Download Redalyc.ESTUDIO CINÉTICO ENZIMÁTICO DE LA HIDROLASA A

Avances en Ciencias e Ingeniería
E-ISSN: 0718-8706
[email protected]
Executive Business School
Chile
Hernández, Israel; Alejo, Karla M.; Méndez, Lithael; García, Alfonso; Cordova, Alejandro;
García, Alejandro
ESTUDIO CINÉTICO ENZIMÁTICO DE LA HIDROLASA A PARTIR DE CÍTRICOS
Avances en Ciencias e Ingeniería, vol. 6, núm. 3, julio-septiembre, 2015, pp. 1-8
Executive Business School
La Serena, Chile
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Avances en Ciencias e Ingeniería - ISSN: 0718-8706
Av. cien. ing.: 6(3), 1-8 (Julio/Septiembre, 2015)
Hernández et al.
ESTUDIO CINÉTICO ENZIMÁTICO DE LA HIDROLASA A PARTIR DE
CÍTRICOS
ENZYMATIC KINETIC STUDY HYDROLASE FROM CITRUS
Israel Hernández1*, Karla M. Alejo1, Lithael Méndez1, Alfonso García1,
Alejandro Cordova2, Alejandro García2
Universidad Veracruzana, (1) Facultad de Ciencias Químicas, (2) Facultad de Ingeniería Civil,
Prolongación de la Ave. Venustiano Carranza s/n, C.P. 93360, Zona Poza Rica, Tuxpan, Veracruz - México
*autor de contacto (e-mail: [email protected])
Recibido: 13/02/2015 - Evaluado: 24/04/2015 - Aceptado: 04/06/2015
RESUMEN
En el presente trabajo se evalúa la actividad degradadora de las enzimas obtenidas a partir de las cáscaras de
naranja (citrus x sinensis), toronja (citrus paradise) y piña (ananas comosus) sobre la materia orgánica presente
en agua residual. Esta actividad se mide de manera indirecta cuantificando la demanda bioquímica de oxígeno
(DQO) antes y después del proceso de degradación en función de un periodo de tiempo determinado utilizando
el equipo HACH DR/2010, y posteriormente se realizó el estudio cinético por el método diferencial e integral con
los datos experimentales, obteniendo un orden de reacción de 1 para la pectinasa (naranja), y orden 2 para la
bromelina (piña).
ABSTRACT
In this paper the degrading activity of enzymes derived from orange peels (Citrus x sinensis), grapefruit (Citrus
paradise) and pineapple (Ananas comosus) on the organic matter in wastewater is evaluated. This activity is
measured indirectly by quantifying the biochemical oxygen demand (COD) before and after degradation process
based on a period of time using the HACH DR / 2010, and then the kinetic study was performed by the
differential method and integral with the experimental data, obtaining a reaction order of 1 to pectinase
(orange), and order 2 for bromelain (pineapple).
Palabras clave: estudio cinético, naranja, toronja, piña
Keywords: kinetic study, orange, grapefruit, pineapple
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INTRODUCCIÓN
Todas las reacciones metabólicas que ocurren en un organismo están mediadas por enzimas, estas son capaces
de acelerar las reacciones químicas sin consumirse ni formar parte de los productos. Las enzimas, en los
sistemas biológicos constituyen las bases de las complejas y variadas reacciones que caracterizan los fenómenos
vitales y algunas de ellas catalizan la hidrólisis de los materiales, la cual se produce cuando el polímero tiene
principalmente enlaces inestables y algún grado de hidrofilia (Dillon & Hughes, 1999). El uso de enzimas tiene
abierto una nueva vía para la producción de ésteres de citrato bajo suaves. Recientemente, la síntesis
enzimática ha sido reportado con éxito de CITREM (Huang et al., 2011).
