresión.
Una dosificación adecuada puede variar, por
ejemplo, aproximadamente de 0,0001 a 100 µg
de TGF-β1 y/o análogos o compuestos que aumentan la concentración de éste por cada 100 g
de peso corporal, siendo la composición administrada por vı́a central.
La invención también proporciona composiciones farmacéuticas para el tratamiento del daño
neural sufrido tras una agresión. Las composiciones farmacéuticas comprenden el TGF-B1
y/o análogos de éste o un compuesto que aumenta la concentración de TGF-β1 en el SNC.
El TGF-β1, sus análogos y los compuestos que
aumentan la concentración de éste se pueden fabricar mediante técnicas de ADN recombinante
como las descritas en la patente americana U.S.
4.886.747. Alternativamente, dichas sustancias se
pueden aislar a partir de fuentes naturales. Opcionalmente, dichas composiciones farmacéuticas
se proporcionan en un vehı́culo o diluyente farmacológicamente adecuado que inherentemente no
es ni tóxico ni terapéutico. Ejemplos de dichos
vehı́culos incluyen intercambiadores iónicos, alu4
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minio, estearato de aluminio, lecitina, proteı́nas
séricas, tal como la albúmina sérica humana,
sustancias tamponantes como las fosfatasas, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas de
glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales, o electrolitos como el sulfato de protamina, el hidrógeno fosfato disódico,
polisacáridos como la celulosa o la metilcelulosa, hidrógeno fosfato potásico, cloruro sódico,
sales de zinc, sı́lice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinil pirrolidona y polietilén glicol. Diluyentes adecuados incluyen soluciones acuosas
estériles que comprenden uno o más de dichos
vehı́culos. El TGF-β1 se formula tı́picamente a
un pH acı́dico en el que es biológicamente activo.
La invención se basa en los siguientes resultados experimentales. En los estudios descritos en
los siguientes ejemplos, se halló que:
1) El ARNm del TGF-β1 se expresa después
de una agresión neural a lo largo de un periodo de
tiempo definido en regiones especı́ficas de la lesión
y el propio TGF-β1 se puede detectar mediante
inmunocitoquı́mica.
2) Las alteraciones en los niveles del sistema
nervioso central del TGF-β1 pueden alterar el resultado neural que se produce como una consecuencia de una agresión neural estandarizada.
3) Dosis inferiores de TGF-β1 mejoran su eficacia en el tratamiento de la lesión neural. Estos
ejemplos, sin embargo, se ofrecen sólo a tı́tulo de
ilustración y no intentan limitar la invención de
ninguna manera. Todas las referencias de patentes y literatura citadas a lo largo de la especificación están expresamente incorporadas.
Ejemplo 1
El objetivo de este estudio fue estudiar la expresión del TGF-β1 en el sistema nervioso central
después de una agresión neural.
Ratas de veintiún dı́as se sometieron a ligación
de carótida unilateral mediante asfixia por inhalación en condiciones definidas para producir una
pérdida neuronal atenuada o severa en el sitio ligado.
Se indujo una pérdida neuronal atenuada o severa en ratas de 21 dı́as de la manera siguiente:
la arteria carótida derecha se ligó bajo anestesia
suave con halotano. Se colocaron en un incubador
a 34◦ C y 85 % de humedad. Los gases inspirados
se reemplazaron por O2 al 8 % en nitrógeno durante 15 minutos (suave) o 90 minutos (severa) y
luego se devolvieron al aire. A diversos momentos después de la hipoxia (1 hora, 5 horas, 3 y 5
dı́as) se anestesiaron los animales con pentobarbitan (Nembutal), se retiraron los cerebros y se
trocearon porcongelación en hielo seco para la hibridación in situ. Para la histologı́a, las ratas se
sacrificaron 5 dı́as después de la hipoxia y luego se
perfusionaron con solución salina al 0,9 % seguido
de formaldehido-ácido acético- metanol (1:1:8).
Las ratas se sacrificaron a tiempos determinados después de la asfixia para la histologı́a. Al
cabo de 90 minutos se determinó mediante tinción
con tionina/ácido fucsı́nico que la pérdida neuronal por asfixia (severa) se habı́a extendido dentro
del córtex ligado. Hubo una pérdida severa de
neuronas en el territorio arterial del cerebro medio, incluyendo el córtex lateral, el hipocampo,
el cuerpo estriado y el tálamo. La hibridación in
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situ histoquı́mica se realizó utilizando una sonda
de ADNc de TGF-β1 que comprende casi totalmente la secuencia codificante de TGF-β1, proporcionada por el Dr. R. Derynck. La hibridación
histoquı́mica se realizó esencialmente como describen McCabe, y col., J. Histochem. Cytochem.,
34:45-50 (1986) y Smith, y col., Ann. Neuropathol., 64:319-332 (1984).
