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Título: Metiltransferasas como herramientas para marcaje de biomoleculas
Este proyecto se está llevado a cabo en el Instituto de Biología de Manchester (Manchester
Institute of Biotechnology, MIB) de la Universidad de Manchester desde octubre del año
2011.
Los procesos celulares son muy complejos y su comprensión es esencial para el progreso
científico. Los esfuerzos en idear las herramientas para la recolección, la organización y el
análisis de la información estos complejos procesos celulares, han llevado al desarrollo de
herramientas de marcaje molecular como los biomarcadores, las etiquetas moleculares o
“tags”, las cadenas de marcaje, entre otros métodos, de manera que hoy en día la práctica e
investigación en biología celular es inimaginable sin estas técnicas [1, 2].
Las metiltransferasas (MTasas) dependientes de
S-adenosil-L-methionina (SAM), son
enzimas que regulan la expresión genética mediante la metilación. Esta función se basa en la
transferencia de un grupo metil del cofactor SAM a los diversos sustratos entre los que se
incluye el ADN, histonas y otras proteínas. Las MTasas catalizan mono, bi o tri metilación de
los residuos de arginina o lisina. De acuerdo al patrón de metilación, ocurre la transcripción
de genes [3]; por ello desordenes en este proceso se han asociado con diversas patologías,
desordenes psiquiátricos y cáncer [4].
La gran diversidad de MTasas y su función para catalizar modificaciones covalentes en
biopolímeros las convierte en herramientas bastante atractivas para diversos usos como la
producción de nuevos compuestos, biocombustibles y en biorremediación. Citaciones
recientes indican que las MTasas pueden transferir diversas cadenas hidrocarbonadas de
moléculas análogas de SAM hacia ADN, histonas y otros sustratos. Por ello, dichas
moléculas análogas de SAM han surgido como nuevas herramientas de marcaje para
proteínas y ácidos nucleicos [4-7].
La ventaja de modificar una enzima natural por mutación dirigida, es que hace el proceso de
marcaje altamente selectivo y eficiente. Esto incluye el potencial de adaptar las características
de la enzima con los requerimientos experimentales.
Las estrategias para el diseño de estas enzimas se basan usualmente en la modificación del
sitio activo enzimático para su unión con sustratos o cofactores que también han sito
modificados. En este proyecto, estamos usando la estrategia “de bulto y hoyo” (bump-andhole), pues al cambiar los residuos del sitio activo de la enzima por residuos estéricamente
mas impedidos o voluminosos, se modifica el espacio en el que el cofactor natural SAM
cabe, así se crea un sitio activo mas pequeño que permite que sinteraccione con un análogo
de SAM más pequeño.
Nuestra meta es rediseñar algunas reacciones dependientes de MTasas para transferir a
biomoléculas algún grupo funcional o reportero molecular que se desee. Por una parte
pretendemos sintetizar análogos de SAM con variaciones en los hidroxilos 2’ y 3’ de la
ribosa, así como diferentes cadenas a transferir. Por otro lado, usamos mutagénesis in situ
para alterar la especificidad del cofactor y el sustrato de las MTasas utilizadas para probar
que pueden transferir cadenas hidrocarbonadas funcionales del cofactor análogo de SAM a
sustratos como péptidos y proteínas. Esto idearía un sistema sitio-selectivo bioortogonal para
el marcaje e inmovilización de biomoléculas.
La síntesis química de los análogos de SAM empezó con encontrar la mejor ruta de síntesis y
purificación de S-adenosil homocisteína (SAH), para después aplicar una metodología similar
para sintetizar los análogos de SAM. Idealmente el método consistía en acoplar
L-homocisteína o la tiolactona D,L-homocisteína con el derivado 5’halogenado de adenosina.
Se seleccionó adenosina como el bloque de síntesis inicial a partir de la cual se sintetizarían
los derivados de adenosina 5’-iodo y 5’-cloro y de estos se elegir la mejor metodología para
la síntesis, purificación y el mejor rendimiento.
El derivado de iodo fue el primero en sintetizarse, usando la metodología Perrone et al., [8]
se obtuvo un rendimiento cercano a un 15% del producto puro. Este rendimiento bajo se
debió posiblemente a una ciclación intramolecular que ya ha sido reportada en la literatura [811] y otros subproductos generados. La reacción de acoplamiento entre 5’-deoxi-5’iodoadenosina y L-homocisteína de acuerdo a las condiciones descritas por Lim et al. [12],
dio el producto esperado; sin embargo, debido a la alta polaridad de la molécula, su
purificación resultó difícil aún usando columnas “Bond elut” (enlace-elución) , y se obtuvo
un rendimiento total cercano a un 9.3% de SAH puro.