La vida es una cadena de procesos enzimáticos, desde aquellos que tienen por sustrato los materiales más simples,
como el agua y el anhídrido carbónico presentes en los vegetales para la formación de hidratos de carbono, hasta
los más complicados que utilizan sustratos muy complejos. Los jugos cítricos tienen elevados tenores de ácido
ascórbico y ácidos orgánicos, y sus sales, los que provocan la degradación de azúcares, aminoácidos y fenoles
durante el procesamiento y posterior almacenamiento (Lee & Nagy, 1988). Los microorganismos utilizan enzimas
biológicas para catalizar muchas reacciones bioquímicas. Hoy en día varias de estas enzimas están siendo
identificadas por los científicos y los ingenieros por su importancia en la degradación de compuestos orgánicos
(Mihelcic, 2001). Estos están formados normalmente por combinaciones de carbono, hidrógeno y oxígeno, con la
presencia, en determinados casos, de nitrógeno y otros elementos como azufre, fósforo o hierro.
Para poder evaluar el daño que pueden llegar a producir en las aguas residuales, se emplean diversas técnicas
para medir la capacidad reductora del carbono existente en ella. Entre ellas se encuentra la Demanda Química
de Oxígeno (DQO), que permite determinar la cantidad de materia orgánica que está en el agua residual.
Las enzimas, en los sistemas biológicos constituyen las bases de las complejas y variadas reacciones que
caracterizan los fenómenos vitales (Dillon & Hughes, 1999) y algunas de ellas catalizan la hidrólisis de los
materiales, la cual se produce cuando el polímero tiene principalmente enlaces inestables y algún grado de
hidrofilia. La característica principal de una reacción catalizada enzimáticamente es que ocurre en un lugar
específico del enzima, es decir, el sitio activo. La molécula fijada en el sitio activo y sobre la que actúa el enzima
se denomina sustrato. La interacción de la enzima con el sustrato (reactivo), para formar un complejo
intermediario, posteriormente, la descomposición del complejo intermediario para formar los productos y
regenerar la enzima (Phua et al., 1987). Por otro lado, uno de los enfoques utilizados para el desarrollo de
materiales a ser potencialmente utilizados como sustitutos de hueso, es por medio de materiales compuestos
tipo esponja con una estructura celular interconectada (Asha et al., 2006; Martínez, 2001).
Acevedo et al. (2004), estudiaron la degradación de la Actividad Antioxidante por tratamiento térmico a 70, 80 y
90 ºC en jugos de naranja (Citrus sinensis), mandarina (Citrus reticulata), limón (Citrus limon), pomelo (Citrus
paradisi) y lima Rangpur (Citrus limonia Osbeck). La Actividad Antioxidante fue medida usando el test del DPPH
(2,2-difenil-1-picrilhidracilo). La degradación de la Actividad Antioxidante sigue una cinética de orden cero.
Rangel et al. (2008), estudiaron la cinética de la hidrólisis enzimática de los compositos mezclados y soportados
de poliuretano poroso/hidroxiapatita. Las enzimas empleadas para la hidrólisis fueron la papaína, ureasa y
esterasa debido a que estas enzimas han presentado alguna especificidad sobre algún tipo de enlace en el
poliuretano. La cinética fue estudiada mediante la aplicación diversas ecuaciones cinéticas para orden 1, 1.5 y 2,
respectivamente, y se corroboro el orden de reacción mediante la simulación con el software HYPER, el cual
correspondió al primer orden de reacción.
Huang et al. (2012), estudiaron la cinética y termodinámica de la esterificación de ácido cítrico ( CA) y
monoglicéridos ( MG ) para ésteres de citrato de monoacilgliceroles catalizadas por Novozym 435 en el sistema
de alcohol terc -butil se estableció la relación entre la reacción inicial y la enzima con 3 g / L. La cinética de
reacción de acuerdo con el mecanismo de Ping - Pong Bi -Bi caracterizado por Vmax , KB , KA , y Kia , dio
valores de 0.7092 mmol / ( min g), 0.0553 , 0.0136 y 0.1948 mol / L, respectivamente.
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El presente trabajo estudia la actividad degradadora de las enzimas obtenidas a partir de las cáscaras de
naranja, toronja y piña, sobre la materia orgánica presente en agua residual.
