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Bases moleculares de la pérdida
de expresión
de moléculas
HLA de clase I en tumores
de colon
Carmen M. Cabrera Morales
Servicio de Análisis Clínicos e
Inmunología, Hospital Universitario
Virgen de las Nieves, Granada
Incidencia global del cáncer en los países
desarrollados y en vías de desarrollo
Países
desarrollados
Países en vías de
desarrollo
Pulmón
Mama
Colon
Estómago
Hígado
Próstata
Cérvix
Esófago
Vejiga
Linfoma no-hodgkin
Cavidad oral
Leucemia
Páncreas
Miles de nuevos casos diagnosticados en el año 2010
Modelo de tumorogénesis
S
Epitelio
T. conjuntivo
(1)
(2)
(3)
Epitelio
T. conjuntivo
S, célula stem epitelial
Progresión adenoma-carcinoma:
inactivación
bialelica de APC
Intestino normal
Pólipo adenomatoso
APC+/Poliposis adenomatosa
familial
Pérdida de APC
en células epiteliales
Tumores de colon
esporádicos
Transformación
maligna
Carcinoma
Inestabilidad cromosómica (A) e inestabilidad de
microsatélites (B) en tumores de colon
A
APC/b-Catenina
Normal
COX-2
Adenoma
temprano
B
APC/b-Catenina
p53
K-Ras
Adenoma
tardío
Genes MMR
(hMSH2, hMLH1)
18q LOH
Carcinoma
TGFbRII, BAX,
IGF-IIR, E2F4,
TCF-4
Cáncer inmunoediting: generación de variantes
tumorales inmunorresistentes
a)
b)
c)
Inestabilidad genética/ heterogeneidad tumoral
Selección inmune
Ruta biosintética de moléculas HLA de clase I
Antígeno
tumoral
Superficie
celular
Proteasoma
Péptidos
RE
TAP
b2m
Complejo
trimérico
Aparato de
Golgi
FENOTIPO HLA CLASE I NORMAL
A2
A29
Cw4
Cw1
B44
B8
FENOTIPOS HLA CLASE I EN TUMORES
A29
A29
B44
A2
Cw4
Cw1
FENOTIPO I
Pérdida Total
FENOTIPO II
Pérdida de Haplotipo
Cw1
FENOTIPO III
Pérdida de Locus
A29
A2
B44
Cw4
Cw1
FENOTIPO IV
Pérdida de alelo
OBJETIVOS Y DISEÑO EXPERIMENTAL
1. Conocer los mecanismos implicados en la pérdida total
de moléculas HLA de clase I (Fenotipo I).
95 tumores de colon
estudiados por inmunohistología (Abms W6/32, HC10)
14 tumores con pérdida total de expresión de moléculas
HLA de clase I
Expresión de cadena pesada
HLA de clase I
Estudio de defectos estructurales
y de expresión en b2m
Expresión de genes de la maquinaria
de procesamiento y presentación
antigénica (TAP1/TAP2, LMP2/LMP7)
Inestabilidad de microsatélites (MSI)
2. Dada la elevada frecuencia de pérdida selectiva de HLA-B44
(Fenotipo IV) encontrada en tumores de colon por técnicas
inmunohistológicas, determinar los mecanismos responsables.
