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Evaluación del crecimiento sobre dibutil ftalato de cepas de
hongos aislados del proceso de reciclado de una industria
productora de papel
*Miriam Ahuactzin Pérez 1,2,3, José Luis Torres García 1,3, Adriana Madrid Ramírez 1,3, Gerardo
Díaz Godínez1, Carmen Sánchez Hernández1
1
Laboratorio de biotecnología, centro de investigación en ciencias biológicas, Universidad Autónoma
de Tlaxcala, Tlaxcala CP 90062, Mexico; 2 Maestría en Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de
Tlaxcala, México 3Laboratorio de Microbiología, lic. en biología, Universidad Autónoma de Tlaxcala.
email:[email protected]
*Miriam Ahuactzin Pérez
+Carmen Sánchez, [email protected], Tel/Fax +52 2484815482
Biorremediación
Resumen
Los ftalatos o esteres de ftalatos son plastificantes ampliamente utilizados en la manufactura de
plásticos y son comúnmente descargados al ecosistema por las industrias de papel y plástico durante el
proceso de manufactura contribuyendo a la contaminación ambiental. El dibutil ftalato es uno de los
ftalatos más utilizados. La velocidad radial y la velocidad especifica de crecimiento de Neurospora sp.,
Hypocrea lixxi y Aspergillus niger fueron evaluadas en medios de cultivo conteniendo diferentes
concentraciones de dibutil ftalato (DBF). La CI 50 de DBF en estos hongos fue evaluada en el
sobrenadante de los medios de cultivo conteniendo este compuesto. La toxicidad se evaluó utilizando la
bacteria E. coli.
Palabras clave: Dibutil ftalato, toxicidad, CI50
Abstract
Phthalate and phthalate esters are plasticizers widely used in the manufacture of plastics and are often
discharged by the paper and plastics industries during the manufacturing processes into de ecosystem,
contributing to the environmental pollution. Dibutyl phthalate is one of the most widely used
phthalates. Radial growth and specific growth rate of Neurospora sp, Hypocrea lixxi and Aspergillus
niger were evaluated in media containing different concentration of dibutil phthalate (DBP). IC 50 of
DBP on these fungi was evaluated in the supernatant of cultures grown on this compound. Toxicity was
evaluated using the bacterium E. coli.
Key words: Dibutyl phthalate, toxicity, IC50
1. Introducción
Los ftalatos son ésteres aromáticos derivados del ácido ftálico [1]. Asimismo, son líquidos claros de
aspecto aceitoso, poco solubles en agua y con una volatilidad baja. Presentan principalmente dos
cadenas laterales alifáticas o lineales pero también pueden presentar grupos ramificados, cicloalifáticos
o aromáticos [2]. Estos compuestos químicos proporcionan flexibilidad y maleabilidad tanto en la
manufactura del proceso como al producto final. Se utilizan ampliamente como plastificantes en la
producción de PVC. Además, se usan en la manufactura de plásticos, textiles, papel, repelente contra
insectos, pesticidas, cosméticos, polivinil acetatos y poliuretanos [3, 4, 2, 5]. Seis ftalatos se han
designado como contaminantes por la Environmental Protection Agency (EPA): dibutil ftalato (DBF),
dimetil ftalato (DMF), dietil ftalato (DEF), butil bencil ftalato (BBzF), di-n- octil ftalato (DnOF) y
dietilhexil ftalato (DEHF) [6]. El DBF, cuando se emplea como plastificante, no forma enlaces
covalentes con el plástico por lo tanto se libera al ambiente con el tiempo y con el uso [7]. Se ha
reportado que las altas concentraciones del tóxico en el ambiente se encuentran mayoritariamente en las
aguas residuales y superficiales cercanas a las zonas de producción y procesado [8]. Este plastificantes
se acumula en invertebrados, peces y plantas. Existen reportes de hepatotoxicidad, atrofia testicular,
teratogénesis y carcinogénesis relacionados con ftalatos [9, 10]. De acuerdo con la FDA, la CI50
representa (cuantitativamente) la concentración de la sustancia utilizada que es requerida para inhibir el
50% del crecimiento microbiano en un experimento in vitro [11, 12]. Se ha reportado la CI50 de DEF
para E. coli, Aspergillus niger y Staphylococcus aureus. La CI50 la definieron como la concentración de
DEF que inhibe el 50% de la tasa de crecimiento microbiano [11]. Para reducir los efectos dañinos de
DBF es necesario degradarlo y mineralizarlo [13]. Existen investigaciones acerca de la degradación de
DBF de manera biológica [3]. Sin embargo, existen muy pocos estudios sobre la degradación de
ftalatos empleando hongos del género ascomiceto y sobre la toxicidad de los compuestos obtenidos
después del crecimiento de los hongos en estos contaminantes. Por lo que en este trabajo se estudiará el
crecimiento de Neurospora sp, Hypocrea lixii y Aspergillus niger en DBF con el objeto de determinar
si estas cepas emplean este compuesto como fuente de carbono y energía y si los compuestos generados
después de la fermentación líquida son tóxicos para la bacteria Escherichia coli.