MATERIALES Y METODOS
Para efectuar el estudio cinético de las hidrolasas, se extrajeron las enzimas por medio de una solución salina
(NaCl y (NH4)2SO4), posteriormente fue filtrado, secado y molido para su almacenamiento; se analizó su
comportamiento mediante el parámetro de la DQO, para comprobar si las enzimas aumentaban la velocidad de
degradación de la materia orgánica, se cuantifico la Demanda Química de Oxígeno, utilizando el equipo HACH
DR/210.
Obtención de las enzimas
Las enzimas fueron obtenidas de las cáscaras de Naranja, Piña y Toronja en un punto de maduración intermedio,
y estás se sometieron a varios procesos. Las enzimas son intracelulares y es preciso romper las células para su
extracción; el extracto crudo se solubiliza en agua y las enzimas se precipitan por la adición de sales como
sulfato de amonio; los precipitados se recuperan por filtración o centrifugación, y se secan. La recuperación de
las enzimas se llevó a cabo manteniendo condiciones específicas que no afectaran la estructura proteínica, ya
que de otra manera se pierde la actividad catalítica (Badui, 1993).
Parámetros de la Actividad Enzimática (DQO)
Para comprobar si las enzimas aumentaban la velocidad de degradación de la materia orgánica, se cuantificó la
demanda química de oxígeno, utilizando el equipo HACH.
La demanda química de oxígeno (DQO), expresada en oxígeno, mide la porción de materia orgánica (M.O),
biodegradable o no, de una muestra que es susceptible de oxidación por un fuerte oxidante químico (dicromato
potásico- Cr2O7K2). Se agregaron 0.25 g de la enzima pectinasa de la cáscara de naranja extraída con NaCl y
(NH4)2SO4 a un matraz y se aforó a 100 mL con agua residual respectivamente, dejándolas actuar por un
tiempo de dos horas.
Tabla 1: Resumen del método integral para expresiones cinéticas
Cinética
Solución
𝒅𝑪𝑨
−
= 𝒌𝟏 𝑪𝑨
𝒅𝒕
𝒅𝑪𝑨
−
= 𝒌𝟐 𝑪𝟐𝑨
𝒅𝒕
𝒅𝑪𝑨
−
= 𝒌𝒏 𝑪𝒏𝑨
𝒅𝒕
𝐶𝐴
𝑙𝑛 ( ) = −𝑘1 𝑡
𝐶𝐴0
1
1
−
= 𝑘2 𝑡
𝐶𝐴 𝐶𝐴0
(1−𝑛)
𝐶𝐴
(1−𝑛)
− 𝐶𝐴0
= (𝑛 − 1)𝑘𝑛 𝑡
Estudio Cinético
Se llevó a cabo mediante el método integral, el cual es el más confiable para estimar constantes cinéticas y
órdenes de reacción a partir de datos experimentales. El método básicamente consiste en “integrar” la expresión
de velocidad para obtener una o varias ecuaciones para estimar los perfiles de concentración; también se utilizó
el método diferencial; la principal limitación de este método radica en que la diferencia numérica es por
naturaleza incierta e inexacta. La velocidad se estimará simplemente dividiendo el cambio de concentración por
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el tiempo. Con este método se busca modificar la expresión de velocidad de manera que sea lineal respecto a
los parámetros (Tiscareño, 2008); lo anterior se aprecia en la Tabla 1.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Enzimas obtenidas a partir de las cáscaras de naranja, piña y toronja
La materia prima para obtener las enzimas, fueron cáscaras de Naranja, piña y toronja. Para llevar a cabo la
extracción de las enzimas se prepararon 2 soluciones con distintas sales (cloruro de sodio (NaCl) y sulfato de
amonio [(NH4)2SO4]) con la finalidad de evaluar con cual se extrae mejor la enzima, los cuales se muestran en
la Tabla 2.
Tabla 2: Cantidad de enzimas extraídas
Cáscara
Naranja
Piña
Toronja
Cantidad de cáscara
disuelta en la solución (g)
50
50
50
Enzima extraída con
NaCl (g)
6.1
5.8
6.1
Enzima extraída con
(NH4)2SO4 (g)
5
3.8
4.8
Como se puede observar en la Tabla 2 se obtuvo una mayor cantidad de las enzimas en los tres casos al utilizar
NaCl que con el (NH4)2SO4. Sin embargo, la precipitación y filtración fue más rápida con el sulfato de amonio.
