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SD
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REVISTA MÉDICA INTERNACIONAL SOBRE EL SÍNDROME DE DOWN
2003: vol. 7, núm. 2, pp. 18-25
Original
Alteraciones de la microarquitectura
de la corteza cerebral en el ratón Ts65Dn,
un modelo murino de síndrome de Down:
efectos del enriquecimiento ambiental
M. Dierssen1, R. Benavides-Piccione2, I. Ballesteros2, C. Martínez-Cué3,
X. Estivill1,4, J. Flórez3, G. N. Elston2,5, J. De Felipe2
1
Programa Genes y Enfermedad, Centro de Regulación Genómica,
08003 Barcelona
2
Instituto Cajal, 28002 Madrid
3
Depto. Fisiología y Farmacología, Universidad de Cantabria,
39011 Santander
4
Depto. Ciencias Experimentales y Salud, Universitat Pompeu Fabra,
Barcelona
5
Vision, Touch & Hearing Research Centre, Dept. Physiology &
Pharmacology, School of Biomedical Sciences, The University
of Queensland, Australia
Trabajo ganador del VIII premio Ramon Trias Fargas de investigación médica sobre el síndrome de Down.
Correspondencia:
Mara Dierssen, MD, PhD
Programa Genes y Enfermedad
Centro de Regulación Genómica
Passeig Marítim, 37-49 - 08003 Barcelona, España
Tel.: +34 93 2240900 - Fax:+34 93 2240899
E-mail: [email protected]
Resumen
percusiones de un tratamiento de enriquecimiento ambiental
sobre el fenotipo.
El síndrome de Down (SD) es la causa genética más frecuente de retraso mental, y afecta a 1 de cada 1000 recién nacidos en Europa. El estudio de las personas con SD proporciona la oportunidad de analizar la relación entre la
capacidad cognitiva, el genotipo y los aspectos neurobiológicos a través de diferentes niveles de análisis. La cuestión
fundamental es definir cómo el exceso de dosis de productos
génicos normales en interacción con el entorno dirige y altera la maduración neuronal y cómo estas alteraciones del
desarrollo repercuten en la conducta y en la actividad mental
del individuo. Pese a que el retraso mental muy probablemente implica anomalías anatómicas, químicas y neurofisiológicas, el mecanismo a través del cual la inteligencia se ve
afectada por este desarrollo anormal es desconocido. Se ha
argumentado la posibilidad de que las alteraciones dendríticas constituyen el correlato anatomopatológico más consistente de esta patología. Los estudios postmortem en SD describen disgenesia a nivel de las espinas dendríticas y
alteraciones en la arborización. Estas alteraciones dendríticas
parecen tener consecuencias específicas en la patogenia y la
evolución de las personas con SD, y se correlacionan hasta
cierto punto con la alteración cognitiva. El trabajo analiza las
alteraciones dendríticas de un modelo murino de SD y las re-
Palabras clave: Síndrome de Down. Modelos murinos.
Espinas dendríticas. Enriquecimiento ambiental. Ts65Dn
Cortical microarchitecture alterations in Ts65Dn mice,
an animal model for Down Syndrome: impact of environmental enrichment
Abstract
Down syndrome (DS) is the most common genetic disorder associated with mental retardation, affecting 1 in 1000
newborn children in Europe. Studies of DS population provide a rare opportunity to examine relationships between
cognition, genotype and brain neurobiology, allowing comparisons across these different levels of analysis. The crucial
question is to define how do excess of normal gene products
in interaction with the environment, direct and constrain neural maturation and how does this maldevelopment translate
into mind and behavior. Although mental retardation likely
involves anatomical, chemical and neurophysiological brain
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2003: vol. 7, núm. 2, pp. 18-25
REVISTA MÉDICA INTERNACIONAL SOBRE EL SÍNDROME DE DOWN
abnormalities, the mechanisms by which subnormal intelligence during development arise from these abnormalities are
difficult to discern. Dendritic abnormalities are the most consistent anatomical correlates of mental retardation. Earliest
descriptions of dendritic pathology in DS included dendritic
spine dysgenesis, and dendritic anomalies involving branches. Dendritic abnormalities appear to have specific consequences in the pathogenesis and evolution of DS brains,
which correlate to some extent with the cognitive profile.
The cortical microarchitecture of animal models and the impact of environmental enrichment on the phenotype, centered in dendritic abnormalities and plasticity, is analyzed.
