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AGROBIOTECNOLOGIA
CURSO 2015
-
Control de malezas y resistencia a herbicidas
Emiliano Altieri
Departamento de Biotecnología
NIDERA S.A
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Sumario
Desafíos para la agricultura
Malezas y su control
Herbicidas
Aplicaciones biotecnológicas al control de malezas
- Resistencia a glifosato
- Resistencia a glufosinato
- Resistencia a inhibidores de la acetolactato sintetasa
- Inhibidores de la fotosíntesis
- Otras resistencias metabólicas
Consideraciones sobre el uso de cultivos / herbicidas
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Referencias
Desafíos
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Resistencia vs tolerancia
• Resistencia y tolerancia a herbicidas utilizados indistintamente en la
literatura científica.
• Comité de plantas resistentes a herbicidas ( Herbicide Resistant Plant
Committee,http://www.hracglobal.com/):
•
Resistencia: capacidad heredable de una población para sobrevivir y
reproducirse luego de la exposición repetida a una dosis de herbicida
normalmente letal para el tipo silvestre. Puede ser inducida por técnicas tales
como la ingeniería genética o la selección de variantes somaclonales o por
mutagénesis.
•
Tolerancia: capacidad intrínseca de una especie para sobrevivir y
reproducirse luego del tratamiento con un herbicida. Supone que no hubo un
mecanismo de selección o inducción de la tolerancia ya que la especie es
naturalmente tolerante al herbicida.
Fuente: Weed Technology Volumen 12, número 4 (octubre –diciembre) 1998- p. 789.
Malezas
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Aparición de malezas resistentes a herbicidas
http://weedscience.org/graphs/geochart.aspx
• Concepto:
Malezas
- Plantas que crecen en un cultivo y que no corresponden
a la especie o al genotipo cultivado.
• Importancia:
.
.
- Están siempre presentes.
- Compiten con el cultivo por luz, agua, nutrientes y espacio.
- pueden ser reservorio de enfermedades y plagas.
- Secretan sustancias alelotóxicas (alelopatía).
- Producen pérdidas de rendimiento.
- Pueden ser reservorios de plagas y enfermedades.
- Producen pérdidas económicas en la comercialización.
Es crítico conocer la naturaleza y el repertorio
de las malezas que afectan a un cultivo
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Cultivo de soja con (izquierda) y sin (derecha) malezas
Malezas
Malezas en lote de girasol convencional
Rama negra (Conyza bonaeriensis)
resistente a glifosato en el cultivo de soja
Ejemplos de daño causado por malezas
durante todo el ciclo de cultivo de soja en Argentina:
Especie
Densidad
Yuyo colorado (Amaranthus quitensis)
Chamico (Datura ferox)
Quínoa (Chenopodium album)
Gramímeas anuales
Sorgo de Alepo (Sorgum halepense)
1 planta/m2
1 planta/m2
1 planta/m2
500 plantas/m2
20-24 vástagos/m2
(*): % reducción de rendimiento
Daño (*)
23
29
35
50-75
89
Weedscience.com
Hay actualmente 471 casos únicos (especies por sitios de acción) de
malezas resistentes a herbicidas en el mundo. Las malezas han
desarrollado resistencia a 23 de los 26 sitios de acción de herbicidas
conocidos y a 160 diferentes herbicidas y han sido reportadas en 86
cultivos de 66 países.
Weedscience.com
Hay una gran base de datos de malezas resistentes clasificadas por
países, herbicidas, sitios de acción, especie, cultivo…
1
2
3
9
11
Monitoreo de malezas resistentes
Dato seguro: resistencia observada
en diversas aplicaciones
Sospecha de tolerancia
Control de malezas
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Historia del control de malezas
Fuente: F. L. Timmons, Weed Science (2005)
Evolución en el control de malezas
manual
mecánico
Mecánico
+ químico
Siglo XVII
2,4 D (40’)
MIM (Manejo
integrado de
químico
malezas)
Cultivos
transgénicos
(90’)
Malezas
resistentes
(hoy)
Patente de un arado por Thomas Jefferson (1794)
http://inventors.about.com/library/inventors/bljefferson.htm
1996: introducción del primer cultivo RG y aparición de la primer maleza RG
Control
de malezas
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
• Manual
- Fue la primera técnica empleada en la historia
de la agricultura.
- Muchas veces la similitud morfológica de las malezas
con el cultivo, no permite hacer el control temprano de
las mismas.
- No es compatible con el cultivo de grandes superficies.
- No es compatible con las sociedades modernas ya que
requiere disponer de mucha mano de obra.
FAO .org
• Mecánico
Control
de malezas
-Consiste en el uso de herramientas
arrastradas por un tractor (rastras,
rastras rotativas, escardillos).
-Tiene alto costo energético.
- Causa problemas de erosión hídrica
o eólica, compactación del suelo y
pérdida de humedad.