2. Materiales y Métodos
Organismos
Tres cepas fueron usadas en este estudio; Neurospora sp, Aspergillus niger e Hypocrea lixii, aisladas
de una industria productora de papel. Estas cepas se hicieron crecer en agar extracto de malta (EMA)
en la oscuridad a 25°C y almacenadas a 40°C. Las cepas fueron transferidas periódicamente a un medio
de cultivo fresco. En todos los experimentos, los pellets (4 mm de diámetro) de la periferia de las
colonias en extracto de malta fueron usados como inoculo.
Medio y condiciones de cultivo
Se prepararon tres medios de cultivo diferentes; C1) medio sin adición de ftalato (MSM), C2) MSM +
1000 mg/l de DBF y, C3) MSM + 500 mg/l de DBF. El MSM se preparó por litro de agua con 1.0 g de
(NH4)2SO4, 0.3 g de CaH4 (PO4), 0.02 g de FeSO4, 0.02 g de ZnSO4 y 0.02 g de MnSO4. Se ajusto el
pH a 6.0 utilizando HCL 3 M , se a completo después del tratamiento en el autoclave, (121 ° C durante
15 min) con 0,1% (v / v) DEHF. El medio se sometió a sonicación durante aproximadamente 3
minutos, utilizando una disruptor célular (Misonix, Inc., EE.UU.) hasta que el DBF se habían
dispersado completamente. Todos los Experimentos se realizaron separadamente y por triplicado.
Velocidad de crecimiento radial y biomasa
La velocidad de crecimiento radial (Vr, mm h-1) se determinó en medio de cultivo sólido conteniendo
MSM, MSM + 500 mg/l de DBP y MSM + 1000 mg/l de DBP. La Vr fue analizada por regresión
lineal y la pendiente de cada tratamiento fue registrada (en mm h -1, media ± desviación estándar).
Al final del avance radial del micelio se midió la biomasa por el método del peso seco [14].
Velocidad especifica de crecimiento
La velocidad específica de crecimiento (µ, h-1) se determinó en medio de cultivo líquido conteniendo
MSM, MSM + 500 mg/l de DBP y MSM + 1000 mg/l de DBP. El extracto enzimático (EE) fue
obtenido por filtración de los cultivos usando papel filtro ( Whatman No. 4), y la biomasa (X) fue
determinaa por diferencia de peso (g l-1) . La µ fue analizada por regresión lineal y la pendiente de cada
tratamiento fue registrada (en h-1, media ± desviación estándar).
Toxicidad de DBF
La toxicidad de DBF del hongo fue obtenida usando valores de concentración inhibitoria media CI50.
Para determinar la IC50 de DBF, se utilizaron seis medios de cultivo diferentes: agar R2 A (específico
para bacterias) conteniendo 0, 200, 500, 700, 1000 y 1200 mg/l de DBF respectivamente. Se
sembraron 4.63 E+9 colonias de E. coli en la caja de petri estéril y se agregó el agar con las diferentes
concentraciones de DBP utilizando el método de vertido en placa. Posteriormente, se incubaron a 37°C
durante 24 h para realizar el conteo de colonias viables. Para calcular la IC50, se graficó el log de la
concentración y las unidades probit del porcentaje de mortalidad utilizando el programa estadístico
GraphPad Prism 5 ©. Con los datos obtenidos se determinó la CI50 utilizando la ecuación de la línea
recta, donde y=CI50. Se estima con el modelo calculado el valor para un 50% de mortalidad. En
unidades Probit 50% corresponde a 5 [15]. Para determinar la toxicidad del sobrenadante de los cultivos
de la fermentación líquida se utilizó agar R2A (específico para bacterias) y 47.3 ml del sobrenadante
obtenido después de la filtración de la biomasa de los cultivos líquidos empleados para la
determinación de la µ. Los medios de cultivo se inocularon con 4.63 E+9 colonias de E. coli. Los
medios de cultivo se incubaron a 37 0C por 24 horas. El desarrollo de colonias se cuantificó con un
procesador de imágenes.