Key words: Down syndrome. Mice models. Dendritic
spines. Environmental enrichment. Ts65Dn
Introducción
El síndrome de Down (SD) es el defecto genético más
frecuente asociado a retraso mental con una incidencia aproximada de 1 de cada 1000 recién nacidos en Europa [1]. Las
personas con SD presentan un fenotipo complejo con una serie de rasgos de penetrancia y expresividad variable. Además
de unos rasgos físicos y faciales característicos, el SD está
asociado clínicamente a un gran número de anomalías de las
que sólo dos de ellas se observan en la totalidad de los casos:
la discapacidad intelectual y las modificaciones neuropatológicas similares a las de la enfermedad de Alzheimer (EA).
Centrándose en los aspectos neuropatológicos del SD, se
han descrito anomalías estructurales y funcionales en el sistema nervioso central (SNC) que podrían dar como resultado
diversos tipos y grados de disfunción cognitiva y neurológica. Macroscópicamente, es frecuente apreciar una reducción en el tamaño del cerebro en su conjunto, con hipoplasia
de los lóbulos frontal y occipital y, en el 50% de los casos reducción de los lóbulos temporales, del hipocampo y del cerebelo, y del número y profundidad de las cisuras. Se han descrito heterotopías neuronales en la sustancia blanca en el
cerebelo y el vermis cerebeloso, que han sido atribuidas a un
retraso en la migración celular durante el desarrollo embrionario. Existe una disminución de la densidad neuronal, que
se concreta en un menor número de neuronas granulares en el
córtex [2] y una disminución en el número de neuronas hipotalámicas. Varios autores también han documentado anomalías en la diferenciación neuronal y en la migración celular
durante el desarrollo embrionario del SNC en las personas
con SD. Además, estudios en cultivos primarios de cerebros
con SD han demostrado alteraciones en la proliferación celular y en procesos relacionados con neurodegeneración. Así el
cerebro fetal de SD se caracteriza por una reducción del grosor de la corteza cerebral, una laminación alterada y una reducción de la densidad sináptica. A estas alteraciones se
añade la disgenesia de las espinas dendríticas, caracterizada
por una morfología anormal y una alteración de las propiedades de la membrana celular [3], [4], [5]. Clásicamente se
consideran dos hipótesis que justifican el desarrollo y maduración cerebral anormales del SD. Una de ellas asume que la
presencia de material genético en exceso produce un efecto
inespecífico, mientras que la hipótesis del efecto de dosis génica considera que el fenotipo anormal es consecuencia de la
disregulación de la expresión de genes del cromosoma 21 humano (HSA21), siendo los mejores candidatos aquellos localizados en la región mínima para el SD.
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Alteraciones dendríticas asociadas
al síndrome de Down
En estudios iniciales, se demostró que en la corteza motora de un niño de 18 meses con SD las espinas eran escasas
y mostraban alteraciones en la forma y en el tamaño. Un estudio más sistemático permitió constatar que estos cambios
se asociaban a vacuolización y necrosis cerebral, sugiriendo
la existencia de un proceso neurodegenerativo [3]. Posteriormente se comprobó que la reducción en el número de espinas
existía también en otras regiones cerebrales, como la corteza
cingular o el hipocampo, y afectaba fundamentalmente a los
segmentos distal y medio de las dendritas apicales, siendo
éste un fenotipo propio de SD y no un rasgo patológico inespecífico asociado a retraso mental [4]. Durante el desarrollo
pre y postnatal se observa además una reducción en la longitud tanto de las dendritas apicales como basilares. Este
efecto aparecía de forma mucho más llamativa en las dendritas apicales de las neuronas de la capa III de la corteza frontal [6]. Sin embargo, las alteraciones son progresivas, lo que
ha llevado a sugerir que la disgenesia de las espinas dendríticas sea la consecuencia de un proceso degenerativo que se
produzca en el periodo postnatal. En pacientes de edad avanzada con SD se observan estos mismos cambios, generalmente asociados a un proceso neurodegenerativo [6]. Las
más afectadas son las neuronas piramidales y no piramidales
de los córtices parietal y motor. En un estudio de Ferrer y
Gullotta [5], los autores observan que en neuronas piramidales de las áreas CA1–CA3 del hipocampo hay una reducción
significativa en el número de espinas, que afecta de forma
mucho más marcada a aquellos pacientes con SD que padecen enfermedad de Alzheimer, en particular en CA1.
Modelos murinos del síndrome
de Down
Las estrategias utilizadas para estudiar la relación genotipo/fenotipo de los genes del HSA21 en el ratón han sido
tres: I) la sobreexpresión de un único gen, o combinación de
genes, de este cromosoma; II) la introducción de fragmentos
grandes de DNA (YACs o BACs) en el genoma del ratón, y
III) la generación de ratones con una copia extra, ya sea completa o parcial, del cromosoma 16 murino (MMU16) que
comparte regiones de sintenia conservada con el HSA21.
