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Escuela "José A. Balseiro" 2014
- Modelado en Neurociencias
Práctico de Plasticidad Sináptica
Los objetivos de este trabajo práctico consisten en:
a) Que los alumnos se familiaricen con métodos y equipamiento para el registro electrofisiológico de
la función sináptica
b) Que los alumnos logren observar procesos de plasticidad sináptica de corto plazo en rebanadas
agudas de cerebro de ratón
c) Que los alumnos aprendan a analizar registros electrofisiológicos
Plasticidad sináptica de cotro plazo
La plasticidad sináptica es la capacidad de modificar, en función de la actividad, la función sináptica
entre dos neuronas que se comunican. Es decir el flujo de información entre dos neuronas, es
modificado por determinados patrones de actividad. Las características de la sinapsis (neurotransmisor
y tipo de receptor, receptores presinápticos) y el tipo de actividad (generalmente frecuencia, o
secuencia temporal) pueden efectuar cambios plásticos en ambas direcciónes (potenciación o
depresión). En general, los mecanismos involucrados en efectuar estos cambios en la fuerza sináptica
pueden ser tanto presinápticos como postsinápticos.
De acuerdo con el tiempo durante el cuál se prolongue el cambio en la fuerza sináptica la plasticidad
puede catalogarse en: de corto plazo (ms a min) o de largo plazo (hs).
La plasticidad a corto plazo ( STP ) se refiere a un fenómeno en el que los cambios de eficacia sináptica
en el tiempo reflejan la historia de la actividad presináptica. Experimentalmente se describieron dos
tipos de STP , con efectos opuestos sobre la eficacia sináptica. Se les conoce como la depresión a corto
plazo ( STD ) y la facilitación de corto plazo ( STF ) . STD es causada por el agotamiento de
neurotransmisores, que se consumen en el terminal del axón de una neurona presináptica durante la
transmisión sináptica. Por otro lado, la STF es causada por la entrada de calcio en la terminal del axón
después de generación del potencial de acción, aumentando la probabilidad de liberación de los
neurotransmisores. Fómenos de plasticidad de corto plazo se han encontrado en diferentes regiones
corticales y con gran diversidad de propiedades. Las sinapsis en diferentes áreas corticales pueden tener
diversas formas de plasticidad, STD, STF, o una mezcla de ambas formas.
En comparación con la plasticidad a largo plazo, postulada como el sustrato neural para la modificación
dependiente de la experiencia de circuito neural, la STP tiene una escala de tiempo más corto,
típicamente del orden de decenas a miles de milisegundos. La modificación que induce a la eficacia
sináptica es temporal y rápida, al cesar la actividad presináptica, la eficacia sináptica vuelve
rápidamente a su nivel basal.
Se propone que la plasticidad a corto plazo juega un papel vital en las función del cerebro. Desde un
punto de vista computacional, la escala temporal de la STP se encuentra dentro del orden de muchos
procesos que ocurren en la vida diaria, por ejemplo el control motor, el reconocimiento de voz y la
memoria de trabajo. Por tanto, la STP podría servir como un sustrato neural para el procesamiento de la
información temporal en las escalas de tiempo relevantes. La STP implica que la respuesta de una
neurona postsináptica depende de la historia de la actividad presináptica, por lo tanto, en una red de
gran tamaño esta plasticidad enriquece en gran medida los comportamientos dinámicos de la red,
dotando al sistema con capacidades de procesamiento de información que serían difícil de implementar
sólo con conexiones estáticas. Estas posibilidades han dado lugar a un gran interés en las funciones de
cálculo de STP en el campo de la Neurociencia Computacional.
Plasticidad de corto plazo en el Giro Dentado
El giro dentado es la principal vía de entrada de información al hipocampo. Esta estructura contribuye
principalmente a la formación de nuevos recuerdos episódicos y a la representación del espacio que nos
rodea. Las neuronas principales del giro dentado son las células granulares. Estas reciben información
de la corteza entorrinal, la procesan y envían su output glutamatérgico hacia neuronas piramidales del
área CA3 del hipocampo. Las neuronas granulares del giro dentado reciben aferentes glutamatérgicos
de la corteza a través de las vías perforantes lateral y medial (LPP y MPP), provenientes de las capas 23 de corteza entorrinal lateral y medial, respectivamente. Los mismos se disponen en forma
laminar en la capa molecular del giro dentado, ubicándose la LPP en el tercio externo de la capa
molecular y la MPP en el tercio medio de la misma. Este arreglo ordenado permite estimular
diferencialmente las dos vías perforantes mediante el uso de electrodos
extracelulares en las rebanadas de cerebro. La correcta localización de los electrodos puede evaluarse a
posteriori por la fisiología de las
respuestas evocadas.