3. Resultados
Velocidad de crecimiento radial y biomasa
En la tabla 1 se muestra los valores medios de Vr, obtenida en los diferentes medios descritos
anteriormente. Se observó que para la cepa de Neurospora sp no existe diferencia de la Vr entre los
medios de cultivo conteniendo 1000 mg/l de DBF y 500 mg/l de DBF (P>0.05). Por el contrario para
los medios de cultivo de 1000 mg/l de DBF y el medio sin adición de ftalato; así como para el medio de
500 mg/l de DBF y el medio sin adición de ftalato se observó una diferencia significativa (P<0.0001).
Para el caso de la cepa de Hypocrea lixii se observó que no existe una diferencia significativa de la Vr
entre los medios de cultivo de 1000 y 500 mg/l de DBF (P>0.05). Por el contrario para los medios de
cultivo de 1000 mg/l de DBF y el medio sin adición de ftalato; así como para el medio de 500 mg/l
Para la cepa de Hypocrea lixii, se observó que no existe una diferencia significativa de la Vr en los tres
medios de cultivo utilizados (P=0.1717) Por otro lado, para la cepa de Aspergillus niger se observó
diferencia significativa entre los tres medios de cultivo (P<0.0001) con respecto a la Vr.
En la tabla 1 se muestra la biomasa micelial producida después de que la caja de Petri había sido
invadida por el sustrato de las tres cepas de hongos aisladas previamente de la industria productora de
papel, lo cual es un indicador del consumo de DBF. En la cepa de Neurospora sp se obtuvo menor
biomasa en el medio sin adición de ftalato. Asimismo, se observó mayor biomasa en el medio de 1000
mg/l de DBF en comparación con el de 500 mg/l. En el caso de la cepa de Hypocrea lixii se observó
mayor biomasa en el medio sin adición de DBF. En el medio de 1000 mg/l de DBF se obtuvo menor
biomasa que en el de 500 mg/l de DBF. En el caso de la cepa de Aspergillus niger se observó mayor
biomasa en el medio de 500 mg/l de DBF en comparación con los otros dos medios de cultivo. En el
medio de 1000 mg/l de DBF se observó mayor biomasa en comparación con el medio sin adición de
ftalato.
Velocidad de crecimiento especifica
En la tabla 1 se muestra la velocidad específica de crecimiento (µ, h-1). Para la cepa de Neurospora sp
se observó una µ mayor en el medio sin adición de ftalato en comparación con los otros dos medios de
cultivo. Asimismo, se observó mayor µ en el medio de 500 mg/l de DBF en comparación con el medio
de 1000 mg/l de DBF. Realizando el análisis estadístico (ANOVA de una vía) se observó que no existe
una diferencia significativa de la μ entre los tres medios de cultivo utilizados (P=0.0822). En el caso de
Hypocrea lixii se observó una µ mayor en el medio conteniendo 1000 mg/l de DBF en comparación
con los otros dos medios de cultivo. Asimismo, se observó mayor µ en el medio sin adición de ftalato
en comparación con el medio de 500 mg/l de DBF. Para la cepa de Aspergillus niger, se observó una µ
mayor en el medio conteniendo 500 mg/l de DBF en comparación con los otros dos medios de cultivo.
Asimismo, se observó mayor µ en el medio conteniendo 500 mg/l de DBF en comparación con el
medio sin adición de ftalato.