Dentro de esta tercera categoría, el modelo más estudiado es
el Ts65Dn [7] que contiene en trisomía el segmento distal de
MMU16, desde Gabpa hasta Tmprss2. En el HSA21 esta región abarca 15,6 Mb y contiene la mitad de los genes descritos en este cromosoma. Aunque este ratón no presenta algunas de las alteraciones que con frecuencia se observan en el
SD, como son las anomalías cardíacas congénitas, sí muestra
otros rasgos fenotípicos (infertilidad masculina, anomalías
del esqueleto craneofacial, alteraciones del metabolismo y
del comportamiento) que se asemejan a los que definen este
síndrome [8]. Este ratón presenta deficiencias cognitivas,
que incluyen tanto memoria de referencia espacial como memoria de trabajo y memoria reciente [9], [10], [11] que dependen de la integridad funcional del hipocampo. Aunque a
nivel morfológico no se han descrito alteraciones importantes en la organización estructural del cerebro de estos ratones, sí que se han observado fenotipos concretos como una
SD
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reducción del volumen de CA2 y de celularidad en el giro
dentado del hipocampo [12], [13], con consecuencias funcionales reflejadas en el deterioro de la formación de LTP.
Las capas granular interna y molecular del cerebelo de ratones trisómicos también presentan una disminución significativa de volumen y celularidad [14]. Además, algunos de los
rasgos fenotípicos característicos de la EA, como son la pérdida prematura de neuronas colinérgicas en el núcleo septal
basal y astrogliosis moderada, se manifiestan también en este
modelo. En lo que se refiere a los aspectos neuroquímicos, la
organización neuroanatómica de diferentes sistemas de neurotransmisión, como el sistema colinérgico, noradrenérgico,
serotoninérgico o dopaminérgico, no presenta alteraciones
en estudios inmunohistoquímicos. Sin embargo, el estudio de
la funcionalidad de sistemas efectores celulares ha mostrado
importantes alteraciones en la producción de AMP cíclico y
PCL en diversas áreas cerebrales [15], [16]. La alteración de
los sistemas de segundos mensajeros constituye un factor de
gran importancia en la dinámica de la comunicación intercelular.
La función cortical en el síndrome
de Down
Cada vez hay más pruebas de que las funciones asociadas
con los córtices prefrontales, llamadas funciones ejecutivas,
juegan un papel central en el desarrollo cognitivo normal y
anómalo. Las funciones ejecutivas están implicadas en las diferencias individuales y de desarrollo en la cognición, por lo
que se ha propuesto que en la base de distintos tipos de discapacidad intelectual podría existir un déficit en estas funciones.
Algunas de las alteraciones que presentan las personas con
SD, como son el menor tamaño del cerebro, las anomalías en
la morfología dendrítica y la reducción en el número de espinas, podrían dañar la función de los córtices prefrontales. Los
niños con SD tienen más dificultades para inhibir la conducta
que los niños genéticamente normales, además de mostrar
problemas para mantener la atención y en la planificación de
acciones. En roedores, la hiperactividad y la falta de inhibición de la respuesta depende en gran medida de déficits en el
funcionamiento del córtex prefrontal. Los ratones Ts65Dn no
son totalmente incapaces de inhibir la conducta, tal y como
muestra su adecuada ejecución en determinadas tareas conductuales, lo que indica que más que una falta de función hay
déficits funcionales concretos en el córtex prefrontal. La hiperactividad y la falta de flexibilidad conductual observada en
estos ratones trisómicos puede ser debida a incapacidad para
inhibir la actividad, una de las funciones ejecutivas controladas por la corteza prefrontal, ya que son hiperactivos en situaciones que provocan precaución en ratones normales, tales
como la iluminación en el campo abierto, o los brazos abiertos
del laberinto elevado en cruz, y una situación llena de estímulos nuevos como puede ser el enriquecimiento ambiental.
Enriquecimiento ambiental
Al contrario que las personas con un desarrollo normal,
los niños con SD presentan un incremento más lento de su
edad mental, lo que significa una disminución progresiva inicialmente del cociente de desarrollo durante el primer año de
vida, y posteriormente del cociente intelectual (CI), con una
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relación edad mental/edad cronológica que no es constante.