•Químico
- Consiste en el uso de herbicidas.
- A diferencia de los otros métodos
permite el control temprano de
malezas, lo que evita la alelopatía.
Control químico: aplicación de herbicida para la preparación del terreno
para la siembra directa (pre-siembra) o durante el ciclo del cultivo (postemergencia)
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Análisis de los “costos” por malezas en el cultivo
de soja en Argentina
100 % más en el costo por herbicida
SMD: sin malezas difíciles
CMD: con malezas difíciles
Fuente: REM
Caso de Maíz guacho RR dentro de un lote de
soja RR
Con el surgimiento del maíz RR también aparece el problema del maíz
voluntario en lotes de soja RR
Fuente: Papa, 2012
El problema de las malezas resistentes a herbicidas viene siendo noticia
hace tiempo....
Suplemento Campo de La Nación del 21 de Septiembre de 2013
Biotipos
resistentes
a herbicidas
Amaranthus palmeri: resistente a
inhibidores de Ahas (2013)
Red de conocimiento en malezas resistentes
(http://www.aapresid.org.ar/rem/que-es/)
Y sigue siendo noticia en la actualidad…..
Suplemento Rural , Clarín del 11 de Septiembre de 2015
Suplemento Rural , Clarín del
3 de Septiembre de 2016
Aunque a partir de las dificultades surgen también oportunidades
de negocios…..
Herbicidas
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Herbicidas
Los herbicidas son productos que forman
parte de los denominados pesticidas:
La FAO (Food and Agriculture Organization) definió pesticidas como:
Cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinada a prevenir,
destruir o controlar cualquier peste (plaga) , incluyendo vectores de
humanos o enfermedades de animales, especies no deseadas de
plantas o animales que causan daño o interfieren durante la
producción, procesamiento, almacenamiento, transporte
comercialización de alimento, commodities (granos) provenientes de la
agricultura, madera o productos de madera, alimentos para animales o
sustancias que puedan ser administradas a animales para el control de
insectos, arácnidos u otras pestes en o sobre su cuerpo. El término
incluye sustancias destinadas al uso como reguladores de crecimientos
de plantas, defoliantes, desecantes o agentes para reducir frutos o
prevenir la caída de frutos. También usadas como sustancias aplicadas
a cultivos ya sea antes o después de la cosecha para proteger el
grano del deterioro durante el almacenamiento o transporte.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Generalmente el término pesticida está
asociado sólo a los insecticidas
Herbicidas
• Definiciones:
- Son compuestos orgánicos, generalmente
sintéticos, cuyas propiedades fisicoquímicas
(masa molecular <500 Da y lipofilicidad)
facilitan su entrada a la célula.
- Interfieren con procesos vitales de las plantas,
y a veces de las bacterias, tales como por
ejemplo la fotosíntesis, la síntesis de
aminoácidos o la síntesis de ácidos grasos.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
- Se busca que el herbicida usado no afecte
al cultivo y que sea fitotóxico contra
sus principales malezas. Este aspecto
se denomina selectividad y puede lograrse
por mecanismos físicos o bioquímicos.
- Su uso se difundió a partir de 1946 (2,4-D) y fue
una herramienta clave en la agricultura moderna
(ahora vuelve como producto mejorado)
Herbicidas
• Selectividad
- Los mecanismos físicos de selectividad se
basan en la diferencia entre los volúmenes de
herbicida retenidos por el cultivo y por las
malezas. Esto se relaciona al modo de
aplicación, las circunstancias ambientales,
la estructura de la planta y las propiedades
de las hojas de las malezas.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
- Los mecanismos bioquímicos de
selectividad implican la existencia de
tolerancia al herbicida por parte del cultivo.