Tabla 1. Vr (mm/h), biomasa (mg/ml) y velocidad específica de crecimiento (h -1) de las tres cepas
de hongos filamentosos
Medios de cultivo
DBF (mg/l)
Sin adición de ftalato
Cepa
500
Neurospora sp
Vr (mm/h)
Biomasa
(mg/ml)
µ (h-1)
Vr (mm/h)
Biomasa
(mg/ml)
µ (h-1)
Vr (mm/h)
Biomasa
(mg/ml)
µ (h-1)
1.065±0.017
0.0573 ±0.030
0.0036±0.000
1.318±0.015
0.1073±0.045
0.0034±0.00
1.309±0.0
0.1133±0.02
0.0025±0.0006
04
03
2
0.0048±0.00
0.573±0.0
0.0613±0.03
08
01
0
0.0050±0.00
0.685±0.0
0.1327±0.11
07
05
6
3
Hypocrea lixii
0.742±0.019
0.1593±0.023
0.0055±0.000
0.555±0.005
0.0820±0.001
7
Aspergillus
niger
1000
0.327±0.003
0.1227±0.042
0.0014±0.000
05
0.715 ±0.015
0.1223±0.118
0.0060±0.0009
0.0039±0.0008
Toxicidad del DBF
Para la cepa de Neurospora sp. en el medio de 1000 mg/l de DBF se observó que a medida que pasaban
los días de fermentación aumentaba el número de colonias de E. coli. Es decir, se presentaron mayor
número de colonias de bacterias en el día 21 (1.6E10) en comparación con el primer día de la
fermentación (1.1E9). En el medio de 500 mg/l de DBF se observó que al igual que en el medio de
1000 mg/l de DBF a medida que pasaban los días de fermentación aumentaba el número de colonias
de E. coli. Es decir, se presentaron mayor número de colonias de bacterias en el día 21 (3.1E10) en
comparación con el primer día de la fermentación (6.0E8). En el medio sin adición de ftalato se
obtuvieron 3.07E9 colonias de E. coli durante los 21 días de le fermentación, mostrando un crecimiento
uniforme durante el tiempo que duró la fermentación líquida (Fig. 1). Se observó que de los tres medios
utilizados, en el medio conteniendo 500 mg/l de DBF se obtuvieron mayor número de colonias de E.
coli en el último día de la fermentación.
Fig. (1) Número de colonias de E. coli obtenidas a lo largo de la fermentación liquida en el
sobrenadante de los cultivos de Neurospora sp. desarrollado sobre 1000 mg/l de DBF (), 500 mg/l de
DBF (▲) y sin adición de ftalato (●).
Para la cepa de Hypocrea lixii en el medio de 1000 mg/l de DBF se observó que a medida que pasaban
los días de fermentación aumentaba el número de colonias de E. coli. Es decir, se presentaron mayor
número de colonias de bacterias en el día 21 (3.1E10) en comparación con el primer día de la
fermentación (2.0E8). En el medio de 500 mg/l de DBF se observó que al igual que en el medio de
1000 mg/l de DBF a medida que pasaban los días de fermentación aumentaba el número de colonias
de E. coli. Es decir, se presentaron mayor número de colonias de bacterias en el día 21 (2.9E10) en
comparación con el primer día de la fermentación (3.3E7). En el medio sin adición de ftalato se
obtuvieron 3.3E10 colonias de E. coli durante los 21 días de le fermentación, mostrando un crecimiento
uniforme durante el tiempo que duró la fermentación líquida (Fig. 2). Se observó que de los tres medios
utilizados, en el medio sin adición de ftalato se obtuvieron mayor número de colonias de E. coli en el
último día de la fermentación.
Fig. (2) Número de colonias de E. coli obtenidas a lo largo de la fermentación liquida en el
sobrenadante de los cultivos de Hypocrea lixii desarrollado sobre 1000 mg/l de DBF (), 500 mg/l de
DBF (▲) y sin adición de ftalato (●)
Para la cepa de Aspergillus niger en el medio de 1000 mg/l de DBF se observó que a medida que
pasaban los días de fermentación aumentaba el número de colonias de E. coli. Es decir, se presentaron
mayor número de colonias de bacterias en el día 21 (3.19E10) en comparación con el primer día de la
fermentación (6.7E7). En el medio de 500 mg/l de DBF se observó que al igual que en el medio de
1000 mg/l de DBF a medida que pasaban los días de fermentación aumentaba el número de colonias
de E. coli. Es decir, se presentaron mayor número de colonias de bacterias en el día 21 (3.06E10) en
comparación con el primer día de la fermentación (6.3E7). En el medio sin adición de ftalato se
obtuvieron 3.21E10 colonias de E. coli durante los 21 días de le fermentación, mostrando un
crecimiento uniforme durante el tiempo que duró la fermentación líquida (Fig. 3). Se observó que de
los tres medios utilizados, en el medio sin adición de ftalato se obtuvieron mayor número de colonias
de E. coli en el último día de la fermentación
Fig. (3) Número de colonias de E. coli obtenidas a lo largo de la fermentación liquida en el
sobrenadante de los cultivos de Aspergillus niger desarrollado sobre 1000 mg/l de DBF (), 500 mg/l
de DBF (▲) y sin adición de ftalato (●)
4. Discusión
[16]Observaron el efecto, en el crecimiento micelial del hongo Polyporus brumalis, del DBF a tres
diferentes concentraciones (250, 750 y 120 µM). Reportaron que en general, el crecimiento micelial
disminuyó conforme aumentaba la concentración de DBF. En el medio de 250 µM no reportaron una
inhibición significativa del crecimiento micelial. En los medio de 750 y 120 µM observaron una
inhibición significativa del crecimiento del hongo. Contrario a esto, los resultados obtenidos en esta
investigación muestran que las tres cepas de hongos aisladas previamente de la industria productora de
papel (Neurospora sp, Hypocrea lixii y Aspergillus niger) crecieron en los dos medios de cultivo a una
concentración de 1800 y 3500 µM de DBF (concentraciones más altas que las utilizadas en el estudio
de [16]. Por lo tanto, se muestra que estas cepas fueron capaces de utilizar el DBF como fuente de
carbono y energía. Se ha reportado que la adsorción física de DBF por el micelio ocurre gradualmente
conforme se incrementa el tiempo de incubación [16]. De esta manera, el hongo Neurospora sp,
mostró mayor Vr tanto en el medio de 1800 y 3500 DBF µM (500 y 1000 mg/l de DBF
respectivamente).
