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CUARTA UNIDAD
MICROPROPAGACIÓN
DE VEGETALES
NICROPROPAGACIÓN
CONCEPTO
Es el conjunto de técnicas y métodos
de cultivo de tejidos utilizados para
multiplicar vegetales asexualmente en forma
rápida, eficiente y en grandes cantidades. La
micropropagación se utiliza para multiplicar o
propagar vegetales nuevas, tales como
aquellas
creadas
por
ingeniería
genética, mutagénesis o mejoramiento
genético.
Se
utiliza
también
la
micropropagacion para obtener vegetales
libres de enfermedades (tales como virosis) u
obtener grandes cantidades de vegetales
que no se propagan eficientemente.
PROPAGACIÓN DE VEGETALES
POR CULTIVO IN VITRO
El cultivo in vitro
La asepsia en cultivo in vitro
consiste en tomar un trocito de hoja, un
embrión, una porción pequeñita de tallo
(de 0,2 a 1 milímetro) o cualquier otra
parte de un vegetal y ponerla a cultivar
en un tubo de ensayo sobre un medio
acuoso nutritivo.
Esta consiste eliminar todos los
gérmenes, bacterias o virus en el
laboratorio, en otras palabras es el
control de todos los factores que
afectan el crecimiento.
Condiciones de
laboratorio
Requieren condiciones de
laboratorio que reúnan
todos
los
factores
ambientales de la planta
en la naturaleza que
técnicamente
es
muy
complejo. El cultivo in vitro
de plantas es una técnica
que exige un control
específico del ambiente,
tanto físico como químico,
en el que se sitúa al
explante, conviene por
tanto, conocer cuáles son
los principales factores
que
deberían
ser
controladas.
La micropropagación
o propagación clonal
Es una de las
aplicaciones
más
generalizadas
del
cultivo in vitro, a
través
de
la
micropropagación, a
partir
de
un
fragmento (explante)
de una planta madre,
se
obtiene
una
descendencia
uniforme, con plantas
genéticamente
idénticas,
denominadas clones.
Factores que afectan el
desarrollo del cultivo in vitro
Ambiente químico.
Composición
del
medio de cultivo.
Ph.
Ambiente físico.
Fases o etapas del proceso
de micropropagación
0: Selección y Preparación
de la planta madre.
1: Desinfección de las
yemas de la planta y/o
desinfección de semillas.
Temperatura.
2: introducción del material
seleccionado in vitro.
luz y fotoperíodo.
3: Multiplicación de brotes.
Humedad.
4: Enraizamiento.
5: Aclimatación
PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE
Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre,
es decir la planta donadora de yemas, durante un período de tiempo que puede
oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones
controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias
óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un
crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.
DESINFECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL
Trabajar en cabinas de flujo laminar para extraer
los explantes a partir del material vegetal.
Introducir en un tubo de cultivo conteniendo medio
de iniciación para poder controlar la sanidad y la
viabilidad.
Realizar la desinfección del material con
hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura
o diluída durante un período de 5 a 15 minutos,
seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada.
Lavar el material biológico con detergente y
enjuagar para eliminar polvo, insectos etc.…
Mantener el material en un ambiente aséptico,
donde se sumerge por unos minutos en etanol al
70%.
Sumergir el material biológico en el agente
desinfectante para eliminar los microorganismos.
El tiempo de desinfestación es importante ya que
si es prolongado puede dañar el tejido del inóculo
y si es corta los microorganismos no serán
removidos.
Lavar el material biológico con agua destilada
estéril para eliminar el agente desinfectante, el
inóculo debe mantenerse en agua destilada hasta
el momento de la siembra (2010).
INTRODUCCIÓN DEL MATERIAL IN VITRO
Luego de la desinfección
superficial, las semillas o las
yemas dependiendo del
material seleccionado, se
ponen en medio de cultivo
estéril. En un período de
una semana o quince días,
comienza el proceso de
germinación o regeneración
de nuevos tejidos vegetales,
iniciando el ciclo de cultivo
in vitro.
MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES
•
Estas operaciones se realizan en la
cámara de flujo laminar o en un lugar
aislado que nos permita mantener las
condiciones de asepsia. De esta
forma aumenta el número de plantas
en cada repique o división de las
plantas.