Criterios
para la
clasificación
de herbicidas
Los herbicidas pueden ser agrupados por:
• Modo de aplicación:
- Aplicados a la parte aérea de la planta:
contacto y sistémicos
- Aplicados al suelo: residualidad
• Tiempo de aplicación:
- Antes de la siembra del cultivo: pre-siembra
- Después de la siembra del cultivo:
pre-emergencia y post-emergencia
• Modo de acción:
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
- Inhibidores de la síntesis de aminoácidos
- Inhibidores de la fotosíntesis
- Inhibidores de la síntesis de lípidos
- Inhibidores de la síntesis de pigmentos
- Reguladores de crecimiento de tipo auxínico
- Inhibidores de la división celular
Grupos de herbicidas según su modo de acción/sitio blanco
1. Inhibidores de la síntesis de aminoácidos
Inhibidores de EPSPS:
Glifosato
Inhibidores de ALS:
Sulfonilureas
Imidazolinonas
Triazolopirimidinas
Inhibidores de GS:
Glufosinato
Bialafos
2. Inhibidores de la fotosíntesis
Inhibidores del PSI:
Bipiridilos
Inhibidores del PSII:
Triazinas
Triazinonas
Ureas sustituidas
Uracilos
Hidroxibenzonitrilos
Piridazinonas
Bis-carbamatos
EPSPS: 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintetasa
ALS: actetolactato sintetasa
GS: glutamina sintetasa
PSI: fotosistema I
PSII: fotosistema II
Grupos de herbicidas según su modo de acción/sitio blanco
3. Inhibidores de la síntesis de lípidos
Inhibidores de ACCasa:
Inhibidores de elongación
de ácidos grasos:
Arilfenoxipropionatos (FOP)
Ciclohexanodionas (DIM)
Fenilpirazolinas
Tiocarbamatos
4. Inhibidores de la síntesis de pigmentos
Inhibidores de la síntesis
de carotenoides:
Pirazoles
Amitrol
Norflurazon
Fluridona
Inhibidores de Protox (PPO):
Nitrodifenil éteres
Feniltalamidas
Saflufenacil
5. Reguladores de crecimiento de tipo auxínico
Acidos fenóxicos
Acidos benzoicos
Acidos picolínicos
Acidos carboxílicos
6. Inhibidores de la división celular
Inhibidores de la polimerización
de tubulinas:
Dinitroanilinas
ACCasa: acetil-CoA carboxilasa
Protox: protoporfirinógeno oxidasa
(enzima que cataliza el último paso
de la ruta biosintética de la
porfirina, que produce clorofila)
Fuente: weedscience.com
26 MOA’s conocidos
6 MOA’s explican el 80% del
mercado de herbicidas (17
billones de U$S anuales)
1970: 45 compañías químicas de
desarrollo de nuevos herbicidas
2014: solo 6
Herbicidas
Los herbicidas para ser comercializados deben estar
evaluados y aprobados por agencias nacionales de
regulación de pesticidas:
• Argentina: Dirección de Agroquímicos y
Biológicos dependiente de la Dirección Nacional
de Agroquímicos, Productos Veterinarios y
Alimentos del SENASA es el área que administra
el Registro Nacional de Terapéutica Vegetal en el
que están sujetos a inscripción todos los
productos fitosanitarios que se usan y
comercializan en la Argentina.
(http://www.senasa.gov.ar/)
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
• USA: EPA (Environmental protection agency)
El costo de regulación e inscripción de un nuevo
herbicida ronda los 250 M U$S y el proceso dura una
década (Green, 2014)
Herbicidas
Agropages.com
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Dos mecanismos principales de tolerancia a herbicidas
1. Tolerancia causada por mutaciones en sitios blanco del
herbicida (target-site tolerance).
Involucra una reducción en la sensibilidad de enzimas
blanco específicas o proteínas. Mayormente monogénica.
Ej: mutantes AHAS en soja.
2. Tolerancia causada por mutaciones en sitios no blanco (non
target site tolerance).
Están involucrados varios mecanismos, como reducida
absorción o translocación del herbicida, aumento en la
tasa de detoxificación, reducción en la tasa de activación,
y transporte del herbicida a vacuolas o apoplasto. Ej:
tolerancia a atrazina en maíz.
Non-target-site herbicide tolerance
Vacuola
Citoplasma
ATP
H
+ O2
P450
OH
GST
+ GSH
GSH
SH
ABC Transp.
AD
P
Target-site herbicide tolerance
Ejemplo: AHAS
Susceptible
Tolerante
Aminoácidos
ramificados
Aminoácidos
ramificados
Aminoácidos
ramificados
La selectividad bioquímica implica
la existencia de una base genética
metribuzin (triazinonas, inhibidor del PSII )
Tomado de: Hain and Schreier, 1996.
Variabilidad natural en la respuesta del tomate al metribuzin
genotipo A
no tratado
genotipo A
genotipo B
genotipo C
genotipo D
tratamiento de pulverización correspondiente a 500 g de principio activo/ha
Variedad silvestre susceptibleUSA
Variedad cultivada resistente a IMI en
estado vegetativo
Variedad resistente a IMI portadora
de modificadores
IMI: imidazolinonas (actúa sobre la misma enzima que la sulfonilurea)
Diversidad genética para la tolerancia a sulfonilureas en girasol
Variedad cultivada susceptible
Variedad cultivada confitura susceptible
Metabolismo de xenobióticos en plantas
Las enzimas responsables de la detoxificación de los xenobióticos están localizadas en, o asociadas con, distintas
organelas celulares. Las líneas discontinuas representan una ruta propuesta de glicosilación en el Golgi seguida
por exocitosis al apoplasma.
CT: Transportador de glutatión conjugado; AT: Transportador de xenobióticos aniónicos ATP dependiente;
GT: Transportador de glucósidos conjugados; VP: Peptidasa vacuolar.
