Download Clonación de DNA ¿Cómo clonar el genoma humano?

Clonación de DNA
•
Cualquier fragmento de DNA lineal puede clonarse en
un plásmido si los extremos son compatibles
•
Creación de nuevas moléculas: plásmido + DNA foráneo
DNA genómico
Vector
Enzima (s)
de restricción
DNA ligasa
¿Cómo clonar el genoma humano?
•
Objetivo: obtener una colección de fragmentos de todo
el DNA humano (Genoteca genómica)
•
Material:
•
DNA humano
•
Plásmido
•
Enzima de restricción y DNA ligasa
•
Bacterias y placas con antibiótico
Clonación: digestión
•
•
El DNA humano se corta con un enzima de restricción (ej.:
EcoRI))
El DNA plasmídico se corta con el mismo enzima (EcoRI)
DNA humano
Plásmidos
+ EcoRI
+ EcoRI
Fragmentos de
DNA humano con
extremos EcoRI
Clonación: ligación
•
Los fragmentos de DNA humano y las moléculas de plásmido
tienen extremos compatibles (EcoRI): ligación con DNA ligasa
•
Mezcla de plásmidos con DNA humano
AATTCNNN
AATTCNNNNNNNNNNNNNNNNG
NNNG
GNNN
GNNNNNNNNNNNNNNNNCTTAA
NNNCTTAA
+ DNA ligasa
Plásmido con
fragmento 2
Plásmido con
fragmento 1
Plásmido con
fragmento 4
Plásmido con
fragmento 3
Plásmido con
fragmento 5
Clonación: transformación y
amplificación
•
Los plásmidos pueden replicarse en el interior de las
b t i y titienen genes d
bacterias
de resistencia
i t
i a antibióticos:
tibióti
amplificación y selección
Vector
recombinante
E. coli
Antibiótico
Antibiótico
Plásmidos con inserto
idénticos al original:
CLONES
E. coli sin
plásmido no crece
Clonación: genoteca
•
Cada colonia contiene un solo tipo de plásmido con un
trozo de genoma
•
Colección de clones: genoteca
Pasos de la clonación
1. Aislar DNA
•
Tipos de vectores de
clonación:
2. Usar enzimas de
restricción para generar
fragmentos de DNA
Vector
Vector
linearizado
Nuevo huésped
p
3. Separar los fragmentos
de DNA y usarlos para
generar moléculas recombinantes
4. Introducción de la
molécula recombinante
p
en un nuevo huésped
•
Plásmidos (inserto < 10 Kb)
•
Bacteriófagos (inserto < 20 Kb)
•
PACs (inserto ~100 Kb)
•
BACs (inserto ~200 Kb)
•
YACs ((inserto < 2 Mb)) ((sólo en
levaduras)
Identificación de genes con
genotecas
•
La g
gangrena
g
provoca la destrucción del tejido.
j
Clostridium
perfringens produce un enzima que degrada colágeno
•
Problema: Identificar el gen que codifica ese enzima
Negativo
Positivo
Uso de las genotecas
•
•
Obtención de DNA de C. perfringens y construcción de
g
genoteca
•
Tamaño genoma: ~3.000.000 pb
•
Corte con EcoRI: ~750 fragmentos
g
de ~4.000 p
pb
Transformación de los plásmidos en E. coli y selección de
colonias
Gen colagenasa
+ EcoRI
+ EcoRI
Genoma Clostridium
3 Mb
~750 fragmentos
~750 plásmidos
Uso de las genotecas
•
Problema: ¿qué colonia de E. coli tiene el gen de la
colagenasa?
g
•
Análisis funcional: la colonia que tenga actividad colagenasa
Colonias
Degradación
de colágeno
Aplicaciones
p
tecnología
g
del
DNA recombinante
•
La clonación
L
l
ió d
de un gen permite
it obtener
bt
iinformación
f
ió acerca
del gen, y desarrollar aplicaciones
Tamaño del gen
Presencia en otras especies
S
Secuencia
i d
de DNA
Producción de proteína
Métodos de diagnóstico
Sistema del doble híbrido
•
Permite
P
it analizar
li
millones
ill
d
de proteínas
t í
para id
identificar
tifi
proteínas que interaccionen con la nuestra
•
Se basa en el uso de factores de transcripción con dos
dominios en células de levadura
•
Expresión de cebo como fusión con dominio de unión al DNA
•
Expresión de la presa como fusión con dominio de activación
Sistema del doble híbrido
cebo
AD
DNA-BD
presa
gen de selección
GAL UAS
Análisis de una genoteca
clones que expresan
proteínas que interaccionan
transformación
plásmido cebo
+ plásmidos genoteca
(3x106 clones)
selección
aislar plásmido presa
secuenciar
Interacción y función
Determinación de rutas de
señalización por doble híbrido
•
•
Screening >presa >screening
Problemas del doble híbrido
•
Detección de interacciones débiles o transitorias
•
Modificaciones
M
difi
i
post-traduccionales
tt d
i
l no di
disponibles
ibl en
levaduras
•
Proteínas de membrana
Validación de interacciones
•
Transferencia
f
de proteínas a vectores y validación
epítopo
cDNA
AD
Vector presa
Expresión levaduras
Vector cebo
Expresión levaduras
V t cebo
Vector
b
Expresión mamíferos/plantas
V t presa
Vector
Expresión mamíferos/plantas
Transfección
Expresión mamíferos/plantas
Co-inmunoprecipitación epítopo-1
Western blot epítopo
epítopo-2
2
Biología de sistemas:
Interactómica
•
Clonación de todos los genes de un organismo en vectores
C
de doble híbrido (como cebo y como presa)
•
Análisis de las interacciones de todos los genes
•
Determinación de rutas, genes de conexión entre rutas,
actividad de nuevos genes
Interactoma de C. elegans
Interactoma
Evolución molecular in vitro
•
¿Cómo
C
mejorar las propiedades de un enzima natural?
?
•
DNA shuffling
h ffli + selección
l
ió
Quimeras génicas: nuevas
propiedades
Creación de enzimas con nuevas
propiedades