En adultos, el CI está en el rango de retraso mental de moderado a grave (CI = 25-55), con un límite superior de edad
mental alrededor de los 7-8 años; si bien en algunas personas
con SD el CI está en el rango normal (CI=70-80). Los bajos
índices de CI se corresponden con un retraso mental generalizado, con retrasos en el desarrollo del habla y el lenguaje (articulación, fonología, sintaxis expresiva, etc.). Los programas
de intervención temprana han demostrado tener una influencia positiva a corto plazo en niños con SD [17]. Sin embargo,
los resultados a largo plazo son más cuestionables y menos
constantes. Por otro lado, se desconocen las bases biológicas
de la mejoría observada en esta patología tras los programas
de intervención temprana. La posibilidad de replicar este
abordaje terapéutico en el modelo Ts65Dn, recientemente
abordado por Martínez-Cué et al. [18], ha permitido estudiar
las consecuencias del enriquecimiento ambiental sobre la organización de circuitos cerebrales en la corteza frontal del ratón Ts65Dn. Se sabe que la exposición temprana a un ambiente enriquecido da lugar en roedores a modificaciones
tanto conductuales como morfológicas o neuroquímicas. Las
modificaciones estructurales pueden afectar a áreas tanto corticales como no corticales, y se traducen en un incremento en
la arborización dendrítica y en el número de espinas [19]. Sin
embargo, es la primera vez que se utilizan modelos experimentales de SD, un trastorno cerebral que produciría un profundo déficit en la plasticidad neuronal, para estudiar las consecuencias in vivo del enriquecimiento ambiental.
Material y métodos
Animales
Los animales utilizados en el estudio proceden de retrocruzamientos sucesivos de hembras Ts65Dn con machos híbridos F1 C57/6Ei x C3H/HeSnJ (B6EiC3). La generación
parental se obtuvo del Jackson Laboratory (Bar Harbor,
USA). Los cruces de los ratones Ts65Dn se realizaron en el
Laboratorio de Biología del Desarrollo (Universidad de Cantabria, Santander). Como controles se utilizaron animales
hermanos de camada no trisómicos. Todos los experimentos
se realizaron de acuerdo con la normativa española y europea de manejo de animales de laboratorio y todos los procedimientos fueron previamente aprobados por el Comité de
Experimentación Animal.
Enriquecimiento ambiental
Tras el destete (día 21 postnatal) se separaron los animales por sexo y un número igual de ratones Ts65Dn y control
se asignaron de forma aleatoria a los grupos sometidos a enriquecimiento (EE) o estabulados en condiciones estándar
(NE). Los ratones NE se estabularon en grupos de dos o tres
ratones por jaula (plexiglás 20x12x12 cm; 20 2ºC; ciclo
luz/oscuridad de 12 horas), con libre acceso a la comida y
bebida. En condiciones de enriquecimiento ambiental se estabularon los ratones en grupos de ocho, en jaulas de gran tamaño (42x50x20 cm) con varios niveles, escaleras y paredes
laterales y posterior lisas en condiciones ambientales estándar (20 2ºC; ciclo luz/oscuridad de 12 horas). En la jaula
había una rueda de actividad, un columpio, barras de madera
y juguetes de plástico que proporcionaban estímulos senso-
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riales de diferentes categorías y que se renovaban cada dos
días. En condiciones EE los ratones recibían diferentes tipos
de comida, pero su acceso requería el aprendizaje de conductas novedosas. Cada semana se cambiaba, asimismo, el
material del lecho de la jaula. Los animales EE se mantuvieron en estas condiciones ambientales de las 3 a las 10 semanas de edad, siendo posteriormente estabulados en condiciones estándar hasta el momento de realizar los experimentos.
El efecto del enriquecimiento se comprobó en diferentes tareas conductuales [18].
Procesamiento del tejido
Los experimentos neuromorfológicos se realizaron
cuando los animales contaban con un año de edad, debido a la
necesidad de realizar previamente experimentos conductuales
que permitieran comprobar el éxito del tratamiento ambiental.
Únicamente se utilizaron hembras puesto que solamente se
obtuvieron efectos positivos en este sexo [18]. Los animales
se sacrificaron mediante inyección letal de pentobarbital sódico y se perfundieron con paraformaldehido al 4% (0.1 M,
pH 7.4, PF). Se extrajo el cerebro y la corteza cerebral del hemisferio izquierdo se aplanó entre dos portaobjetos de cristal,
se pesó y se dejó en PF a 4 °C durante toda la noche. Se realizaron secciones tangenciales a la superficie cortical (150
m), mediante vibratomo, que se preincubaron con 10-5 M
4,6 diamidino-2-fenilindol (Sigma D9542). A través de las
secciones transversales se identificaron las diferencias en citoarquitectura entre las capas corticales, lo que permitió escoger la sección que contenía la capa III donde se inyectaron las
células piramidales. La metodología para la inyección celular
ha sido ampliamente descrita con anterioridad [20]. Brevemente, se procedió a la inyección de células individuales con
Lucifer Yellow (8% in 0.1 M Tris buffer, pH 7.4) mediante el
paso de una corriente eléctrica. Esta corriente se aplicó hasta
conseguir fluorescencia en los extremos de las dendritas en
cada célula. Tras la inyección, las secciones se procesaron
con un anticuerpo anti Lucifer Yellow (1:400000 en solución
de stock [2% seroalbúmina bovina (Sigma A3425), 1% Triton X-100 (BDH 30632), 5% sacarosa en tampón fosfato 0.1
mol/l]), y posteriormente con un anticuerpo secundario específico biotinilado (Amersham RPN 1004; 1:200 en solución
de stock), seguido de un complejo biotina – peroxidasa de rábano (Amersham RPN1051; 1:200 en tampón fosfato). Como
cromógeno se utilizó DAB (3,3’-diaminobenzidina; Sigma D
8001) (Fig. 1). Se fotografiaron las secciones antes y después
del ensayo immunohistoquímico como control de un posible
encogimiento del tejido, con el fin de aplicar un factor de corrección en caso necesario.
