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Rev: 00 Fecha: 01/06/2014 Monodiscos EDTA. Método simple utilizado en las sensibilidad antimicrobianos para la detección fenotípica metalo-beta-lactamasas (MBLs). y sencillo, pruebas de a los de enzimas Fundamento.- Las metalo-beta-lactamasas son enzimas que pertenecen a la clase B de Ambler y al grupo 3 según la clasificación funcional de Bush-Jacoby-Medeiros. Característicamente, estas enzimas son inhibibles por agentes quelantes de cinc, como ser el EDTA y el SMA (mercaptoacetato de sodio). Han sido aisladas y reportadas en numerosos países, incluida la Argentina. Los genes que las codifican pueden estar localizados a nivel cromosómico o plasmídico. Estas enzimas hidrolizan una gran variedad de antibióticos β-lactámicos, incluyendo penicilinas, cefalosporinas (1ª, 2ª, 3ª y 4ª generación) y carbapenemes. No actúan, in vitro, sobre aztreonam. El hecho de actuar sobre carbapenemes hace que su importancia clínica sea aún mayor, ya que estos antibióticos, debido a su amplio espectro de acción y a su estabilidad frente a la acción de enzimas β-lactamasas de espectro extendido (BLEE), son utilizados como último recurso para el tratamiento de infecciones causadas por bacilos Gram negativos resistentes a otros antibióticos β-lactámicos. Además, se han publicado diversos trabajos documentando la diseminación de este tipo de enzimas en el ámbito hospitalario, resaltando su importancia epidemiológica. Esto conduce a que la detección de enzimas metalo-betalactamasas sea determinante para dirigir el tratamiento óptimo de los pacientes y para controlar la diseminación de la resistencia. Sin embargo, los puntos de corte de los métodos habituales utilizados en las pruebas de sensibilidad a los antibacterianos presentan algunas limitaciones para detectar bacterias con metalo-betalactamasas. De aquí la importancia de contar con un método fenotípico, rápido, práctico y simple, para detectar microorganismos que posean estas enzimas. Composición de los Monodiscos EDTA EDTA(ácido etilendiamino tetraacético) 372 ug. Mercaptoacetato de sodio……………………900 ug. Metodología de empleo de los Monodiscos EDTA. Método de Difusión en Agar Mueller Hinton según normas CLSI. Para la detección de enzimas metalobeta-lactamasas se sigue el método de la doble difusión de discos, como se describe a continuación: -Medio: el medio a utilizar es el agar Mueller Hinton. Debe controlarse que el pH del mismo se encuentre entre 7.2 y 7.4. -Preparación del inóculo: se toman de 3 a 5 colonias del cultivo original con un asa, se introducen en 5 ml de caldo triptic soya y se ajusta la turbidez al equivalente del tubo 0.5 de la escala de Mc Farland. -Siembra en Placas: La suspensión bacteriana obtenida como se indicó en el paso anterior es absorbida con un hisopo de algodón. El exceso de líquido se descarta oprimiendo el algodón contra la pared del tubo. Se inocula la superficie seca del agar Mueller Hinton por hisopado en tres direcciones rotando la placa 60 º cada vez, para asegurar una completa distribución del inóculo. Se dejan secar las placas de 3 a 5 minutos antes de proceder a aplicar los discos. Lab. Medibac -Aplicación de los discos: Se aplican sobre la superficie del agar por medio de una pinza. Se debe tener el cuidado que los discos hagan buen contacto con dicha superficie, ejerciendo para ello ligera presión sobre los mismos. -Colocar 1 disco de imipenem (10 µg) y un disco de EDTA a una distancia de 15 mm de borde a borde de ambos discos. -Colocar 1 disco de meropenem (10 µg) a una distancia de 15 mm del disco de EDTA (de borde a borde de ambos discos), contrapuesto al de imipenem. -Transcurridos 15 minutos de la aplicación de los discos, las placas se incuban invertidas en la estufa a 35-37 ºC durante toda la noche (18-24 horas). Interpretación Una prueba positiva consiste en la observación del agrandamiento de la zona de inhibición del desarrollo alrededor del disco de imipenem (10 µg) o meropenem (10 µg) hacia el disco de EDTA. Este fenómeno de agrandamiento es conocido comúnmente como “Efecto Huevo”. Una prueba negativa se considera cuando hay ausencia del agrandamiento de la zona de inhibición del desarrollo alrededor del disco de imipenem (10 µg) y meropenem (10 µg) hacia el disco de EDTA. Almacenamiento Entre -20 y 0°C para mantener su potencia. Las cantidades necesarias para el trabajo semanal (7 días) pueden mantenerse refrigeradas entre 2-8 °C. Permita que los recipientes alcancen la temperatura 10-35 ºC antes de abrirlos. Presentación X 50 Discos LOTE: ED090517 F. ELAB: 09/05/2017 F. EXP: 09/10/2017 CONTROL DE CALIDAD: Se utilizan como controles positivos cepas clínicas de Pseudomonas aeruginosa productoras de enzima metalo-beta-lactamasas confirmadas por biología molecular y como controles negativos las cepas Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. MICROORGANISMOS Escherichia coli ATCC 25922 PRESENCIA DE METALO-BETA LACTAMASAS NEGATIVO Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 NEGATIVO Pseudomonas aeruginosa productoras de MBLs POSITIVO JUANA CEDEÑO. Q.F RESPONSABLE.