[17] Evaluó la densidad de biomasa producida al final del avance radial para tres cepas de hongos
aisladas de la industria productora de papel (Neurospora sp, Hypocrea lixii y Aspergillus niger).
Encontró que las cepas de Neurospora sp y Aspergillus niger mostraron un incremento de biomasa en
presencia de DEHF mostrando elevadas probabilidades de degradación y metabolización de DEHF.
Asimismo, la cepa de Neurospora sp y Aspergillus niger produjeron mayor biomasa en los medios
conteniendo 500 y 1000 mg/l de DBF. Estos resultados muestran que consumieron el compuesto como
fuente de carbono y energía para su crecimiento. Por el contrario, la cepa de Hypocrea lixii produjo
mayor biomasa en el medio sin adición de ftalato en comparación con el DEHF, en el cual esta cepa
produjo mayor biomasa en el medio conteniendo 1000 mg/l de DEHF [17].
En un trabajo previo, se utilizó la bacteria E. coli para estudios de degradación y toxicidad de los
productos de DEHF. En este trabajo, utilizaron 500 mg/l de DEHF. Observaron que el ftalato fue
degradado alrededor del 90% por la acción de la enzima cutinasa (aislada de un ascomiceto).
Encontraron que los productos de degradación utilizando cutinasa no resultaron tóxicos para la bacteria
E. coli pues no se encontró daño proteico ni estrés oxidativo. En este trabajo reportaron que los hongos
filamentosos presentes en el suelo (Aspergillus y Trichoderma) son productores de cutinasas [18]. En
este trabajo, se observó que a medida que pasaban los días de fermentación, el número de colonias de la
bacteria E. coli aumentaba lo que muestra que el sobrenadante del día 21 resulto ser menos inhibitorio
en comparación con los otros días de fermentación, ya que los primero días de incubación inhibieron el
crecimiento bacteriano. Se observó mayor número de colonias de E. coli (en el día 21 de la
fermentación) para el medio de 1000 mg/l de DBF en las tres cepas de hongos estudiadas. Por lo
anterior, estos resultados demuestran que el hongo degrada el DBF y lo utiliza como fuente de carbono.
Además, los productos de degradación no resultaron tóxicos para la bacteria. Asimismo, se sugiere que
el primer paso de la degradación de DBF ocurre en el medio a través de una reacción enzimática [16].
5. Conclusión
Las tres cepas de hongos utilizadas fueron capaces de crecer en los medios que contenían DBF. La cepa
de Neurospora sp presentó mayor Vr comparación con las otras dos cepas en el medio conteniendo 500
mg/l de DBF en. A diferencia de lo anterior, la cepa de Aspergillus niger produjo mayor biomasa en
comparación con las otras dos cepas en el medio de cultivo conteniendo 500 mg/l de DBF. La cepa de
Hypocrea lixii mostró mayor velocidad específica de crecimiento en comparación con las otras dos
cepas en el medio de 500 mg/l de DBF. En el caso de la fermentación líquida, de la cual obtuvimos la
µ, el pH de los cultivos de las tres cepas fue disminuyendo conforme aumentaba el tiempo de
fermentación. Con respecto al estudio de toxicidad, podemos concluir que el sobrenadante de la
fermentación líquida no resultó toxica para la E. coli, ya que conforme aumentaba el tiempo de
fermentación también aumentaba el número de colonias de la bacteria, obteniendo una CI 50 de 473 mg/l
de DBF.