Análisis morfológico
Solamente se incluyeron en el análisis aquellas células
que poseían una dendrita apical claramente distinguible, el
árbol dendrítico basal completo incluido en la sección y las
dendritas completamente llenas de contraste. Más aún, dado
que la estructura de las células piramidales varía entre las diferentes regiones corticales, únicamente se incluyeron en el
análisis las células piramidales inyectadas en la misma zona
de la corteza frontal. Se dibujaron las células en cámara clara
y el tamaño del árbol dendrítico basal se determinó calculando el área contenida en un polígono que abarca los extre-
Fig. 1. A, B Microfotografías de las células piramidales de la capa III inyectadas con Lucifer Yellow en secciones de 150 µm, paralelas a la superficie de la
corteza cerebral. C Microfotografía de una dendrita de proyección horizontal
para ilustrar las espinas dendríticas. Escala: 150 µm en A; 34 µm en B; 10 µm
en C.
mos más distales de las dendritas. El patrón de arborización
se determinó por contaje del número de intersecciones establecidas entre las dendritas y una plantilla con círculos concéntricos de radio creciente (25 m de incremento) centrada
en el soma celular. La longitud total de todas las dendritas de
cada célula se determinó con ayuda de un sistema digitalizado de medida (SummaSketch III) y un software de análisis
de imagen (NIH Research Services, Bethesda, MD). La densidad de las espinas dendríticas se determinó por contaje del
número de espinas en segmentos de 10 m en 20 dendritas
de proyección horizontal de diferentes células seleccionadas
aleatoriamente. En el análisis se incluyeron todos los tipos de
espinas sin diferenciar entre ellos. El número total de espinas
se calculó multiplicando el número medio de espinas en una
porción determinada de la dendrita por el número medio de
ramas halladas en la misma región, realizando la misma operación en todos los segmentos del árbol dendrítico.
Resultados
Ratones control y Ts65Dn en condiciones ambientales
estándar (NE)
(a) Tamaño del árbol dendrítico
En el análisis se incluyeron 180 neuronas piramidales. A
la inspección inicial se pudo observar que los árboles dendríticos basales de las células piramidales de la capa III eran
claramente diferentes en los ratones Ts65Dn comparados
con los control (Fig. 2). La cuantificación del tamaño del árbol (Fig. 3A) reveló una marcada reducción del tamaño en
los ratones trisómicos respecto a los controles (3.0 0.6
x104 m2 vs 5.05 1.1 x104 m2, respectivamente; t(81) =
9.9; P < 0.001).
(b) Patrón de arborización y longitud de las dendritas
La cuantificación del número de ramificaciones dendríticas (Fig. 3B) reveló que el punto de máxima complejidad en
los árboles dendríticos del Ts65Dn (23.25 4.23) era menor
que en los no trisómicos (25.19 5.9) siendo esta diferencia
estadísticamente significativa (F(1.81) = 14.5, P < 0.001). El
SD
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ciones ambientales estándar NE, el tamaño del árbol dendrítico basal de las células piramidales (Fig. 3A) en los ratones
EE Ts65Dn (3.25 0.6 x104 m2) era significativamente
menor que el de los controles EE (5.05 1.1 x104 m2; t(94)
= 13.6; P < 0.001). El enriquecimiento ambiental no produjo
un efecto significativo en este parámetro ni en los animales
control (t(74) = 1.6, P = 0.053) ni en los ratones Ts65Dn (t(101)
= 1.8, P = 0.064).
(b) Patrón de arborización y longitud de las dendritas
La cuantificación del número de ramificaciones de las células piramidales de la capa III (Fig. 3B) reveló que la máxima complejidad de la arborización en los ratones Ts65Dn
enriquecidos (23.8 4.58) estaba reducida frente a los controles (28.5 6.1). El análisis del árbol dendrítico completo
reveló diferencias significativas en los patrones de arborización entre ambos genotipos (F(1.94) = 109.8, P < 0.001). El enriquecimiento ambiental dio lugar a un incremento significativo del número de ramificaciones dendríticas en los
animales control (F(1.74) = 43.3, P < 0.001) pero no en los trisómicos (F(1.101) = 3.8, P = 0.052). La longitud de las dendritas resultó ser significativamente menor en los ratones trisómico EE que en los controles EE (2.02 0.44 x103 m y
3.14 0.61 x103 m, respectivamente; t(94) = 9.8, P < 0.001)
(Fig. 3C), pero este parámetro no se modificó con el enriquecimiento ambiental ni en los ratones no trisómicos ni en
los trisómicos (t(74) = 1.3, P = 0.2; t(101) = 1.2, P = 0.24, respectivamente).
