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Facultad de Ciencias Naturales
Sede Pto. Madryn
Cátedra de Biología Celular y Molecular
TRABAJO PRÁCTICO N°5:
Inducción de mutaciones en Escherichia coli
Objetivo:
Reconocer el aumento de la frecuencia de mutaciones en los genes que codifican para la
ARN polimerasa y la topoisomerasa II en cepas de E. coli por efecto de un agente
(mutágeno) químico.
Manipular material de laboratorio para la preparación de cultivos bacterianos y diluciones.
Introducción teórica:
El ARN es sintetizado sobre un molde de ADN en un proceso denominado transcripción del
ADN.
La transcripción produce moléculas de ARN mensajero que llevan la información para la
síntesis de proteínas, ARNs de transferencia y ribosomales, como también otras moléculas
de ARN con funciones catalíticas y estructurales.
Todas estas moléculas son sintetizadas en procariotas por intermedio de una única enzima,
la ARN polimerasa, mientras que en eucariotas intervienen diferentes tipos de polimerasas
para las distintas clases de ARNs.
La ARN polimerasa consta de cuatro subunidades, dos cadenas  idénticas codificadas por
el gen RPOL A y dos cadenas  y ' codificadas por los genes RPOL B y RPOL C
respectivamente. Su modo de acción consiste en explorar el ADN y, con el agregado de
proteínas específicas (factores ) reconocer y unirse a sitios específicos del ADN
denominados promotores, donde se encuentra el sitio de iniciación para la síntesis del ARN.
La holoenzima (ARN polimerasa + factores  ) luego de unirse al promotor abre la
estructura de doble cadena del ADN exponiendo unos pocos nucleótidos de cada una,
permitiendo de ese modo la transcripción.
Otra enzima, topoisomerasa II, denominada en procariotas ADN girasa, actúa durante la
replicación del ADN. Esta enzima está constituida por dos cadenas y codificadas por los
genes GYR A y GYR B respectivamente. Su modo de acción consiste en transformar
superenrollamientos positivos en negativos en cromosomas circulares (mecanismo de
inversión de signos) uniéndose covalentemente al ADN en sitios específicos o nodos
positivos (región de entrecruzamiento de las dos hebras). Allí provoca una rotura transitoria
permitiendo la rotación de una hebra sobre la otra y relajando esa región del cromosoma. De
esta manera la ADN girasa puede separar eficientemente dos moléculas de ADN,
catalizando la decadenación necesaria para finalizar la replicación.
Organismos mutantes para esta enzima presentan durante la mitosis los cromosomas
interconectados e incapaces de separarse.
Existen una serie de antibióticos que actúan inhibiendo las enzimas anteriormente
mencionadas. La rifampicina, que pertenece al grupo de antibióticos monocíclicos conocido
genéricamente como rifamicinas, es una potente inhibidor de la ARN polimerasa
dependiente del ADN en bacterias (no es efectivo en humanos).
Interactúa con la subunidad  de la ARN polimerasa uniéndose en una región distante del
sitio activo.
Otros antibióticos como el ácido nalidíxico y la norfloxacina ejercen su acción inhibiendo la
ADN girasa.
Sin embargo no todas las bacterias son sensibles a estos antibióticos. La resistencia a los
mismos surge por numerosos cambios en la secuencia lineal de las enzimas, que pueden
provocar una gran disminución en la afinidad por el antibiótico.
La mutagénesis (proceso de producción de mutaciones) puede ser espontánea cuando
ocurre naturalmente, o inducida si son empleados para tal fin agentes químicos o físicos
(mutágenos).
El mutágeno naranja de acridina (AO) que será empleado en este trabajo práctico es un
agente químico formado por una molécula plana de dos anillos, cuyas dimensiones se
aproximan a las de un par de bases (purina-pirimidina). En solución acuosa esta sustancia
forma agregados capaces de insertarse entre pares de bases adyacentes, provocando el
desplazamiento de las mismas una distancia igual al de un par de bases. Este proceso
recibe el nombre de intercalación. De esta manera cuando el ADN que contiene acridina
intercalada es replicado, aparecen bases adicionales respecto de la secuencia original.
Generalmente se adiciona un par de bases y con menor frecuencia dos.
Esta clase de mutaciones se conocen como mutaciones por cambio de marco de lectura. La
secuencia de bases del ADN es leída durante la traducción en grupos de tres (tripletes); la
adición de una nueva base provoca un corrimiento en la lectura de la secuencia.
Ejemplo:
Tyr
Glu
Thr Gly
Ile
TACGAATCGGGTATT
5'
3'
.
.
replicación en presencia de acridina
Tyr
Glu
Ile
Gly
Tyr
TACGAGATCGGGTATT
5'
3'
.
.
