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Ingeniería Genética B
1d cuatrimestre de 2016
Trabajo práctico de Laboratorio
Clonado y expresión de la porción C-terminal de la
proteína VP6 de Rotavirus
A continuación se describen los aspectos fundamentales del trabajo de
laboratorio que se realizará en el marco de la asignatura Ingeniería Genética comisión
B, necesarios para la elaboración del plan de trabajo correspondiente.
El Rotavirus pertenece a la familia Reoviridae, cuyos miembros poseen 11
segmentos de ARN doble cadena encapsidados dentro de partículas proteínas de
múltiples capas con simetría icosaédrica. En partículas los Rotavirus poseen partículas
virales de tres capas proteicas, y su genoma codifica para 12 proteínas virales. En
particular la proteína estructural VP6 de 397 aminoácidos, es la más abundante en
masa con respecto al resto de los componentes virales y es la que forma la cápside
intermedia del virus. Ésta proteína posee un rol fundamental durante el ciclo viral, dado
que funciona como adaptador entre la capa interna y la capa externa, y ha sido
descripta como la proteína más antígénica del virus durante la infección. En particular
la porción C-Terminal de la proteína VP6 (332-397) ha sido reportada como la más
antigénica (ver figura 1).
Con el objetivo de obtener la porción C-Terminal de la proteína VP6 pura para
futuros ensayos de inmunización en animales, se realizará la producción de la misma
en un sistema de expresión procariota. El sistema seleccionado para este trabajo de
laboratorio es el plásmido pET28 y la cepa BL21 DE3 de E. Coli. El vector pET28a
contiene el promotor del fago T7 regulado por el operador lac, y la secuencia
correspondiente al tag de histidinas (Hysx6) para la fusión en el extremo N-terminal y
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C-terminal. Por otro lado la cepa de E. coli BL21 contiene integrado en su genoma el
gen de la RNA polimerasa de T7, bajo la regulación del operador Lac. Es por este
motivo que este sistema de expresión posee un doble control sobre la inducción de la
expresión del gen de interés.
Para aumentar la eficiencia de producción de la proteína de interés en un
sistema procariota, es recomendable la optimización de codones ´para el organismo
seleccionado. Esto implica la inserción de mutaciones silenciosas en la secuencia
nucleotídica. Y la forma más rápida y menos costosa de obtener la secuencia
optimizada es mediante la síntesis de novo del gen mediante PCR. Para esto se
diseñan oligonucleótidos solapados que incluyan toda la secuencia de interés. Los
mismos son incubados en una mezcla de reacción, incluyendo una ADN polimerasa,
con el objetivo de obtener el producto de fusión de los oligonucleótidos. En la figura 2
se observa un esquema de los oligonucleótidos y de lo que se espera obtener en los
primeros tres ciclos de la reacción.
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Objetivos
El Objetivo General de este trabajo consiste la síntesis de novo de la porción CTerminal de la proteína VP6 de Rotavirus, el clonado de la misma en un vector de
expresión procariota, la producción de la misma en E. Coli, y su purificación mediante
cromatografía de afinidad.
Objetivos específicos:
1) Realizar la optimización de codones de la porción C-Terminal de la proteína VP6 de
Rotavirus, para su expresión en E. Coli.
2) Realizar la síntesis de novo la porción C-Terminal de la proteína VP6 mediante PCR.
3) Clonar el ORF sintetizado en el vector pET-28, utilizando enzimas de restricción.
4) Expresar la porción C-Terminal de la proteína VP6 fusionada a un tag de histidinas
en la cepa BL21 de E. Coli.
5) Purificar la porción C-Terminal de la proteína VP6 mediante IMAC
Bibliografía
- Qiaexpresionist, A handbook for high-level expression and purification of 6xHistagged proteins, 2001-Qiagen
- B.V., Cohen, J., Rey, F.A. Atomic structure of the major capsid protein of rotavirus:
implications for the architecture of the virion. The EMBO Journal. 20, 1485-1497. 2001
- Choi AH, McNeal MM, Basu M, Bean JA, VanCott JL, Clements JD, Ward RL..
Functional mapping of protective epitopes within the rotavirus VP6 protein in mice
belonging to different haplotypes. Vaccine. 2003 Jan 30;21(7-8):761-7.
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