(c) Distribución y número de espinas
Fig. 2. Dibujos en cámara clara de las neuronas piramidales de la capa III, tal
y como se observan en el plano de una sección tangencial a las capas corticales de ratones no trisómicos y Ts65Dn. Escala = 100 µm.
análisis de la longitud dendrítica (Fig. 3C) reveló que las
dendritas de los ratones Ts65Dn eran significativamente menores que en los controles (1.92 0.31 x103 m y 3.35 0.73 x103 m, respectivamente; t(81) = 11.2; P < 0.001).
(c) Distribución y número de espinas
El número máximo de espinas en segmentos de 10 m
fue de 19.1 4.12 en las células de los ratones Ts65Dn y
18.1 5.49 en los animales control (Fig. 3D). El análisis de
la varianza de medidas repetidas de la distribución de las espinas a lo largo de la dendrita en función de la distancia al
soma mostró que las diferencias entre los dos grupos de animales eran estadísticamente significativas (F(1.78) = 81.6, P =
0.001). La combinación de los datos del análisis de Sholl con
la densidad de las espinas permitió calcular una estimación
del número total de espinas en una célula tipo. Estos cálculos
revelaron que los animales trisómicos tenían un 24% menos
de espinas (Fig. 3E) en sus árboles dendríticos basales
(2603) que los ratones control (3447).
Ratones control y Ts65Dn en condiciones ambientales
enriquecidas (EE)
(a) Tamaño del árbol dendrítico
Al igual que sucedía con los animales criados en condi-
La cuantificación de las espinas a lo largo de las dendritas basales (Fig. 3D) reveló que la máxima densidad de espinas en los ratones Ts65Dn EE (20.4 4.4) era menor que en
los control EE (25.7 6.4) siendo la distribución de las espinas significativamente diferente entre los grupos de los dos
genotipos sometidos a enriquecimiento ambiental (F(1.58) =
78.4, P < 0.001). El enriquecimiento ambiental produjo un
efecto impactante sobre la densidad de espinas dendríticas en
animales control (F(1.58) = 14.9, P < 0.001) pero no en los
Ts65Dn (F(1.78) = 2.6, P = 0.11). El enriquecimiento ambiental incrementó el número total de espinas en más del 32% en
los ratones control y, solamente, en un 3% en los Ts65Dn
(Fig. 3E). Como consecuencia, las células piramidales en los
ratones Ts65Dn sometidos a EE presentaban significativamente menos espinas (2683) que los controles EE (5050).
Discusión
Numerosos estudios han demostrado que el enriquecimiento ambiental es capaz de ejercer un efecto beneficioso
en ratones normales. Sin embargo, en el contexto de la rehabilitación funcional es importante saber si los trastornos cerebrales que se deben a anomalías genéticas y que pueden
afectar gravemente los mecanismos de plasticidad neuronal,
verán comprometida su capacidad para responder a la estimulación ambiental. Estudios previos habían revelado que el
ratón Ts65Dn es capaz de mejorar su función cognitiva
como consecuencia del enriquecimiento ambiental [18]. El
presente estudio se ha dirigido a conocer si dicha mejoría
cognitiva se debía a un cambio plástico en las neuronas piramidales de la capa III de la corteza frontal. Nuestro trabajo
SD
REVISTA MÉDICA INTERNACIONAL SOBRE EL SÍNDROME DE DOWN
Área (x103 µm)
2003: vol. 7, núm. 2, pp. 18-25
no enriquecidas
enriquecidas
N.o de ramificaciones
Ts65Dn
no enriquecidas: control
enriquecidas: control
trisómicos no enriquecidos
trisómicos enriquecidos
Distancia al soma (µm)
Control
Ts65Dn
N.o de espinas
Longitud (x103 µm)
corticales se hallan alterados en el ratón Ts65Dn. La trisomía, por tanto, parece afectar también la capacidad de neuroplasticidad del cerebro trisómico.