Degradación de la materia orgánica por medio de las enzimas (pectinasas, bromelina)
Se agregaron 0.25 g de la enzima pectinasa de la cáscara de naranja extraída con NaCl y (NH4)2SO4 a un matraz
y se aforó a 100 mL con agua residual respectivamente, dejándolas actuar por un tiempo de dos horas. Se
realizó el análisis de la DQO en la muestra de agua residual con y sin enzima. Los resultados obtenidos de la
DQO de cada muestra se presentan en la Tabla 3.
Tabla 3: Comparación de la acción de la enzima con diferentes sales de extracción.
Muestra
Cantidad de enzima pectinasa (naranja)
DQO (mg/L)
0
0g
155
1
0.25 g extraídos con NaCl
149
2
0.25 g extraídos con (NH4)2SO4
146
Como muestra la Tabla 3, la degradación de la materia orgánica presente en el agua, fue mucho mejor con la
enzima pectinasa (naranja) extraída por medio del (𝑁𝐻4 )2 𝑆𝑂4 , ya que degradó 3 mg/L más que con NaCl, lo
cual verifica lo mencionado por Badui (1993). Por lo que en los posteriores análisis se utilizaron las enzimas
extraídas con el sulfato de amonio.
Siguiendo el mismo procedimiento, se buscó medir la acción de la enzima a diferentes tiempos, en la Figura 1 se
representan los datos donde se muestra que con una misma cantidad de enzima (0.25 g) pero a diferentes
tiempos, la DQO fue disminuyendo alcanzando su mayor acción enzimática entre la primera y segunda hora.
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150
180
160
145
140
DQO (mg/L)
DQO (mg/L)
120
140
135
100
80
60
40
130
20
125
0
0:00
1:12
2:24
0
Tiempo de acción de la enzima (h)
0,08
0
0,07
50
100
150
200
ln[CA]/[CA0]
y = 0,0005x - 0,0064
R² = 0,9636
0,06
y = -0,0053x + 0,0494
R² = 0,9756
0,04
0,03
-0,4
0,02
-0,5
0,01
-0,6
0
-0,7
-0,01 0
-0,8
-0,02
-0,9
2
0,05
-0,2
-0,3
1,5
Fig. 2: Obtención de la cantidad óptima de enzima.
0,1
0
1
Cantidad de enzima (g)
Fig. 1: Variación de la DQO respecto al tiempo con la
misma cantidad de enzima Pectinasa (naranja).
-0,1
0,5
y = 5E-05x + 0,0058
R² = 0,9519
50
100
150
Tiempo (min)
Tiempo(min)
Fig. 3: Representación para la cinética de orden 1 Pectinasa
Orden 1.5
Fig. 4: Representación para la cinética de orden 1.5 y 2
Pectinasa.
La enzima pectinasa (naranja) degrada la materia orgánica presente en una muestra de agua residual en un
tiempo pre establecido por lo que se prosiguió a buscar la concentración óptima de la enzima, obteniéndose los
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datos mostrados en la Figura 2, donde se puede observar que a medida en que se incrementa la cantidad de
enzima pectinasa (naranja), la DQO va disminuyendo.
Sin embargo, para la cantidad de 1 g se llega a un punto de saturación, esto significa que la enzima concluyó su
acción y estaba en proceso de volver a su estado original pues ya no tenía materia orgánica que degradar, pero
se corre el riesgo de que su acción se revierta. Por lo cual la concentración óptima de esta enzima es de 0.75 g.
Cinética
Con el dato de la concentración óptima contra el tiempo, se prosiguió a calcular la cinética de la Pectinasa (naranja)
y Bromelina (piña), ya que para la toronja se comportó muy inestable en la remoción de la DQO, estas fueron
estudiadas mediante la aplicación del método integral ocupando las ecuaciones cinéticas de orden 1, 1.5 y 2.