Después de la hibridación, las secciones se lavaron 4 veces en 2xSSC más β-mercaptoetanol
10 mM a temperatura ambiente durante 10 minutos cada vez, 4 veces en 2xSSC a temperatura
ambiente durante 10 minutos cada vez, dos en
2xSSC a 50◦C durante 10 minutos cada vez.
Los controles se realizaron utilizando ARNasa
A (40 µg/ml de NaCl 0,5M/Tris 20 mM, pH 7,5/
EDTA 1 mM a 37◦ C). El pretratamiento con ARNasa elimina casi completamente la señal en las
transferencias de Northern de la banda mayor anticipada de 2,5 Kb revelada con cada sonda.
La señal que resulta para el ARNm del TGFβ1 cuantificada mediante hibridación in situ mostró una inducción del ARNm de TGF-β1 restringida a las áreas de lesión neuronal. Después de asfixia atenuada (15 minutos), se observó inducción
del ARNm de TGF-β1 en el cerebro ligado en el
nivel 3 de la corteza cerebral, la circunvolución
dentada, las regiones CA1 y CA2 de la capa piramidal del hipocampo.
Después de la asfixia severa (90 minutos), el
ARNm del TGF-β1 fue detectable durante una
hora después de la agresión en la circunvolución
dentada del hipocampo, las regiones CA1 y CA2 y
el plexo coroidal. Durante 5 horas fue detectable
en el córtex y cuerpo estriado en el sitio ligado.
Durante 72 horas se observó una expresión marcada a través de la corteza cerebral y puriforme,
del tálamo y del hipocampo del sitio ligado pero
no se observó expresión en el sitio no ligado, en
el que no se observó muerte neuronal (Figura 1).
La especificidad de la inducción se demostró
mediante la expresión unilateral predominantemente en el sitio ligado, menor inducción en animales sometidos a una agresión menor y por los
controles negativos utilizando ARNasa. La sonda
también se utilizó para hibridar una transferencia de Northern de muestras de ARN poli(A) de
hı́gado de rata. Las bandas después de la hibridación con la sonda de TGF-β1 están de acuerdo
con los resultados publicados en la bibliografı́a.
La inmunohistoquı́mica se realizó utilizando
un antisuero policlonal anti-h TGF-β1 de conejo.
Las células teñidas para el TGF-β1 pudieron ser
identificadas en la región dañada del hemisferio
ligado. Esta tinción fue observada en las células
con apariencia semejante a macrófagos.
Los resultados sugieren que tras una agresión
isquémica por hipoxia, se induce TGF-β1 en los
macrófagos, en particular en el área de la lesión.
Ejemplo 2
El objetivo de este estudio fue valorar el efecto
de la administración de TGF-β1 después de una
agresión neural.
Se utilizaron ratas adultas (250-350 gramos).
El experimento implicó el tratamiento de las ratas con TGF-β1 después de una agresión neural.
Estas ratas presentaban una lesión isquémico por
hipoxia en un hemisferio cerebral inducida de una
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manera estándar. Una arteria carótida se ligó y
el animal se sometió dos horas más tarde a un periodo definido de hipoxia inhalacional. El grado
de hipoxia, la duración de la hipoxia, la temperatura ambiente y la humedad se definieron para
estandarizar el grado de lesión. Las condiciones
fueron oxı́geno (6 %) inhalado, 10 minutos de hipoxia a temperatura ambiente de 31◦C y 85 % de
humedad. Los animales se mantuvieron en un incubador durante una hora, luego se devolvieron a
sus jaulas estándares. Se sacrificaron cinco dı́as
más tarde para el análisis histólogico utilizando
tinciones especı́ficas (fucsina ácida) para neuronas necróticas.
En dichos experimentos, la muerte neuronal
tı́pica está restringida al lugar del sitio de la ligación arterial y es principalmente en el hipocampo, circunvolución dentada y córtex lateral
del hemisferio ligado.