El ratón Ts65Dn como modelo experimental de síndrome
de Down
Control
Distancia al soma (µm)
N.o de espinas (x103)
23
Control
La mayor parte de las características genéticas, conductuales y anatómicas observadas en el ratón Ts65Dn están
presentes en las personas con SD [21], [8]. Ambos casos se
caracterizan por presentar en trisomía una región cromosómica homóloga, una capacidad de aprendizaje y memoria alteradas y una estructura cerebral con diversas anomalías [9],
[10], [11]. Además, el ratón Ts65Dn presenta patrones de alteración conductual compatibles con una disfunción en la
corteza prefrontal [9]. En este sentido, resulta de especial interés el estudio de la morfología de las células piramidales,
que constituyen el tipo celular más ubicuo en la neocorteza.
Nuestros resultados muestran alteraciones del fenotipo de la
neuronas piramidales en los ratones trisómicos similares a
las descritas en personas con SD. Los estudios de material
autópsico han revelado alteraciones dendríticas en sus cerebros, caracterizadas por una reducción del número de espinas, que se produce fundamentalmente durante el período
postnatal tardío [3], [4], [5]. Nosotros encontramos que las
neuronas piramidales de los ratones Ts65Dn poseen, como
promedio, un 24% menos de espinas dendríticas que las de
sus homólogos no trisómicos. Por tanto, se pueden plantear
dos posibles hipótesis: por un lado, la existencia de diferencias fundamentales en el desarrollo cortical, de forma que los
ratones trisómicos nunca llegan a tener dendritas tan espinosas como los controles; o bien, que las espinas se pierdan
más rápidamente con la edad, como consecuencia de un proceso neurodegenerativo. Dada la alteración cromosómica
subyacente en el humano con SD y en el ratón Ts65Dn, es
posible sugerir la existencia de una relación entre ambos fenotipos. Así pues, este modelo murino proporciona un medio
experimental para el estudio de la patología cerebral y, en
concreto, de la patología dendrítica presente en las personas
con SD. Ello proporciona además la oportunidad de analizar
los cambios que se pueden producir mediante terapias rehabilitadoras farmacológicas y no farmacológicas sobre la patología dendrítica, que se ha llegado a considerar uno de
los sustratos microanatómicos de la discapacidad intelectual [21].
Ts65Dn
Fig. 3. Gráficos correspondientes al área del árbol dendrítico basal (A), número
de ramificaciones del árbol dendrítico (B), longitud de las dendritas (C), densidad de espinas dendríticas (D) número de espinas (E) en las neuronas piramidales de la capa III de ratones trisómicos y no trisómicos criados en condiciones estándar (NE) y en condiciones de enriquecimiento ambiental (EE).
muestra diferencias notables en el fenotipo de estas células
entre los ratones trisómicos y control, de forma que las de los
primeros son más pequeñas y poseen una arborización dendrítica menos compleja. El hallazgo más significativo de
nuestros experimentos es, sin duda, el hecho de que el enriquecimiento ambiental fue capaz de producir un efecto muy
importante en las células piramidales de los animales control, pero no modificó el fenotipo de esas neuronas en los ratones trisómicos. Estos datos sugieren que los mecanismos
que gobiernan el desarrollo y maduración de los circuitos
Efectos del enriquecimiento ambiental en el cerebro
del ratón Ts65Dn
En animales normales, el enriquecimiento ambiental produce una serie de consecuencias conductuales, fisiológicas,
neuroquímicas y neuromorfológicas. Los animales sometidos a paradigmas de enriquecimiento ambiental presentan
una mejoría sustancial en tareas de memoria, aprendizaje y
agudeza visual. Se cree que estas mejorías cognitivo-conductuales son el resultado de cambios en la conectividad y,
por tanto, en la distribución de las conexiones neurales. Así,
se ha podido correlacionar la mejoría en determinadas tareas
conductuales de aprendizaje y memoria con incrementos en
la complejidad de la arborización de las células piramidales
y de la relación sinapsis / neurona. Nosotros encontramos
que el paradigma de enriquecimiento ambiental que hemos
SD
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REVISTA MÉDICA INTERNACIONAL SOBRE EL SÍNDROME DE DOWN
utilizado produce un efecto impactante sobre la estructura de
las células piramidales en los animales no trisómicos. Solamente tres semanas de exposición a un entorno enriquecido
durante el desarrollo postnatal tardío dieron lugar a un incremento muy importante del número de espinas dendríticas,
que fue del 32% respecto a los animales no trisómicos que
fueron criados en un ambiente estándar de laboratorio (ver
métodos). Nuestros resultados en el ratón trisómico, por el
contrario, revelan un incremento en el número de espinas
únicamente del 3%, que no resultó significativo. Estos datos
pueden interpretarse como una falta de respuesta al enriquecimiento ambiental en el trisómico, debida posiblemente a
los cambios genéticos que lo diferencian de los animales
control de la misma cepa, o bien, como una falta de estabilidad de la respuesta obtenida, de forma que las espinas se
pierdan más rápidamente que en los animales no trisómicos,
como consecuencia de alteraciones en los procesos de neuroplasticidad. Cada espina dendrítica recibe al menos una sinapsis asimétrica glutamatérgica, de forma que una neurona
con dendritas más espinosas integraría más información que
una con una menor dotación en espinas. Se ha demostrado
que las diferencias en el patrón de arborización de los árboles dendríticos de las células piramidales tienen una influencia decisiva en el proceso de compartimentalización de la información y en la potencia de representación de las neuronas
corticales. Por tanto, las diferencias reveladas en nuestro estudio con gran probabilidad afectarán la función cortical
tanto a nivel celular como a nivel de sistemas [22]. Por ejemplo, los estudios realizados en la corteza cerebral de primates
superiores han permitido evidenciar que las células piramidales del córtex prefrontal poseen una arborización más
compleja y dendritas más espinosas que las de la corteza asociativa sensorial y que éstas, a su vez, son más complejas y
poseen una mayor dotación de espinosas que las de la corteza sensorial [22], [23]. Así, pues, de acuerdo con los datos
disponibles, se puede establecer una relación entre la capacidad de procesamiento de la información, una función fundamental a la hora de establecer las funciones cognitivas, y la
citoarquitectura de la corteza cerebral.