Para la pectinasa (naranja) se obtuvo las cinéticas correspondientes, observando que el coeficiente de
correlación R2 es más alto con el orden 1, ya que es el que más se acerca a la unidad, lo que corresponde
directamente observado en las Figuras 3 y 4.
Para la bromelina (piña) se llevó a cabo el mismo procedimiento obteniendo la siguiente gráfica para el orden 1,
la cual se observa en la Figura 5, obteniendo una correlación de 0.9725. Para el orden 1.5 y 2 (Figura 6), se
obtuvo una correlación de 0.973 y 0.9734 correspondientemente. Todo lo anterior refuerza lo obtenido por
Rangel et al. (2008), mediante simulación con el software HYPER.
0,014
0,02
0
-0,02
0,012
0
50
100
150
200
-0,04
ln(CA/CA0)
y = 9E-05x - 0,0006
R² = 0,973
0,01
0,008
-0,06
0,006
-0,08
y = 7E-06x + 0.0064
R² = 0.9734
0,004
-0,1
0,002
-0,12
0
-0,14
-0,16
-0,18
y = -0,0011x + 0,0066
R² = 0,9725
Tiempo (min)
Fig. 5: Representación para la cinética de orden 1
Bromelina.
-0,002
0
50
100
150
Tiempo (min)
Orden 1.5
Orden 2
Fig. 6: Representación para la cinética de orden 1.5 y 2
Bromelina.
Se puede observar que el coeficiente que más se acerca a la unidad es para el orden 2. Lo que indica que la
velocidad de reacción es mucho más lenta para la Bromelina en comparación con la Pectinasa. Para este caso la
cinética cambia mucho debido a las condiciones de trabajo como la concentración, aunque la enzima es efectiva
no se asemeja a lo obtenido por Acevedo et al. (2004) y Rangel et al. (2008).
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Una vez obtenidos la cinética de degradación se obtuvo la eficiencia de remoción de materia orgánica
observando en la tabla 4, que para la pectinasa (naranja) se obtiene el 53.28 % de degradación de la enzima en
la muestra de agua, lo cual corrobora lo obtenido en la DQO.
Tabla 4: Eficiencia de degradación de las enzimas en la muestra de agua.
Enzima
Concentración inicial (DQO
mg/L)
Concentración final (DQO
mg/L)
Eficiencia de
degradación
Pectinasa
(Naranja)
152
71
53.28 %
Pectinasa
(Toronja)
158
152
3.79 %
Bromelina
(Piña)
156
135
13.46 %
CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados obtenidos, se logró comprobar que las enzimas obtenidas de las cáscaras de
Naranja, Piña y Toronja funcionan como catalizadores eficientes en la degradación de la materia orgánica
presente en una muestra de agua residual. De las tres enzimas estudiadas la de mayor efectividad fue la
pectinasa proveniente de la naranja, sin embargo la pectinasa proveniente de la toronja no resultó con la
misma actividad catalítica, esto puede tener varias razones, que la cantidad de pectinasa que se encuentra
presente en la cáscara es escasa o que las condiciones de la fruta no fueron las adecuadas para el desarrollo de
estás, se necesitaría una caracterización para obtener una explicación más concisa y exacta. Por otra parte, la
bromelina (piña) si degradó la materia orgánica aunque en una menor proporción probablemente porque es una
enzima específica para uniones peptídicas.
Con los datos obtenidos mediante la DQO y aplicando el método integral se obtuvó que la reacción de la
pectinasa (naranja) es de primer orden, mientras que para la bromelina es de segundo orden. Además que la
velocidad inicial de reacción de la pectinasa (naranja) fue de −𝑟𝐴0 = 0.5333 𝑚𝑔⁄𝐿 ∙ 𝑚𝑖𝑛 mientras que la
velocidad inicial de la bromelina (piña) fue de −𝑟𝐴0 = 0.1333 𝑚𝑔⁄𝐿 ∙ 𝑚𝑖𝑛, observándose que para la pectinasa
(naranja) la velocidad es mayor por lo que tuvo un mejor incremento en la degradación de la materia orgánica.
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