Reacciones
catalizadas por
Cyt P450
monooxigenasa
[O]
Cyt
P450
[O]
Cyt
P450
[O]
Cyt
P450
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
1: aril hidroxilación
2: alquil hidroxilación
3: N-demetilación
El atomo de oxígeno que deriva de O2 se halla subrayado
Ejemplos de reacciones catalizadas por
monooxigenasas P-450 y glutatión transferasas
(sulfonilurea)
(dimetilurea)
(cloroacetamida)
[O] representa una oxidación. Los números (1,3) muestran reacciones
de hidroxilación o de N-demetilación que pueden generar sitios de
glicosilación. GSH representa una reacción de conjugación a glutatión
Detoxificación
por
conjugación
a glutatión
Metolachlor
(cloracetamida,
inhibidor del la
síntesis lipídica)
Complejo
Complejo
MetolachlorMetaclor-GS
Metaclor -GS
GS
Mecanismo de
selectividad en maiz.
Herbicida
GSH
GS-herbicida
Transporte
Modificación
y deposición
GS-herbicida
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Vacuola
Luego de la
conjugación, el
herbicida es
transportado a la
vacuola celular
Ocurrencia y distribución de biotipos de malezas resistentes
a herbicidas seleccionados bajo condiciones de cultivo
Aplicaciones biotecnológicas
al control de malezas
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la Biotecnología
al control
de malezas
Aplicaciones
biotecnológicas
al control
de malezas
- Uso de marcadores moleculares para estudios
de taxonomía y ecología de malezas.
- Uso de instrumentos genómicos y de la
proteómica para la identificación de blancos
para herbicidas y de los efectos de los
herbicidas.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la Biotecnología
al control
de malezas
Aplicaciones
biotecnológicas
al control
de malezas
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la Biotecnología
al control
de malezas
Existen diferentes estrategias para desarrollar nuevos
caracteres de resistencia a herbicidas en un
cultivo:
•
Caracteres nativos: identificados en viejos
cultivares, poblaciones, landraces, o especies
salvajes relacionadas (Ej: IMISUN en girasol).
•
Por mutagénesis: proceso químico o de
irradiación para generar nuevas variantes de
genes. Aumenta la tasa natural de mutación
(Ej: STS en soja)
•
Por transgénesis: introducción secuencias
génicas de otras especies a través de técnicas
transformación. (Ej: RR1, Enlist, NK603)
•
New Breeding techinques (NBTs): hace uso de
los métodos de transformación para “editar”
un gen de interés en una posición particular
para cambiar una característica (Ej: Canola
resistente a sulfonilurea)
Objetivos
buscados en
el desarrollo
de cultivos
tolerantes
a herbicidas
- Resolver un problema de malezas para el que
no haya herbicidas disponibles.
- Reemplazar las combinaciones de herbicidas
actualmente en uso por nuevos herbicidas
- Reemplazar un herbicida de altas dosis por uno
de bajas dosis
- Reemplazar herbicidas con propiedades
ecológicas superiores y/o toxicológicas inferiores
- Reemplazar a un herbicida de pre-emergencia
por uno de post-emergencia
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la Biotecnología
al control
de malezas
Usos de la
ingeniería
genética para
desarrollar
cultivos
tolerantes
a herbicidas
¿Por qué la tolerancia a herbicidas fue una de las primeras
aplicaciones de la ingeniería genética de plantas?
Cambio de paradigma en el negocio de los herbicidas
- Hasta mediados de los 90
- se probaban las moléculas nuevas por todas las
malezas y cultivos y se veía cual era la selectividad.
“Spray and pray”
- Los mecanismos de tolerancia a herbicidas se
conocían, por lo menos parcialmente, a partir
de estudios con aislamientos bacterianos resistentes,
selección in vitro de células vegetales y de
resistencia a campo en cultivos y malezas.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
.
.
- Resultaba claro que el fenotipo de tolerancia podía
obtenerse a partir de la introducción de genes
individuales. Ej: Resistencia a glifosato
Situación
actual
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
- Siglo XXI
-Existía un marcado interés económico por parte
de un importante grupo de empresas agroquímicas
por diversificarse en forma horizontal hacia el
negocio de semillas. Se desarrollan paquetes
tecnológicos que consisten en el uso de cultivos
resistentes (mutagénesis, ingeniería genética) para
ser usado con moléculas existentes no selectivas o
nuevas acompañados de propiedad intelectual
sobre el gen y el herbicida.
Cultivos tolerantes a herbicidas
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la Biotecnología
al control
de malezas
Usos de la
ingeniería
genética para
desarrollar
cultivos
tolerantes
a herbicidas
La tolerancia a herbicidas jugó un papel
fundacional en la biotecnología de plantas
- La ingeniería genética permitió la introducción
de variabilidad genética útil para el mejoramiento
de los cultivos por métodos no sexuales.
- Se conocían secuencias codificantes de variado
origen que podían conferir tolerancia a ciertos
herbicidas en las plantas que los expresen.