Como otra opción de síntesis, se sintetizó el derivado 5’-cloro-5’deoxiadenosina usando las
condiciones descritas por Li et al. [13], y controlando las condiciones de la reacción
adecuadamente se tuvo éxito al incrementar los rendimientos a un 40.8% del compuesto puro.
La reacción de acoplamiento se realizó usando la tiolactona D,L-homocisteína e hidróxido de
sodio de acuerdo a la reacción de Robins et al. [14]. No obstante, la reacción de acoplamiento
con el derivado clorado mostró la generación de diversos subproductos y nuevamente la
purificación no fue eficiente, obteniendo un rendimiento cercano al 5% de SAH.
Estas dificultades nos llevaron a sintetizar una molécula menos polar, para permitir una mejor
purificación, así que se adaptó la reacción de Robins et al., usando metóxido de sodio para
dar el 3-metilester-D,L-adenosilhomocisteina. El espectro de 1H NMR mostró la obtención
del compuesto, pero la purificación continuó siendo difícil, así que esta opción se descartó.
El primer análogo de SAM que se sintetizó fue la variación 2’-deoxi de SAH, usando 5’chloro-2,5-deoxiadenosina como el bloque de síntesis para la reacción de acoplamiento.
Debido a la naturaleza de la reacción de cloración que involucra la reactividad de los
hidroxilos, la ruta de síntesis elegida de Lim et al., tuvo que ser ajustada a la metodología
propuesta por Beacham [15]. La reacción inicial mostró un rendimiento cercano al 45% y con
muy pocos subproductos. La caracterización definitiva del compuesto aun continua y es
necesario adaptar la reacción de acoplamiento y la purificación en base a lo descrito por
Borchardt et al. [16].
La parte del proyecto enfocada a mutación de las enzimas, comenzó con la inserción hacia el
ADN de los constructos de las enzimas MTasas wild-type y la proteínas de fusión ya
incluida. Se utilizaron bacterias competentes cepas de E. coli BL21. Después de revisar las
estructuras cristalinas de varias enzimas interaccionando con el cofactor SAM, se
seleccionaron tres MTasas, de las cuales dos fueron lisin-metiltransferasas y una argininmetiltransferasa.
Después del cultivo y la lisis de las bacterias de E. coli BL21 con la enzima de elección
sobre-expresándose, la fracción de proteína soluble se paso por una columna de afinidad para
obtener en forma pura la MTasa con la proteína de fusión. Para evaluar la función
metiltransferasa de las enzimas, se sintetizaron péptidos como sustratos con un largo de 7 a
10 aminoácidos, que después se incubaron con las MTasas y el cofactor natural SAM. La
actividad
metiltransferasa
se
analizó
mediante
espectrometría
de
masas
con
desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF), que reveló que las enzimas
tenían actividad con los sustratos después de una incubación a a la temperatura y pH óptimos
[17,18].
Basándose en su buena expresión y actividad enzimática, una de las lisin-metiltransferasas
fue elegida para continuar con los experimentos de mutagénesis. Con la estructura cristalina,
se generaron tres modelos de posibles mutantes de la MTasa, cuyos aminoácidos del sitio
activo que interaccionan con SAM fueron modificados, cambiándose un triptófano por
fenilalanina, tirosina e isoleucina. De esta manera, se esperaría que la selectividad hacia el
cofactor enzimático se modifique también. Los pasos iniciales de la mutagénesis in situ se
están llevando a cabo, y se espera que las variantes enzimáticas se generen pronto.
El trabajo a futuro continuará enfocándose en dos áreas, por una parte en la optimización de
la síntesis química de los análogos de SAM, que incluye la obtención de mejores
rendimientos y un buen método de purificación. Por otro lado, en la evaluación y
caracterización de la actividad metiltransferasa de las enzimas wild-type y las variaciones
generadas en laboratorio. Los ensayos de metilación con los análogos de SAM como
cofactores se llevarán a cabo también y basándose en los resultados obtenidos llegando a este
punto, el diseño de nuevos mutantes y cofactores continuará.
Finalmente me gustaría agradecer a mi supervisor Jason Micklefield y a todos los miembros
del equipo, especialmente a Anna Winona Struck y Mark Thompson por sus consejos y
ayuda. Gracias a Xiaodong Cheng (Universidad de Emory) y Ray Trievel (Universidad de
Michigan) por los constructos de los plásmidos de las enzimas. También me gustaría
agradecer a CONACyT por el apoyo y el financiamiento otorgado que me ha permitido
ampliar mis horizontes.
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