Download identificación de los esturiones del guadalquivir utilizando cinco

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IDENTIFICACIÓN DE LOS ESTURIONES DEL GUADALQUIVIR UTILIZANDO CINCO MARCADORES
MOLECULARES Y TÉCNICAS FORENSES
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Robles , F.; De la Herrán , R.; Garrido-Ramos , M.A.; Ruiz-Rejón , C.; Martínez-Espín , E.; Lorente ,
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J.A. y Ruiz-Rejón , M.
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Departamento de Genética, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, E-18071 Granada, España.
Departamento de Medicina Legal y Forense, Facultad de Medicina, Universidad de Granada, E-18071,
Granada, España.
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Resumen
En este trabajo se pretende aclarar la controversia existente en cuanto al estatus taxonómico de los tres
ejemplares de esturión capturados en el río Guadalquivir y que se conservan en la Estación Biológica de
Doñana (EBD). Para la obtención del ADN hemos utilizado técnicas forenses y hemos estudiado cinco
marcadores moleculares (dos mitocondriales y tres nucleares). Las secuencias obtenidas para cada
marcador en cada espécimen se han comparado con las obtenidas para dichos marcadores en las
especies Acipenser naccarii Bonaparte, 1836 y Acipenser sturio Linnaeus, 1758. Como resultado de estos
análisis hemos llegado a la conclusión de que los especímenes EBD8173 y EBD8401 pertenecen a la
especie A. naccarii, mientras que el ejemplar EBD8174 podría ser un organismo híbrido entre las dos
especies (ya que para los marcadores mitocondriales se asemeja a A. sturio y para los nucleares se
parece a A. naccarii).
Introducción
En la actualidad, las poblaciones naturales de esturiones se encuentran en retroceso en todo el mundo,
siendo su situación más crítica en Europa Occidental y más concretamente en la Península Ibérica y el río
Guadalquivir, donde desde 1974 sólo se han capturado tres ejemplares. Los intentos de identificación de
estos tres especímenes, EBD8173, EBD8174 y EBD8401, que se encuentran conservados en la Estación
Biológica de Doñana, han resultado controvertidos. Tradicionalmente se han catalogado como Acipenser
sturio, ya que se ha considerado ésta como la única especie existente en la Península Ibérica (Almaça,
1988; Elvira and Almodóvar, 1993). Sin embargo, recientes estudios moleculares utilizando marcadores
nucleares llevados a cabo por nuestro grupo (Garrido-Ramos et al., 1997), contradicen esta asignación a
favor de la especie Acipenser naccarii . Esta última especie se ha considerado hasta ahora endémica del
Adriático, aunque existen referencias que citan su presencia en ríos de la Península Ibérica (Capello,
1869; Gonçalves, 1942). Pero, otros estudios moleculares posteriores, utilizando marcadores
mitocondriales (Almodóvar et al., 2000 y Gassent-Ramírez et al.,2002), han puesto de manifiesto que, al
menos, el ejemplar EBD8174 se comporta como A.sturio. En este trabajo se pretende contribuir a aclarar
el estatus taxonómico de estos especímenes analizándolos de forma exhaustiva, es decir, obteniendo
ADN de los tres ejemplares en buenas condiciones mediante técnicas forenses y estudiando en ellos un
total de 3 marcadores nucleares y 2 marcadores mitocondriales.
Material y métodos
La obtención de ADN genómico de individuos de la especie A. naccarii (procedentes de la Piscifactoría
Sierra Nevada, Riofrío Granada. España) y de la especie A. sturio (procedentes del CEMAGREF,
Burdeos, Francia), se llevó a cabo siguiendo el método descrito en Sambrook et al., 1989. La extracción
de ADN de los ejemplares conservados en la Estación Biológica de Doñana se llevó a cabo siguiendo el
método descrito en Anderson et al., 1999. En concreto, se realizó una limpieza de las muestras, previa a
la extracción, mediante un minitaladro (Dremel®), eliminando la parte externa de las muestras que ha
estado en contacto con el etanol o el medio ambiente. Posteriormente, se pulverizaron las muestras en el
Frezeer Mill, utilizando nitrógeno líquido. Finalmente, se realizó una extracción orgánica, mediante
fenol/cloroformo-isoamilalcohol, recuperando el ADN en filtros Microcon YM-100 Millipore.