Tumores de colon con ausencia de expresión
de HLA-B44 (Abms 116-5-28, 66HA)
13 tumores con pérdida de
HLA-B44
Estudio de pérdida
de heterozigosidad
en 6p21.3
Expresión y defectos
estructurales en
HLA-B
3. Determinar la frecuencia de pérdida de haplotipo HLA-I
MICRODISECCIÓN DE SECCIONES DE COLON
CRIOPRESERVADAS
Extracción de DNA y mRNA
Microdisección manual
Pipeta
Aguja
Patrones inmunohistológicos en tumores de colon con Fenotipo I
A
B
Proteína
RNAm
HC/b2m
b2m
HC
HLA
b2m
CO5
-
-
-
+
+
CO6
-
-
-
+
+
CO14
-
-
-
+
+
CO18
-
-
-
+
+
CO19
-
-
-
+
+
CO22
-
-
-
+
+
CO26
-
-
-
+
+
CO85
-
-
-
+
+
CO86
-
-
+
+
-
CO108
-
-
-
+
+
CO117
-
-
+
+
-
CO128
-
-
-
+
+
CO132
-
-
+
+
-
CO135
-
-
+
+
-
Tumor
HC, cadena pesada HLA de clase I
Mutaciones de b2m encontradas en secuencias de repetición de
mononucleótidos en tumores gastrointestinales
con fenotipo mutador
5‘-ATG
CTCTCTCT
37
44
SECUENCIA LÍDER
Inserciones y deleciones
Mutaciones missense
AAAAA
200
204
CCCCC
AAAAA
TAA-3‘
272
281
360
EXÓN 2
276
285
Análisis de inestabilidad de microsatélites
en tumores HLA de clase I negativos
Patrón de inestabilidad de BAT26
y TGFbRII
Tumor
BAT
26
BAT
40
BATRII
BAX
TNM
Grado
histológico
*CO86
+
+
-
-
T4N2M1
MD
*CO117
+
ND
ND
+
ND
ND
*CO132
+
+
+
+
T4N3M0
MD
CO135
+
+
+
-
T4N2M0
PD
Presencia (+) o ausencia (-) de MMP; MD,
moderadamente diferenciado; PD,
pobremente diferenciado; ND, no
determinado; *Tumores HNPCC (Criterios de
Amsterdam)
Mutaciones de b2m en tumores de colon MSI (inestabilidad
de microsatélites) positivos
Tumor
Exon
Homocigoto/
heterocigoto
Mutación
CO86
Exon 2
Exon 2
Heterocigoto
Heterocigoto
*deleción CA, codón 25
deleción A, codón 67
56
102
CO117
Exon 2
Exon 2
Heterocigoto
Heterocigoto
deleción C, codón 91
*deleción CCGTG,
codones 101-102
102
114
CO132
Secuencia líder
Homocigoto
deleción CT, codones 1315
56
CO135
Secuencia líder
Homocigoto
deleción CT, codones
13-15
56
*Deleción no descrita en la literatura.
Posición del
codon stop
CO86
CO132
Estroma
Estroma
Del. CT (CT4)
Del. A (A5)
CT
A
Tumor
Tumor
Cromosoma 15
15qter
15q21
Centrómero
Telómero
D15S209
15pter-15qter
b2m
D15S126
15q21(próximo
a b2m)
Pérdida de heterozigosidad (LOH) en b2m (15q.22)
Tumor
D15S126
D15S209
CO5
LOH
ROH
CO6
MSI
MSI
CO14
MSI
MSI
CO18
ROH
ROH
CO19
H
LOH
CO22
ROH
ROH
CO26
H
H
CO85
ROH
H
CO86
MSI
ROH
CO108
ROH
ROH
CO117
MSI
MSI
ROH, retención
de heterozigosidad;
CO128
ROH
ROH
H, homocigoto;
CO132
MSI
MSI
CO135
MSI
MSI
MSI, inestabilidad de
microsatélites.
LOH, pérdida de
heterozigosidad;
Análisis de la expresión de genes APM en tumores de
colon microdisectados MSI negativos
PM 5
6
14
18
19
22 26
85 108 128 C+ C-
Actina
- 614 pb
β2m
- 424 pb
HLA
- 308 pb
TAP1
- 273 pb
TAP2
- 298 pb
LMP2
- 449 pb
LMP7
- 542 pb
LMP2M*
- 449 pb
LMP7M*
- 542 pb
PÉRDIDAS HLA DE CLASE I
EN TUMORES DE COLON
Fenotipo I;
15%
Pérdida de
B44; 14%
Resto de
tumores; 71%
Frecuencia de HLA-B44 en la población caucásica
35
B44 (24%)
30
25
20
15
10
5
0
B7
B15
B27
B38
B41
B50
B56
B60
PÉRDIDA DE HETEROZIGOSIDAD EN 6p21.3
Cromosoma 6
6p21.3
Centrómero
Telómero
TAP1
TAP2
Clase II
D6S291
HLA-B
III
D6S273
HLA-C
HLA-A
Clase I
C12C
C125
Microsatélites
D6S265
D6S105
D6S276
Tumores con tinción inmunohistológica negativa