Nuestros estudios previos habían revelado que el ratón
Ts65Dn es capaz de mejorar su función cognitiva como consecuencia del enriquecimiento ambiental [18]. Sin embargo,
no presentan modificaciones neuromorfológicas asociadas a
estos cambios, al contrario de lo que sucede en ratones no trisómicos, en los que los cambios morfológicos producidos
por el mismo paradigma de enriquecimiento ambiental son
marcados y similares a los que previamente se habían descrito en la literatura [24]. En un primer análisis, se podría argumentar que los cambios conductuales observados en los
ratones trisómicos no se producen como consecuencia de un
cambio plástico en el árbol dendrítico. Podrían proponerse
dos posibles explicaciones para este resultado: I) que en el
ratón trisómico, los cambios producidos por el enriquecimiento ambiental fuesen menos estables y se perdiesen con
el tiempo, o bien, II) que el enriquecimiento no llegase a producir cambios neuromorfológicos y, por tanto, los efectos
conductuales dependieran de modificaciones en sistemas de
señalización celular no observables en el fenotipo de las neuronas piramidales corticales. Serán necesarios estudios sistemáticos de los componentes pre y postsinápticos en múltiples regiones corticales y en diferentes estadios para poder
determinar el impacto de la manipulación ambiental y la estabilidad de sus efectos sobre la citoarquitectura y la estructura y función sinápticas en el cerebro con SD.
2003: vol. 7, núm. 2, pp. 18-25
Conclusiones
Las alteraciones en la estructura dendrítica se asocian en
el humano con diferentes formas de retraso mental, y son en
algunos casos la única patología evidenciable. Por otro lado,
se trata de estructuras que responden a manipulaciones ambientales y se han considerado el sustrato neuroanatómico de
los cambios cognitivo-conductuales obtenidos tras los tratamientos ambientales. El trabajo que se presenta ha permitido
establecer un estrecho paralelismo entre el fenotipo de las
neuronas piramidales de la corteza cerebral frontal entre el ratón Ts65Dn y las personas con SD. Esta relación podría ser el
resultado de la trisomía de una región cromosómica homóloga que contiene genes que posiblemente tienen una conservación evolutiva de su función. Así, en el ratón Ts65Dn la trisomía de la región cromosómica situada entre App y Mx1
tiene una profunda influencia sobre la micro-organización de
los circuitos neocorticales. Los datos presentados no permiten
dilucidar si tal efecto es consecuencia de un mal desarrollo o
de un proceso degenerativo. Por otra parte, nuestro trabajo
denota una alteración en la neuroplasticidad y, por tanto, en
los mecanismos que posee el cerebro para adaptarse a su entorno y a los cambios que en éste se producen. Serán necesarios estudios en modelos murinos de sobrexpresión de un gen
único para disecar la patología molecular subyacente a las alteraciones celulares observadas en el SD.
Agradecimientos
Los autores agradecen la ayuda prestada por Jerôme Lejeune Foundation, DURSI, CEC/BIOMED2 (BMH4-CT983039), CICYT (SAF99-0450-C02, SAF2001-1231), DGCYT
(PM99-0105), FIS (00/0795), Fundación Marcelino Botín,
Australian National Health and Medical Research Council
(GNE), Comunidad Autónoma de Madrid (RB-P, 01/0782/
2000) y Real Patronato de Atención a Minusvalías (CM-C).
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Póster publicado por la FCSD con motivo del Año Europeo de las personas con discapacidad.