La plasticidad a corto plazo es quizás la diferencia más característica entre las sinapsis
formadas por las dos vías perforantes. Al estimular la LPP con pulsos pareados en el tiempo, el
EPSC evocado por el segundo pulso presenta una amplitud promedio superior a la del primer EPSC,
un fenómeno conocido como facilitación y que es mediado por receptores metabotrópicos de
glutamato que al activarse gatillan una corriente de calcio que incrementa la probabilidad de liberación
de vesículas sinápticas. Por el contrario, el mismo protocolo aplicado a la MPP resulta en
depresión del segundo EPSC.
Figura 1: Panel izquierdo: Esquema de
rebanada de hipocampo, conteniendo al giro dentado. En celeste se observa la capa granular (GL) con los somas de las
neuronas granulares, se esquematizan 2 neuronas granulares en color verde y rojo respectivamente. Nótese las dendritas de
las mismas inmersas en la capa molecular (ML), región donde provienen los axones de la vía perforante. También se
esquematizan dos electrodos de estimulación, uno colocado sobre la vía perforante medial (MPP) y otro sobre la la vía
perforante lateral (LPP). Panel derecho: dibujo en cámara lúcida d euna neurona granular del giro dentado. Nótese el
soma en la capa granular (gcl) las dendritas orientadas hacia la capa molecular (mol) y el axón de la misma que se
proyecta hacia la capa piramidal (pl) de la región CA3.
PREPARACIÓN DE REBANADAS AGUDAS DE CEREBRO
Los ratones fueron anestesiados y decapitados. El cerebro se removió en solución ACSF fría y
se procedió a remover el cerebelo y los bulbos olfativos, luego el cerebro se pegó a la platina de un
vibrátomo con cyanoacrilato, y se sumergió inmediatamente en ACSF fría y burbujeada con gas
carbogeno (95% O 2 , 5% CO 2 ) para su corte. Se cortaron mayormente rodajas de 400 μm a
velocidad de corte de 0,06 mm/s. Las rodajas se trasladaron inmediatamente con pipeta pasteur cortada
a
una cámara ubicada a 30°C con solución ACSF carbogenada donde se depositaron sobre una gasa
sumergida y permanecieron hasta la
realización de experimentos.
Se detalla a continuación la composición (concentración en mM) del ACSF (Artificial Cerebro‐Spinal
Fluid): 125 NaCl, 2.5 KCl, 2.3 NaH 2 PO 4 , 25 NaHCO 3 , 2 CaCl 2 , 1.3
MgCl 2 , 10 glucosa, 1.3 ascorbato de sodio, 3.1 piruvato de sodio. Osmolaridad: 315 mOsm.
REGISTRO DE POTENCIALES DE CAMPO EVOCADOS
Para la realización de experimentos las rodajas se ubicarán en cámara de registro con flujo de
ACSF carbogenada a temperatura ambiente (2 ml/min) bajo microscopio con óptica DIC y
objetivo de inmersión en agua (40X). Se utilizan pipetas de patch de vidrio Borosilicato,
diámetros interno y externo 1 y 1,5 mm. Las mismas son estiradas con un puller horizontal de 4
puntos hasta obtener pipetas de registro con unos 4-5 MΩ de resistencia en su punta.
Los registros se realizarán con amplificador Multiclamp (Molecular Devices) en configuración
current clamp. La salida se capturó con DigiData 1440 (Molecular Devices) y software o pClamp
9 (Molecular Devices). Los electrodos de registros serán posicionados mediante un micromanipulador
piezoeléctrico de alta presición (Sutter Ins). Los electrodos de estimulación se ubicarán mediante un
micromanipulador manual. Los estímulos eléctricos serán coordinados por el software de adquisición y
comandados por una salida digital de la tarjeta digitalizadora, esta señal gatillará a la unidad aisladora
de estímulo, que enviará una corriente eléctrica (30 a 100 μA, durante 100 μs) .
DESARROLLO
Se estudiarán los fenómenos de depresión y facilitación sináptica característicos de las vías perforante
(PP) medial y lateral respectivamente. Se estudiará plasticidad de la respuesta aplicando dos pulsos de
de estimulación sobre los axones provenientes de la corteza entorrinal. Se ensayarán diferentes
intervalos inter-pulso tanto para la PP: 25, 50 , 100 y 200 ms . Para cada intervalo se tomarán 10
repeticiones, separadas una de otra por 15 s.
ANÁLISIS DE DATOS.
Una vez realizados los registros, se puede utilizar la secuencia de pasos indicadas en el programa
'analisis.m' que permite realizar un procesamiento de los mismos para poder obtener información sobre
la cantidad de axones estimulados en las vías perforantes y sobre la cantidad de células que se logran
excitar.
Los parámetros que permiten tener noción de estas cantidades son el field excitatory postsynaptic
potential (fepsp) y el population spike (pspike). El fepsp es una depolarización postsináptica causada
por el flujo de iones hacia células postsinápticas. El pspike es el cambio de potencial eléctrico causado
por la generación de disparos del potencial de membrana.