ATGCTCTAGCCCATAA
En un gen particular, las mutaciones no se producen al azar, sino que están confinadas a
ciertos sitios más sensibles que, como ocurre en E. coli pueden ser alteradas entre 200 y
500 veces más que un sitio mutante promedio.
En la ARN polimerasa de bacterias resistentes a rifampicina se observaron deleciones,
sustituciones o inserciones ocurridas entre tres regiones altamente conservadas de la
enzima. de tal manera, en una mutagénesis inducida estas secuencias de bases serían más
susceptibles al mutágeno y podrían alterarse con mayor probabilidad que como lo hacen
naturalmente.
En este trabajo práctico, cultivos bacterianos serán expuestos a distintas concentraciones
del agente mutagénico naranja de acridina. Este mutágeno aumentará la frecuencia de
mutación en las zonas sensibles de los genes bacterianos. En particular, las enzimas ARN
polimerasa y Topoisomerasa II verán alterados sus sitios de reconocimiento a los
antibióticos, pero seguirán siendo enzimas funcionales.
Por lo tanto se espera poder observar el desarrollo de colonias de bacterias resistentes a
los antibióticos.
Protocolo:
Materiales:
- Cepas de E. coli (ATCC 35218 y ATCC 25922)
- Naranja de acridina
- Rifampicina
- Acido nalidíxico
- Medio de cultivo Muller-Hinton
- Caldo nutritivo: triptosa
1g
ext. de levadura 0,5 g
agua dest.
100 ml
- Agua destilada
- Tubos de ensayo
- Pipetas, micropipeta, propipeta
- Placas de Petri
- Frascos Erlenmeyer
- Varillas de vidrio
- Balanza
- Anza de distribución
Procedimiento:
1) Esterilizar todo el material a usar.
2) Repicar los cultivos madres de cada una de las dos cepas de E. coli, colocando 20 l en
cada uno de los 10 tubos de ensayo (5 para cada cepa), conteniendo 4 ml de caldo nutritivo
más naranja de acridina en las siguientes concentraciones:
Tubos n° 1 (uno para cada cepa) :100 µg/ml
Tubos n° 2
"
: 50 µg/ml
Tubos n° 3
"
: 25 µg/ml
Tubos n° 4
"
: 12,5 µg/ml
Tubos n° 5
"
: 0 (testigo)
Calcular previamente las diluciones de mutágeno necesarias para agregar a cada tubo en la
concentración indicada.
Observaciones: la manipulación de la naranja de acridina la debe realizar exclusivamente el
docente a cargo del trabajo práctico, debido a la peligrosidad de este mutágeno.
3) Incubar las muestras durante 24 h a 37° C, de manera de lograr la fase logarítmica del
desarrollo.
4) Preparar los 2 erlenmeyer con 40 ml de medio de cultivo para cargar en las placas de
Petri (se necesitan 20 ml para cada una) agregando agua destilada al medio, en la
proporción indicada.
Calentar hasta ebullición y luego autoclavar.
5) Simultáneamente preparar diluciones de los tres antibióticos con agua dest. para agregar
a los medios de cultivo de manera de obtener las siguientes concentraciones:
Rifampicina: 60 µg/ml
Acido nalidíxico: 25 µg/ml
Norfloxacina: 1 µg/ml (disolver previamente con NaOH)
6) Agregar a cada Erlenmeyer las diluciones correspondientes de los tres antibióticos.
7) Distribuir inmediatemente 20 ml de cada medio en las seis placas de Petri de modo de
lograr un gradiente de concentración del antibiótico de 0 a 100 % inclinando las placas.
8) Preparar en otro 80 ml más de medio de cultivo y completar con él las placas, una vez
que halla solidificado la carga anterior con los antibióticos.
9) Sembrar en estría recta.
 Observe el crecimiento de las distintas colonias en las placas de Petri y analice los
resultados.
 Describa las observaciones realizadas. Indique si existe algún tipo de correlación
entre las concentraciones del mutágeno y el crecimiento bacteriano en cada medio y
con cada una de las dos cepas utilizadas.
 Redacte conclusiones.
 Pudo demostrar que la naranja de acridina aumenta la frecuencia de mutación en E.
coli? Proponga un diseño experimental que permita demostrarlo.
Bibliografía:
1) Marguet, R. (1994) Comunicación personal.
2) Alberts, B. et al (1987) Biología molecular de la célula. Omega. Barcelona.
3) Braude, A. (1979) Farmacoterapia antimicrobiana. Ed. Médica Panamericana S.A. Bs.As.
4) Darnell, J.; Lodish, H. & D. Baltimore (1990) Molecular Cell Biology. 2da. ed. Scientifican
American Books, Inc. N.Y.
5) Freifelder, D. (1987) Molecular Biology. Jones & Bartlett Publishers, Inc. Boston.
6) Spratt, B. (1994) Resistance to antibiotics mediated by target alterations. Science. 264:
388-393.