•
El número de plantas que se obtiene
dependerá de la especie vegetal y de
las condiciones del medio de cultivo.
El número de plantas que se obtiene
por la vía de la micropropagación
permite
alcanzar
incrementos
exponenciales, considerando que
todos los factores que afectan el
crecimiento hayan sido optimizados.
ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS
EXPLANTOS
Para
enraizar
los
explantes
se
utilizan
principalmente plantines
individuales de un tamaño
aproximado
de
2
centímetros. Los brotes
obtenidos durante la fase
de
multiplicación
se
transfieren a un medio
libre de reguladores de
crecimiento o que solo
contenga hormonas del
tipo auxinas.
ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS
Los explantos recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales,
de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso dependen de la
aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que
permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el
momento en que se extraen los explantos o plantines enraizados de los
frascos, están poco adaptados a crecer en un invernadero, ya que estos
explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy
elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la
transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente
funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto
demasiado lentos para evitar la desecación del explante.
Aplicaciones prácticas del cultivo in vitro
a) Propagación vegetativa. Esto es lo más
práctico. Dos técnicas
Micropropagación de estaquillas.
Organogénesis de callos
b) Producción de plantas libres de virus
mediante dos técnicas
Cultivo de meristemos.
Microinjerto in vitro
c) Permite hacer germinar semillas que son
muy difícil de hacer en condiciones normales.
Ejemplo: algunas Orquídeas tienen en los
campos unos parásitos obligados y en viveros
no se pueden reproducir; se inoculan esos
parásitos o in vitro.
d) Eliminar la inhibición de germinación de
las semillas. El cultivo in vitro es lo más eficaz
porque tiene determinados inhibidores y algunos
huesos de frutales no son capaces de germinar
ya que no tiene desarrollado el embrión.
e) Prevención del aborto embrionario como
resultado de incompatibilidad. Se da en cruces
de interés científico o intergenéticos, sobre todo
en plantas herbáceas. Los cruces incompatibles
dan abortos.
f) Aplicación en mejora genética para obtener híbridos,
para introducir material genético, etc.
g) Acortar los ciclos de mejora genética. No hay que esperar
que pase el periodo juvenil del árbol para ver resultados.
h) Producción de haploides. Cruzamientos o cultivo de polen
(anteras). Ventajas:
Obtención rápida de homocigotos.
Producción de híbridos (frutos puros).
Equipos necesarios para el cultivo in vitro
Autoclave
Cámara de
flujo laminar.
Medio
cultivo.
de
Planta.
Cámara
cultivo
de
Condiciones del cultivo in vitro
En la cámara de flujo laminar no puede entrar material
contaminado.
En el autoclave no se pueden meter determinadas sustancias,
como vitaminas, antibióticos, ácido giberélico, sacarosa,
encimas, extractos vegetales, etc., ni tampoco recipientes que
no soporten altas temperaturas.
El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no
suministre a las medias sustancias contaminantes para la
planta.
Los
reguladores
de
crecimiento
(hormonas)
son
imprescindibles, ya que sin ellos no se puede hacer el medio
de cultivo.
El pH ideal es 6, pero puede oscilar entre 5,5 y 6,5.
Se necesita agar y medio sólido 0,6-0,9%.
El medio de cultivo realmente sólo tiene que llevar agua,
fuente de energía (azúcares) y reguladores de crecimiento.
El medio de cultivo es secreto, y se pueden tardar dos años
en prepararlo.
En la cámara de cultivo se aplican cantidades variables de luz
(16-20 horas). También existen plantas que se desarrollan en
la oscuridad. Las temperaturas también varían. Lo normal son
22-26ºC, aunque en ocasiones se exigen fríos de 4ºC y
también 28-30ºC para plantas tropicales.
Igualmente, en el éxito de esta técnica de propagación
también influyen determinadas características de la planta,
como el tipo, genética e incluso el tipo de implante, parte más
juvenil o más adulta.
En cuanto a los recipientes, deben permitir el intercambio de
gases, pero evitar la pérdida de agua, lo que provocaría un
aumento de la concentración de sales, y por tanto la muerte
de la planta. De ahí la importancia del cierre.
Subcultivos o replicado
El medio nutritivo se
agota y se seca.