En cierta medida, el valor del fepsp permite acceder a información respecto a la cantidad de axones que
se estimulan, mientras que el pspike permite obtener información de cuantas neuronas han sido
excitadas. El práctico propuesto consiste en utilizar los registros realizados para comparar los valores
de fepsp y pspike en los siguientes casos:
– El estímulo se aplica en la vía perforante media, separando los pulsos en distintos intervalos de
tiempo.
– El estímulo se aplica en la vía perforante lateral, separando los pulsos en distintos intervalores
temporales.
Figura 1: Ejemplo de dos pulsos generados a partir de dos estimulaciones de las vías perforantes. La comparación de
algunas características de estos pulsos permite cuantificar la medida de plasticidad.
En la Figura 1 se muestran dos pulsos registrados correspondientes a dos estímulos separados en un
tiempo de 50ms. El problema ahora consiste en determinar un medida que se relacione con el valor del
fepsp y el pspike a partir de estos gráficos de evolución del potencial local. En este práctico se propone
medir el fepsp a partir de la pendiente de cada uno de los pulsos, y el pspike a partir del área entre los
máximos (ver Figura 2). La pendiente del pulso se encuentra linealmente relacionada con el valor del
fepsp, y el área determinada en la Figura 2 es proporcional al pspike.
Figura 2: Evolución temporal del potencial local para un pulso de estimulación. Se muestran la pendiente (para cuantificar
el fepsp) y el área (para cuantificar el pspike).
Para calcular los valores de la pendiente y el área es necesario determinar:
1) El rango temporal en el cuál se determina la pendiente (de aquí en más la llamaremos
directamente fepsp) y el área.
2) Los máximos de entre los cuáles se calcula el área para determinar el population spike (de aquí
en más los llamaremos pspike1 y pspike2).
Se les proporcinará una función desarrolada en Matlab (Mide_parametros_fieldpotencial.m) que
obtiene las cantidades requeridas (fepsp, pspike1,pspike2 y area). Esta función puede operar en modo
manual o automático. Este modo se refiere a la determinación de los intervalos temporales necesarios.
Si manual=1, es necesario usar la función 'Parametros_manuales.m' que da acceso a los siguientes
parámetros:
T_BASELINE_INI = 150;
T_BASELINE_FIN = 350;
T_SLOPE_INI = 417.7;
T_SLOPE_FIN = 418.5;
T_ANTIPEAK_INI = 419.0;
T_ANTIPEAK_FIN = 423.5;
T_SPEAK2_FIN = 425.0;
Figura 3: Evolución temporal del potencial local. Se muestra el rango para la elección de T_BASELINE_INI y
T_BASELINA_FIN.
Figura 4: Evolución temporar de un único pulso con indicación de los parámetros T_SLOPE_INI,
T_SLOPE_FIN,T_ANTIPEAK_INI,T_ANTIPEAK_FIN Y T_SPIKE2_FIN.
Para seleccionar estos parámetros manualmente debe cargar los datos. Para ello puede utilizar la
función data=Carga_Registros(directorio,file). Esta función recibe como argumentos el directorio
donde se encuentran los datos y el nombre del archivo, y devuelve una matriz donde la primera
columna corresponde al tiempo y las demás columnas corresponden al potencial local para distintos
pares de pulsos. Una vez cargados los datos, puede utilizar la función 'Plot_Registro(data,n)'. Dicha
función graficará la evolución temporal del n-ésimo par de pulsos. A partir de este gráfico determine
los parámetros requeridos para correr el programa en modo manual=1.
Eligir alguna separación entre pulsos (T_pulso2) para realizar un análisis preliminar de los datos, por
ejemplo T_pulso2=50ms. La función
Mide_Parametros_fieldpotencial(directorio,file,namefile,manual,T_pulso2) le devolverá dos
gráficos en los cuáles puede visualizar los rangos en los cuáles se calcula el fepsp y los valores de
pspike1 y pspike2 seleccionados.
A continuación puede proceder a cambiar el modo a manual=0, de manera que los parámetros
temporales se calculen de manera automática, y proceder a cambiar el tiempo entre los pulsos
(T_pulso2).
El programa analisis.m utilizará la función Compara_Pulsos(resultados) para calcular los cocientes
entre las variables en cuestión, y las guarda en un archivo llamado resultados.dat. Para distintos valores
de T_pulso2 se irán agregando los resultados a este archivo.
Finalmente, una vez calculadas los cocientes de las variables fepsp, pspike1,pspike2 y área para
distintos valores de T_pulso2, puede proceder a utilizar la función 'Graficar(directorio,name)' para
observar la evolución de los valores de los cocientes entre fepsp, pspike1,pspike2 y área entre los dos
pulsos al modificar el valor de T_pulso2.
Guardar esta imagen para luego poder comparar lo que ocurre con las vias de perforación media y
lateral.
Para pensar:
a- ¿Qué diferencias se observan al modificar el valor de T_pulso2 cuando el estímulo se realiza en las
vías perforantes medias?
b-¿Qué diferencias se observan al modificar el valor de T_pulso2 cuando el estímulo se realiza en las
vías perforantes laterales?
c-¿En que circunstancias ambos resultados coinciden?