- Se disponía, asimismo, de las herramientas
necesarias para su correcta expresión en plantas
(promotores, péptidos señal, etc.).
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
- Las plantas transgénicas con tolerancia exclusiva a
herbicidas (soja, maíz, colza y algodón) o combinada
con resistencia a insectos (maíz y algodón) ocuparon
unos 147 millones de hectáreas a nivel mundial en
2013).
Sitios blancos de herbicidas que afectan las rutas
biosintéticas de aminoácidos esenciales
Estrategias
para obtener
cultivos
tolerantes
a herbicidas
mediante
ingeniería
genética
• Existen tres estrategias principales:
- Incrementar la expresión de la proteína
blanco del herbicida.
- Alterar el sitio de acción del herbicida.
- Introducir genes que permitan
la detoxificación del herbicida.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Herbicida, blancos primarios y estrategias para
desarrollar tolerancia a herbicidas en plantas
Estrategia
paratolerancia
desarrollar tolerancia
Estrategia para
desarrollar
Blanco primario
Detoxificaci
Blanco primario
ModificaciónModificación
del blanco del blanco
Detoxificación
Ruta inhibida
Herbicida
Fotosíntesis
Atrazina
Proteína Qb
Gen psbA mutado
(planta)
Gen GST
(planta)
Bromoxinil
Proteína Qb
--------------------
Gen bxn
(bacteria)
Fosfinotricina
Glutamina sintetasa
(GS)
Amplificación del gen GS
Gen bar
(bacteria)
Sulfonilurea e
imidazolinona
Acetolactato sintasa
(ALS)
Gen ALS mutado
(planta)
--------------------
Glifosato
5-enolpiruvil shikimato3-fosfato sintasa
(EPSPS)
Amplificación del gen
EPSPS; gen AroA mutado
(bacteria)
Gen gox
(bacteria)
2,4-D
No conocido
--------------------
Gen tfdA
(bacteria)
Biosíntesis de
aminoácidos
Regulación del
crecimiento
Tolerancia
a glifosato
Glifosato
- En 1974 se introdujo al mercado el herbicida Roundup®
cuyo ingrediente activo es el glifosato. Este es un herbicida
post-emergente de amplio espectro, no selectivo y seguro
desde el punto de vista ambiental (baja toxicidad para
organismos no blanco, bajo movimiento en el agua
subterránea y persistencia limitada).
- El glifosato inhibe, en plantas, bacterias, algas, hongos
y parásitos apicomplejos, la 5-enolpiruvil shikimato-3fosfato sintetasa (EPSPS), enzima clave para la síntesis
de aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina
y triptofano). En las plantas, esta ruta biosintética
(ruta del shikimato) tiene lugar en el cloroplasto.
N-(fosfonometil)glicina
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
glifosato
Ruta de
síntesis del
corismato
a partir de
fosfoenolpiruvato
y eritrosa
4-fosfato
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Además de la síntesis de tirosina, fenilalanina y triptofano, la ruta
del shikimato controla la síntesis de muchos compuestos importantes como la de la lignina, la de los flavonoides y la de algunos
alcaloides.
Tolerancia
a glifosato
Mecanismo de acción de la
5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato sintetasa
Enzima: 5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato sintetasa
S3P: shikimato-3-fosfato
PEP: fosfoenolpiruvato
EPSP: 5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
El glifosato actúa como un inhibidor competitivo
ocupando el lugar del PEP en el complejo enzimático
Homologías entre secuencias de EPSP sintetasas
Comparación entre las secuencias aminoácidicas maduras de EPSP sintetasa. Se muestran
las secuencias correspondientes a Petunia hybrida, Arabidopsis thaliana, Escherichia coli y
Saccharomyces cerevisiae. Las secuencias homólogas están subrayadas. Los aminoácidos
críticos están señalados con un asterisco
La EPSP
sintetasa es
transportada
al cloroplasto
mediante un
péptido señal
citoplasma
cloroplasto
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Comparación de las secuencias
de los péptidos señal de las
EPSP sintetasas de Petunia
hybrida, tomate y Arabidopsis
thaliana. Se señalan las
regiones de homología
Estructura
cristalina de
EPSP
sintetasa
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Estructura de la EPSP sintetasa de E. coli. Los residuos del
sitio activo están marcados en azul. La región en rojo es una
región altamente conservada. La conversión de la Gly 96
a Ala transforma a la enzima en tolerante a glifosato
Tolerancia
a glifosato
• Desarrollo de plantas transgénicas
. tolerantes a glifosato
- Se observó, tanto en bacterias como en cultivos
celulares de plantas, que el incremento en el número
de copias del gen codificante para la EPSPS confiere
tolerancia a este herbicida.