El material vegetal
ocupa todo el tubo.
Se produce un cambio
de olor en el medio
(sustancias tóxicas).
El medio se hace
líquido.
Fases del cultivo de meristemos
a) Toma un ápice meristemático (0,21 mm).
b) Siembra en el medio del tubo.
c) Fase de proliferación: crecimiento
de brotes. Subcultivos.
d) Fase de enraizamiento (cambiar
el medio).
e) Primera fase de aclimatación. Es
muy importante el que la planta
pueda llegar o no al campo.
Invernaderos, bolsas de plástico,
bandejas de vidrio, etc.
f) Segunda fase de aclimatación.
Siempre en invernadero.
g) Plantación en el campo.
Fases del cultivo de embriones
a) Se desinfecta el fruto en
alcohol. Se flamea.
b) Se coge el embrión de la
semilla.
c) Se inocula en el tubo.
d) A las 1-2 semanas, la
planta está más o menos
reconocible.
e) Se deja crecer y se pasa
por
las
fases
de
aclimatación.
Micropropagación
a)
b)
c)
d)
Se parte de una yema, de bráctea o axilar.
Se empieza a desarrollar en el medio de cultivo.
Entre la fase de proliferación y de enraizamiento hay muchos subcultivos (para obtener más plantas).
El número de subcultivos depende del material vegetal. Ejemplo de micropropagación de Kiwi:
Se parte de un trozo de tallo.
Al cabo de 4 semanas se obtiene una yema y crece un brote.
En la fase de proliferación intentamos obtener gran cantidad de brotes.
Sacamos microestaquillas del primer brote, haciendo subcultivos cada 6-8 semanas hasta llenar el vidrio.
Al aumentar la concentración de auxinas se obtienen plantas enraizadas.
Puede hacerse de forma industrial y la fase de enraizamiento se hace en vivo.
Cultivo de callo in vitro
Se parte de un trozo de hoja o de tallo; bien de una planta madre de maceta o
de una planta que viene de cultivo in vitro.
El medio puede ser sólido o líquido.
Se forma entonces una estructura de callo, de la que parten brotes, o
también proembriones, que al unirse forman una estructura similar al
embrión.
A partir de entonces se desarrolla normalmente.
Obtención de plantas haploides
Normalmente se trabaja con la antera en su totalidad, no con granos de polen en particular. De una yema
de flor se coge una antera antes de que se abra y se hace un cultivo; bien por embriogénesis u
organogénesis.
Embriogénesis: se forman células (poliembriones).
Organogénesis: se forma una estructura de callo que puede venir o bien de tejidos de la antera
(diploide), o bien del grano de polen (haploide).
No se riega nunca por aspersión (riesgo de patógenos), siempre con regadera.
Problemas en el cultivo in vitro
La contaminación es el problema
más grave en los cultivos in vitro,
como en otras actividades del
hombre y la mujer, de manera
particular en la aplicación de la
tecnología de micropropagación
de las especies vegetales, que el
ser humano lo necesita, para
seguir
alimentándose,
industrializando las bondades de
del reino vegetal. Vitrificación: es
una reacción de las plantas que
las hace adquirir apariencia de
vidrio. La única solución es hacer
un subcultivo de material sano, es
decir, se saca y se cortan los
trocitos que estén bien.
III. CULTIVO IN VITRO CASERO
Material del
laboratorio
FRASCOS DE CRISTAL (4 por grupo).
Olla a presión.
Guantes.
Mascarilla de papel.
Espátula.
Bisturí.
Mechero de alcohol.
Soporte y rejilla.
Varilla de vidrio.
Pinzas metálicas.
Trapo.
Papel de aluminio (o papel film).
Gasa estéril.
Cinta adhesiva(o film de parafina) y etiquetas.
Reactivos
Lejía.
Ácido clorhídrico.
Hidróxido sódico.
Lavajillas.
MEDIO DE CULTIVO: FÓRMULA DEL PLÁTANO (para 1 litro)
100g de plátano maduro hecho puré o licuado.
10 g de agar-agar.
15 g de azúcar.
900 ml de agua destilada.
1,2 g Tiamina *
Material
biológico
Cápsula semillas orquídea u otra semilla de especies vegetales a
propagarse.