Se indujo una lesión por isquemia hipóxica en
ratas Wistar machos adultos (300±10g). Las ratas sufrieron ligación de la carótida unilateral con
anestesia suave por halotano. Después de una
hora de recuperación, se colocaron en un incubador a 31◦C y 85±5 % de humedad durante una
hora antes de la agresión. Se sometieron durante
10 minutos a asfixia inhalacional (FiO2 al 6 %)y
se mantuvieron en el incubador durante una hora
después de la asfixia. Dos horas después de finalizar el ataque inhalacional, se dio una inyección
única cerebroventricular lateral controlada estereotáxicamente de 0,05 µg de TGF-β1 recombinante o lı́quido cefalorraquı́deo artificial (LCF).
El TGF-β1 recombinante o diluyente se preparó y se administró a parejas similares en pesode
la manera siguiente: después de dos horas de asfixia se administró a las ratas una anestesia suave
por halotano, y una inyección única de ICV de
20 µl de CSF (n=6) o 20 µl de CSF más 0,05
µg de TGF-β1 (n=6). El TGF-β1 recombinante
(Genentech, Inc., South San Francisco, California 94080 USA) se disolvió en el diluyente para
CSF a 2,5 µg/ml. Esta solución se diluyó 9 veces
con PBS 0,15 M (solución salina tamponada con
fosfato) proporcionando un pH de 7,0.
Los animales se mantuvieron entonces durante
120 horas, se anestesiaron y los cerebros se fijaron
in situ con formaldehido-ácido acético-metanol
(1:1:8) para valoración histológica.
Las neuronas supervivientes se discriminaron
de las muertas mediante la utilización de una
técnica de tinción con tiocina/fucsina ácida. Williams, y col. Ped. Res., 27: 561-565 (1990);
Brown, y col., J. Neurol. Sci., 16:59-84 (1971).
El grado de lesión neural sufrida se cuantificó mediante cuantificación de la puntuación de
pérdida neuronal. Las puntuaciones de pérdida
neuronal son la media a partir de las regiones susceptibles del hipocampo y corteza cerebral (100 %
equivale a la pérdida total de neuronas, 0 % equivale a pérdida 0).
El porcentaje de neuronas muertas se estimó
mediante dos observadores independientes, uno
de los cuales fue ciego para el experimento. La
correlación entre las puntuaciones obtenidas por
los dos observadores fue de r=0,92 p, 0,0001. El
efecto de tratamiento se evaluó con MANOVA seguido por las comparaciones en series de parejas
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de cada región utilizando el procedimiento de la
diferencia menos significativa de Fisher.
Los resultados se muestran en la Figura 2.
La terapia del TGF-β1 redujo la extensión de la
muerte neuronal en la hemiesfera ligada comparada con los controles tratados con CSF (p<0,01).
Una inyección central única de TGF-β1 después
de una agresión por asfixia en la rata adulta se
asoció con una mejora marcada en el resultado,
valorado histológicamente (Ver Tabla 1).
TABLA 1
Efecto del tratamiento con TGF-β1 sobre el
porcentaje de pérdida neuronal después de
la lesión isquémica-hipóxica (6 grupos;
media±sem)
Región (0,05 µg)
Hipocampo CA1-2
Hipocampo CA3
Hipocampo CA4
Circunvolución
dentada
Córtex piriforme
Córtex lateral
% Pérdida neuronal
tras tratamiento con
CSF (control) TGF-β1
98,4+4
7,6±5
100,0
4,0±4
100,0
0,0
5
10
15
20
25
97,2±3
93,2±7
98,0±2
0,0
0,0
5,0±5
Ejemplo 3
El objetivo de este estudio fue confirmar las observaciones del Ejemplo 2 y establecer el margen
de dosificación más efectivo.
El experimento fue el mismo que el del Ejemplo 2 excepto que dos grupos más se trataron con
dosis elevadas de TGF-β1.
La lesión isquémica-hipóxica se indujo en ratas como se discutió para el Ejemplo 2. Se administró a las ratas (n=6 para cada tratamiento)
CSF, CSF+0,05 µg de TGF-β1, CSF + 0,5 µg
de TGF-β1 o CSF + 5 µg de TGF-β1 dos horas después de la agresión por inhalación. Las
ratas (n=1) de cada tratamiento se trataron simultáneamente. Se utilizaron las misma técnicas
para cuantificar el grado de lesión que las utiliza-
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35
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50
55
60
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6
10
das para el Ejemplo 2.
Los resultados se muestran en la Figura 3.
Como se puede ver, 5 µg de TGF-β1 no tuvieron efecto significativo sobre la pérdida neuronal.