Las unidades monoméricas de la familia de ADN satélite HindIII fueron amplificadas utilizando los primers
descritos en De la Herrán et al., 2001. Para la amplificación de las unidades monoméricas de la familia de
ADN satélite PstI se utilizaron unos primers diseñados a partir de las zonas conservadas de la unidad de
repetición de este ADN satélite en A. naccarii (Robles et al., en preparación). Mediante enzimas de
restricción hemos aislado del ADN genómico de A. naccarii un fragmento del gen 5S. A partir de esta
secuencia de ADN se diseñaron primers para amplificar las unidades completas de repetición de este
ADN 5S, región funcional y región espaciadora (Robles et al., en preparación). Los fragmentos de ADN
mitocondrial correspondientes a una secuencia parcial del gen del citocromo b y una secuencia parcial del
gen de ARN ribosómico 12S se amplificaron mediante PCR. Los primers utilizados, así como las
condiciones de amplificación, son de Gassent-Ramírez et al., 2002.
En todos los casos, después de la amplificación se procedió a obtener clones de los marcadores
siguiendo el método de Sambrook et al., 1989 y, por último, se procedió a secuenciar tales clones
siguiendo el método de Sanger et al., 1977.
Resultados y discusión
En trabajos previos (Garrido-Ramos et al., 1997; De la Herrán et al., 2001; Lanfredi et al., 2001) se ha
puesto de manifiesto la presencia del ADN satélite HindIII en la especie A. naccarii y su ausencia en
A.sturio. Por el contrario, el ADN satélite PstI se encuentra muy conservado en la Familia Acipenseridae,
estando presente en los genomas de todas las especies, existiendo sitios diagnósticos que diferencian A.
naccarii y A. sturio (Robles et al., en preparación). Y también existen sitios diagnósticos en los otros
marcadores moleculares analizados, los espaciadores de los genes ribosómicos 5S (Robles et al., en
preparación), y el gen del citocromo b y el gen 12S (Gassent-Ramírez et al., 2002).
Tras el análisis de los tres ejemplares conservados en la Estación Biológica de Doñana los resultados
obtenidos son (Véase Tabla I):
EJEMPLARES EBD8173 Y EBD8401:
En estos dos especímenes se han obtenido una serie de clones para los cinco marcadores cuyo número
se indica en la Tabla I. Tras el análisis de sus secuencias, se puede concluir que las variantes que
presentan estos dos ejemplares se corresponden con las de la especie A. naccarii tanto para las
secuencias nucleares como para las mitocondriales.
EJEMPLAR EBD8174: El número de clones obtenidos se indica asimismo en la Tabla I. El análisis de los
tres marcadores nucleares (familia de ADN satélite HindIII, familia de ADN satélite PstI y secuencias
espaciadoras del gen ribosómico 5S) revela en este individuo que las variantes encontradas se
corresponden con la especie A. naccarii. Sin embargo, cuando analizamos los dos marcadores
mitocondriales (gen del citocromo b y gen 12S) las variantes se corresponden en este caso con las de la
especie A. sturio.
Se discute, en primer lugar, la utilidad de estos marcadores moleculares para la clasificación taxonómica
de los ejemplares conservados en la Estación Biológica de Doñana y la posible utilización para la
identificación de otros individuos problema. Se llega a la conclusión, a continuación, que los ejemplares
EBD8173 y EBD8401 pertenecen a la especie A. naccarii, y que en el caso del EBD8174 se puede tratar
de un ejemplar híbrido entre A. sturio (progenitor femenino) y A. naccarii (progenitor masculino).
Finalmente, se discuten las implicaciones que puede tener para la acuicultura y la recuperación de los
esturiones en la naturaleza el hallazgo de que A. naccarii es autóctono de la Península Ibérica.
Tabla I. Número de clones obtenidos para cada marcador en cada uno de los ejemplares conservados en
la Estación Biológica de Doñana
Satélite HindIII
Satélite PstI
Espaciador 5S Citocromo b
Gen 12S
EBD 8173
1
5
2
1
2
EBD 8401
2
6
5
1
3
EBD 8174
1
3
5
3
2