- Se obtuvieron plantas transgénicas de petunia
que expresaban un ADNc codificante para
la pre-proteína completa EPSPS de esa
misma especie bajo control del promotor 35S
del virus del mosaico del coliflor. Aunque la enzima
sobrexpresada era sensible al glifosato, estas plantas
eran tolerantes al herbicida.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
- Otra estrategia explorada fue la búsqueda de formas
variantes de la EPSPS que tuvieran simultáneamente
baja afinidad por el glifosato y buena actividad
catalítica. Se demostró que las plantas transgénicas
que expresaban una EPSPS heteróloga con estas
características, tenían muy buena respuesta frente
al herbicida.
Tolerancia
a glifosato
Catabolismo del glifosato por bacterias del suelo
C-P liasa: ruta presente en Pseudomonas
GOX: ruta presente en Gram positivas y Gram negativas
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
• Algunos formulados utilizan polioxietanolamina (POEA)
. como surfactante aniónico.
• POEA es 5 veces más tóxico que el glifosato.
Tolerancia
a glifosato
• Desarrollo de plantas transgénicas
. tolerantes a glifosato
- Se aisló el gen que codifica una EPSPS tolerante a
glifosato de la cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens
(cp4 epsps).
- Se clonó el gen gox, que codifica la enzima glifosato
oxidoreductasa (responsable del proceso de degradación
del glifosato por la ruta del ácido aminometilfosfónico) a
partir de la cepa LBAA de Achromobacter sp.
Cultivo
de soja
tolerante
a glifosato
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Gentileza Ing. Agr. S. Lorenzatti
Tolerancia mediante EPSPS insensible a glifosato
Algunas mutaciones
en la EPSPS pueden tornar
a la enzima insensible
al glifosato. La unión
de este herbicida
a la enzima nativa bloquea
su actividad e impide
el transporte del complejo
EPSPS-shikimato 3-fosfato
al cloroplasto. La enzima
producida por el gen mutado
(epsps*) tiene una menor
afinidad por el glifosato
y es catalíticamente activa
en presencia del herbicida.
Tomado de Coruzzi and Last, Biochemistry and Molecular Biolgy of Plants, 2000.
Tolerancia
a glifosato
Desarrollo de productos comerciales con tolerancia
a glifosato
• Mediante las estrategias mencionadas se desarrollaron en
varias especies eventos de transformación que confieren
tolerancia a glifosato.
• Algunos están disponibles a nivel comercial en varios
países:
- Soja: promotor 35S / secuencia codificante cp4
epsps (1996).
- Canola: Promotor FMV (Figwort mosaic virus) /
secuencia codificante cp4 epsps y promotor
FMV / secuencia codificante gox (1996).
- Algodón: promotor FMV / secuencia codificante cp4
epsps (versión sintética con optimización de uso
de codones; 1997).
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
- Maíz: promotor de actina 1 de arroz / secuencia
codificante cp4 epsps y promotor 35S /
secuencia codificante cp4 epsps (2001).
-Trigo: en etapas de evaluación en algunos países.
• Todos los transgenes mencionados contienen la secuencia de
un péptido señal de transporte a cloroplasto en su extremo 5´.
Integración del uso de plantas transgénicas de soja
tolerantes a glifosato con prácticas de siembra directa
Siembra directa de soja sobre
rastrojo de trigo
Siembra directa de soja sobre
rastrojo de maíz
Gentileza Ing. Agr. S. Lorenzatti
Conyza bonafriensis (rama negra)
Sorghum halepense
http://gmdd.shgmo.org
Disponibilidad de kits para
detectar presencia de ciertas
enzimas de origen transgénico en
muestras de tejido verde, semilla,
harinas .
Ej: Cp4EPSPS
http://cera-gmc.org (Centro para la valoración de riesgo ambiental)
Descripción
de eventos
transgénicos,
dossiers, links
a patentes,
etc.
Tolerancia
a glufosinato
Glufosinato
- El L-glufosinato (L-fosfinotricina) es el ingrediente activo
de herbicidas como Basta® o Liberty®. Es un herbicida
post-emergente, de amplio espectro, no selectivo y de baja
actividad residual.
- El bialafos es un producto de fermentación de Streptomyces
hygroscopicus que se comercializa en Japón desde 1984 bajo
el nombre de Herbiace®. Este pro-herbicida natural consiste en
L-glufosinato y dos residuos L-alanina. En la célula el bialafos
se convierte en L-glufosinato por acción de endopeptidasas.
- El L-glufosinato es un inhibidor potente de la glutamina
sintetasa, enzima que regula en las plantas la vía de asimilación
primaria y secundaria del amonio.
L-glufosinato
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
ácido 2-amino-4(hidroximetilfosfinil)
butanoico
La glutamino
sintetasa es
el sitio de
acción de la
fosfinotricina
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
La ruta de la glutamina sintetasa/glutamato sintetasa
(GS/GOGAT) constituye el principal mecanismo para
la asimilación primaria y secundaria del amonio
Inhibidores competitivos de la glutamina sintetasa
Metionin sulfoximina
.