Por otra parte, 0,5 µg de TGF-β1 redujeron la
pérdida neuronal (p<0,05) en la corteza cerebral,
pero 0,05 µg de TGF-β1 fueron significativamente
más efectivos. Efectos similares se observaron en
otras áreas neuronales. Experimentos posteriores
han demostrado que las dosificaciones en el margen de aproximadamente 0,01 µg a 0,05 µg son
más efectivas.
Discusión
Los resultados de los experimentos descritos
anteriormente fueron altamente significativos estadı́sticamente. En los Ejemplos 2 y 3, donde
se administró TGF-β1 post-asfixia, la terapia de
TGF-β1 a dosis inferiores a 0,5 µg/rata mejoró
marcadamente el resultado comparado con los
controles tratados. Por ello concluimos que el aumento terapéutico de TGF-β1 en el lı́quido cefalorraquı́deo cerebral directa o indirectamente
después de una agresión es ventajoso para el resultado. Los resultados en el Ejemplo 3 muestran
además que la mayor eficacia se observa a dosis
pequeñas de TGF-β1.
La presente invención, por ello, reconoce el papel de una administración de TGF-β1 y/o otros
compuestos de efecto similar en un paciente antes de, simultáneamente con, o a continuación de
una agresión en el SNC con el consiguiente resultado de minimizar la lesión del SNC mediante
la prevención de otra lesión subsecuente que de
otra manera podrı́a tener lugar a continuación
del ataque. La invención proporciona los procedimientos y composiciones farmacéuticas para el
tratamiento o para la prevención de lesiones neurales. La lesión neural puede estar asociada con
asfixia, hipoxia, toxinas, isquemia o trauma. Sin
embargo, se comprenderá que la principal aplicación de la invención es para los humanos, la
utilidad de la invención no está por ello limitada
y el tratamiento de los animales no humanos (especialmente mamı́feros) se halla también dentro
del ámbito de la invención.
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REIVINDICACIONES
1. Utilización de TGF-β1 o un análogo activo biológicamente de TGF-β1 en la preparación
de un medicamento para el tratamiento de una
lesión del sistema nervioso central, donde la lesión
afecta las células neuronales no colinérgicas y/o
las células gliales.
2. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, donde la lesión del sistema nervioso central es
una lesión por hipoxia.
3. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, donde la lesión del sistema nervioso central es
una lesión isquémica.
4. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, donde la lesión del sistema nervioso central es
una lesión traumática.
5. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, donde la lesión del sistema nervioso central es
una consecuencia de la enfermedad de Parkinson.
6. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, donde la lesión del sistema nervioso central es
una consecuencia de la esclerosis múltiple.
7. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, donde la lesión del sistema nervioso central es
una consecuencia de un trastorno de desmielinización.
8. Utilización de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, donde el TGF-β1 o el
análogo activo biológicamente de TGF-β1 es para
la administración en el periodo que abarca desde
el momento de producirse la lesión en el sistema
nervioso central hasta 100 horas después.
9. Utilización de acuerdo con las reivindica-
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12
ciones 1 a 7, donde el TGF-β1 o el análogo activo biológicamente de TGF-β1 es para la administración de al menos una vez en el periodo que
abarca desde el momento de producirse la lesión
en el sistema nervioso central hasta aproximadamente las 8 horas siguientes.
10. Utilización de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde el TGF-β1
o un análogo activo biológicamente de TGF-β1
es para la administración al mamı́fero en una
cantidad de aproximadamente 0,0001 a 100 µg
de TGF-β1 por cada 100 g de peso corporal del
mamı́fero.
11. Utilización de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde el análogo
activo biológicamente de TGF-β1 se selecciona
entre el grupo consistente en TGF-β2, TGF-β1,2,
TGF-β3, TGF-β2,3, TGF-β4 y TGF-β5.
12. Utilización de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde el TGF-β1
o el análogo activo biológicamente de TGF-β1
es para la administración al mamı́fero mediante
una desviación insertada quirúrgicamente en el
ventrı́culo del cerebro del mamı́fero.
13. Utilización de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11, donde el TGF-β1 o el
análogo activo biológicamente de TGF-β1 es para
la administración periférica en el mamı́fero para
su paso al ventrı́culo lateral del cerebro.
14. Utilización de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde el medicamento comprende el TGF-β1 o un análogo
biológicamente activo de TGF-β1 en combinación
con IGF-1.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva
del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD
2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación
del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del
7-10-1992, no producirán ningún efecto en España
en la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como tales.
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Esta información no prejuzga que la patente esté o
no incluı́da en la mencionada reserva.
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