Referencias
[1] Liang D.; Zhang T.; Herbert H.; y He J. (2008). Phathalates biodegradation in the environment.
APPL MICROBIOL BIOT 80: 183-198.
[2] Mendoza A. (2008). Capítulo 5. Listado adicional al convenio de Estocolmo: sustancias de uso
industrial. Ftalatos. Instituto Nacional de Ecología.
[3] Chang B.V.; Wang T.H. y Yuan S.Y. (2004). Biodegradation of four phthalate esters in sludge.
CHEMOSPHERE. 69:1116-1123.
[4] Kim Y.H.; Lee J.; Ahn J.Y.; Gu, M.B. y Moon S.H. (2002). Enhanced degradation of an
endocrine-disrupting chemical, butyl benzyl phthalate, Fusarium oxisporum f. pisi cutinase.
ENVIRON MICROBIOL 68:4684-4688.
[5] Bustamante M.P.; Lizama S.B. y Olaíz F.G. (2001). Ftalatos y efectos en la salud. REV INT
CONTAM AMBIE 17:205-215.
[6] Furtmann K. (1994). Phthalates in surface water – a method for routine trace level analysis.
FRES J ANAL CHEM 348:291-296.
[7] Lee S.; Lee J.; Koo B.; Kim M.; Choi D. y Choi I. (2007). Dibuthyl phthalate biodegradation by
the white rot fungus Polyporus brumalis. BIOTECHNOL BIOENG 97:1516-1522.
[8] CERHR (2006). NTP-CERHR monograph on the potential human reproductive and
developmental effects of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP). National Toxicology Program Center
for the Evaluation of Risks to Human Reproduction, NTP-CERHR-DEHP-05.Available at
http://cerhr.niehs.nih.gov/chemicals/dehp/DEHP-Monograph.
[9] Huber W.; Grasl-Kraupp B.; y Schulte-Hermann R.; (1996). Hepatocarcinogenic potential of
di(2-ethylhexyl) phthalate in rodents and its implications on human risk. CRC CR REV TOXICOL
26:365-481.
[10] Cheng Y. y Prusoff W. (1973). Relationship between the inhibition constant (KI) and the
concentration of inhibitor wich causes 50 per cent inhibition (IC50) of an enzymatic reaction.
BIOCHEM PHARMACOL 22(23):3099-108
[11] Hoetelmans R. (2011). PK-PD relationships for antiretroviral drugs. FDA. Amsterdam, The
Netherlands.
[12] Gogra A.; Yao J.; Sandy E.; Zheng S.; Zaray G.; Koroma B. y Hui Z. (2010). Cell surface
hydrophobicity (CSH) of Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Aspergillus niger and the
biodegradation of Diethyl Phthalate (DEF) via Microcalorimetry. AM J SCI 6:78-88.
[13] Wang Y y Gu J. (2006). Degradability of dimethyl terephthalate by Variovorax paradoxus T4
and Sphingomonas yanoikuyae D0S01 isolated from deep-ocean sediments. ECOTOXICOLOGY
6:549-557.
[14] Reeslev M y KjØller A. (1995). Comparison of biomass dry weights and radial growth rates of
fungal colonies on media solidified with different gelling compounds. ENVIRON MICROBIOL
61:4236–4239.
[15] Monje B. (2007). Determinación de la dosis letal media (DL50) de cinco especies del género
Micrurus en estado de cautiverio en Nilo-Cundinamarca (Colombia). Tesis de licenciatura en
biología con énfasis en biorecursos. Universidad de la Amazonia.
[16] Lee S.; Lee J.; Koo B.; Kim M.; Choi D. y Choi I. (2007). Dibuthyl phthalate biodegradation
by the white rot fungus Polyporus brumalis. BIOTECHNOL BIOENG 97:1516-1522.
[17] Cuamatzi M. (2011). Identificación y evaluación del crecimiento sobre Di (2 etilhexil)
ftalato de cepas de hongos aisladas del proceso de reciclado de una industria productora de
papel. Tesis de maestría en Ciencias Biológicas .Universidad Autónoma de Tlaxcala.
[18] Kim Y.H.; Seo H.; Min J.; Kim Y.; Ban Y.; Han K.; Park J.; Bae K.; Gu M. y Lee J. (2006).
Enhanced degradation and toxicity reduction of dehexyl phthalate by Fusarium oxisporum f. pisi
cutinase. J APPL MICROBIOL 102:221-228.