(MSO)
L-Fosfinotricina
Lglufosinato
(L-PPT)
AcidoGlutamina
glutámico
Tolerancia a
glufosinato
Mecanismo de acción de la glutamina sintetasa
GS: glutamina sintetasa
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
El L-glufosinato actúa como un inhibidor
competitivo reversible ocupando el lugar
del L-glutamato en el complejo enzimático
Degradación
ambiental de
glufosinato
• El glufosinato tiene una movilidad en el suelo
. considerada baja porque es adsorbido por los
. coloides presentes en los estratos superiores
• La principal ruta de eliminación del glufosinato
. es la degradación microbiana, Burkholderia
. sacchari, Serratia marcescens, Pseudomonas
. psychrotolerans han sido reportadas como
. fuertes degradadores de glufosinato.
• Los productos de degradación comprenden al
. ácido 3-metilfosfinil propiónico y al ácido 2. metilfosfinil acético, los que a su vez se
. descomponen en PO4H3, CH4, NH3, CO2 y H2O.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
• La persistencia en el suelo, dependiendo de las
. condiciones ambientales, fluctúa entre 3 y 40 días.
Tolerancia
a glufosinato
• Estrategias para la obtención de plantas
transgénicas con tolerancia a glufosinato
- Se obtuvieron plantas transgénicas que sobrexpresaban
el gen de glutamina sintetasa bajo un promotor constitutivo.
Estas plantas toleraron al herbicida a pesar de expresar una
enzima sensible a glufosinato.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Tomado de Eckes et al., MGG,1989.
Plantas transgénicas de tabaco que sobrexpresan el den de la glutamina sintetasa
de alfalfa. Las plantas transgénicas (izquierda arriba) toleran una concentración
de 20 µM de L-glufosinato que resulta letal para la planta control (derecha abajo)
Tolerancia
a glufosinato
• Estrategias para la obtención de plantas
transgénicas con tolerancia a glufosinato
- Como estrategia alternativa, a partir de las
bacterias del suelo Streptomyces hygroscopicus
y Streptomyces viridochromogenes se clonaron
los genes bar y pat, respectivamente.
.
.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
.
.
- Ambos genes codifican la enzima fosfinotricinacetil transferasa que convierte al L-glufosinato
en una forma acetilada sin actividad herbicida.
- Esta enzima permite a estas bacterias defenderse
de la acción tóxica de la fosfinotricina que ellas
mismas producen.
Tolerancia
a glufosinato
• Obtención de plantas transgénicas
con tolerancia a glufosinato
- Las primeras plantas con niveles de tolerancia
a herbicidas suficientes para su uso agrícola
se construyeron expresando constitutivamente
el gen bar (tabaco, tomate y papa).
.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
.
.
- Los genes bar y pat se encuentran en varios
cultivares transgénicos que actualmente tienen
status comercial (maíz, colza, algodón, soja).
Estrategia de Non Target Site Tolerance.
- Los genes han resultado ser marcadores
seleccionables eficientes y por ello son usados
en muchos protocolos de transformación
genética.
Tolerancia a
glufosinato
mediada por
genes de
fosfinotricinacetil
transferasas
Evolución de la acumulación de NH4+
en plantas de tabaco transgénicas
transformadas con el gen bar
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Tomado de:
et al., Nature, 1986?.
Tolerancia
a glufosinato
Plantas de
Nicotiana
tabacum no
transgénicas
tratadas con
glufosinato
Plantas de
Nicotiana
tabacum
transformadas
con el gen bar
tratadas con
glufosinato
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Gentileza Dr. M. Van Montagu
El gen bar provee un alto nivel de tolerancia a glufosinato
Plantas transgénicas de Lycopersicon esculentum transformadas
con el gen bar (izquierda) y plantas control
no transgénicas (derecha) tratadas con glufosinato
Tolerancia a glufosinato
Plantas de Solanum tuberosum, transformadas con
el gen bar y plantas control, tratadas con glufosinato
Tolerancia
a glufosinato
-El glufosinato no es un herbicida muy difundido en
Argentina aunque el evento tiene liberación comercial
para soja, maíz y algodón. En este último cultivo, este
evento apilado con el de resistencia a glifosato tiene
evaluación favorable de Conabia pero aún no está
desregulado (a Septiembre de 2013, pendientes los
dictámenes favorables de Senasa y Dirección de
Mercados).
-En maíz generalmente está acompañando eventos
transgénicos de genes de resistencia a insectos, ya
que puede ser usado como marcador de selección
durante la transformación.
Eventos de resistencia a insectos y a glufosinato de
amonio en maíz:
BT11
Agrobiotecnología
TC1507
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Tolerancia
a inhibidores
de la acetolactato
sintetasa
• Herbicidas que inhiben la acetolactato sintetasa
- La acetolactato sintetasa (ALS; también llamada aceto
hidroxiácido sintetasa) es una enzima clave en la
biosíntesis de aminoácidos ramificados (leucina,
valina e isoleucina). Su inhibición causa la muerte
de la planta.