de B44 y
pérdida de haplotipo HLA-I
Tumor
Tipaje HLA
STR
D6S311
D6S291
D6S273
C12C
C125
D6S265
D6S105
D6S276
Haplotipo
perdido
(SSO)
CO32
A29, -; B44, 62
N
L
H
L
L
H
H
L
ND
CO67
A2, 29; B44, 51
L
L
H
L
L
H
L
H
A29/B44
CO69
A24, -;B44, 35
L
L
L
L
L
H
H
L
A24/B44
CO101
A2, 29; B44, 7
L
L
L
L
L
L
H
L
A29/B44
STR, microsatélite; N, normal; L, LOH; H, homocigoto; ND, no determinado
Tumores de colon con expresión
negativa de HLA-B44
Tumor
Tinción con los Abms
116-5-28/66-HA
Tipaje HLA-B
(SBT)
CO46
-
B*4402/51011
CO49
-
B*4403/1402
CO53
-
B*4403/0702
CO57
-
B*4403/4005
CO61
-
B*4403/3534
CO74
-
B*4403/4501
CO81
-
B*4402/40011
CO99
-
B*4403/4501
CO100
-
B*4405/4501
SBT (Sequence Based Typing),
secuenciación en alta resolución
Frecuencia de los diferentes subtipos de HLA-B44
en los tumores de
estudio y en la población control
70%
60%
50%
40%
30%
20%
Tumor
10%
Control
0%
B*4402
B*4403
B*4405
p <0.05
Estrategia de secuenciación del locus
HLA-B
cDNA
EX1
HLA-5UT
Región 3‘ no
traducida
EX2
BSA
EX3
EX4
EF4
CG3
(1388 pb)
EX5
6
BNSA
7
8
HLA-3UTB
Imagen especular de HLA-B4402/4403/4405
Asp114
Asp114
Tapasina y el complejo de carga peptídico
HLA de clase I
ERp57
HC
Complejo de carga peptídico
b2m
Calnexina
Crt
Péptido
subóptimo
Tpn
TAP1
BiP
Péptido
óptimo
ATP
TAP2
RE
ATP
Citosol
Proteina
ubiquitinada
HC, cadena pesada HLA de clase I
Crt, calreticulina; Tpn, tapasina
Proteasoma
Expresión de tapasina, TAP1/TAP2 en tumores de colon
con ausencia de expresión en superficie de B44
46
49
53
57
61
74
81
99 100
C+ C-
Tapasina*
- 281 pb
Tapasina
- 281 pb
b 2m
- 424 pb
TAP1
- 273 pb
TAP2
- 298 pb
Tapasina*, expresión en mucosa autóloga
A
Tumores de colon HLA-B44 positivos
62
67
94
101
106
C+
C- 281 pb
Tapasina
C-
B
b2m
Tapasina
C+
VE10 CL87 CL86 CL54
- 424 pb
- 281 pb
Pérdida de haplotipo HLA-I asociado a
pérdida de heterozigosidad en 6p21.3
Electroferogramas de microsatélites que mapean 6p21.3
Ds291
D6S273
Estroma
Tumor
Tumor CO15
C.1.2.C
C.1.2.5
D6S265
D6S105
69% de los tumores de colon presentan alteración HLA-I
Tumores sin
alteración
HLA-I; 31%
Fenotipo I; 14%
Pérdida
selectiva de
B44; 15%
Fenotipo II;
40%
FI
FIV
FII
Resto
Alteraciones HLA-I en los tumores de colon presentados
1. Fenotipo I
MSI
positivos
- Inactivación bialelica de b2m (4casos).
MSI
negativos
-Alteración del componente del proteasoma
LMP7; y defecto de expresión de TAP2 (4
casos).
- En un único caso no se ha podido determinar
el mecanismo responsable (CO5).
2. Expresión
negativa en
superficie de
B44
- Tumores con pérdida de haplotipo B44 (4 casos).
3. Pérdida de
haplotipo
HLA-I
-El 40% de los tumores de colon presentan
LOH en la región 6p21.3
-Tumores con defecto de expresión en la chaperona
tapasina, componente del complejo de carga
peptídico de clase I (9 casos).
Estadios y pronóstico en el cáncer
de colon
Estadio
Dukes
TNM
Numérico
Descripción
Patológica
Tasa de
supervivencia a los
5 años (%)
A
T1N0M0
I
Cáncer limitado a la
mucosa y submucosa
>90
B1
T2N0M0
II
Cáncer extendido en la
muscular
85
B2
T3N0M0
II
Cáncer extendido en la
serosa
70-80
C
TxN1M0
III
Invasión de los
ganglios linfáticos
regionales
35-65
D
TxNxM1
IV
Metástasis distantes
(hígado, pulmón, etc)
5