- La ALS es inhibida por herbicidas que pertenecen
a varios grupos (sulfonilureas, imidazolinonas
y triazolopirimidinas).
- Los herbicidas que inhiben la ALS son relativamente
recientes. El primero de ellos fue comercializado
en 1982 (chlorsulfuron, una sulfonilurea). Sin embargo,
han tenido una rápida difusión.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
- Este grupo de herbicidas es de amplio espectro, tiene
baja actividad residual en suelo y brinda una amplia
ventana de aplicación para el cultivo. La toxicidad para
mamíferos es baja.
Tolerancia a inhibidores de la acetolactato sintetasa
Estructuras químicas de algunos herbicidas que afectan a la ALS
chlorsulfuron (herbicida del grupo
de las sulfonilureas)
imazaquin (herbicida del grupo
de las imidazolinonas)
Ruta de
síntesis de
aminoácidos
ramificados
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
La acetolactato sintetasa (o acetohidroxiácido sintetasa )
es inhibida por la acción de sulfonilureas, imidazolinonas
y triazolopirimidinas
Tolerancia
a inhibidores
de la acetolactato
sintetasa
Mecanismo de acción de la ALS
ALS: acetolactato sintetasa (aceto hidroxiácido sintetasa)
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Las sulfonilureas actúan como inhibidores
competitivos del piruvato sobre
el sitio catalítico de la enzima.
Las imidazolinonas actuan como inhibidores
no competitivos con respecto al piruvato.
Tolerancia
a inhibidores
de la acetolactato
sintetasa
• Resistencia a inhibidores de la ALS en malezas
- El extenso y reiterado uso de los inhibidores de la ALS
hizo que, a pesar de su reciente difusión, la resistencia
a los mismos haya evolucionado en las malezas.
Así, hay actualmente más especies o biotipos
de malezas resistentes a este grupo de herbicidas
que a cualquier otro.
- La resistencia observada se debe generalmente
a mutaciones en el sitio blanco de estos herbicidas.
La ALS está codificada por el genoma nuclear
y la localización subcelular de la forma madura
de la enzima es el cloroplasto.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
- La resistencia observada en malezas es causada
por mutaciones puntuales que producen la sustitución
de uno cualquiera de cinco aminoácidos conservados.
(alanina 122, Prolina 197, alanina 205, triptofano 574, serina
653; secuencia de ALS de Arabidopsis thaliana)
Tipo y frecuencias de sustituciones aminoacídicas
encontradas en malezas resistentes a inhibidores de ALS
Tolerancia
a inhibidores
de la acetolactato
sintetasa
• Cultivos con tolerancia a campo a inhibidores
de la ALS
- Selección de plantas silvestres: se han aislado
plantas tolerantes a sulfonilureas e imidazolinonas en
girasol.
- Selección in vitro: Se han obtenido plantas de maíz
con resistencia a imidazolinonas mediante cultivo in
vitro de embriones en medio selectivo.
- Mutagénesis: Se han obtenido plantas resistentes
a imidazolinonas mediante tratamientos mutagénicos
de microsporas y posterior cultivo y selección in vitro
(colza). Asimismo, se obtuvieron plantas resistentes
a imidazolinonas por mutagénesis química
de semillas (arroz, trigo y maíz y girasol). También
se ha obtenido soja resistente a sulfoinilureas.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
- Plantas transgénicas: Se obtuvieron plantas
transgénicas de algodón (debida a la expresión
de una ALS de tabaco mutagenizada in vitro) , lino
(con expresión de una ALS de Arabidopsis) con
resistencia a sulfonilureas, soja (con expresión de
una ALS de Arabidopsis) y maíz (Als de maíz
modificado)
Genética de la tolerancia a inhibidores de AHAS en girasol
Ahasl1
Ahasl2
Ahasl1-3 Ahasl1-2 Ahasl1-1
Ahasl3
Ahasl1-4
197
205
203
Chloroplastic
transit peptide
1
Clearfield Plus
122
574
200
Sures
ExpressSun
400
Imisun/Clearfield
600
Air
(Amino acid number)
Distintos niveles de tolerancia
Mismo alelo de tolerancia de Ahas
With
Malathion
RHA426
100
Aboveground biomass
(%)
90
80
70
IMI-1
Target-type tolerance
Imr1 or
(AHAS activity)
Ahasl1-1
Non-target-type
tolerance (P450 +
others)
Imr2 or
~ 50%
60
50
40
30
20
~ 15%
10
Enhancer
0
0
100
200
300
400
500
600
700
-1
Imazapyr dose (g a.i.
ha -1)
Ref.: Bruniard & Miller, 2001; Sala et al., 2012, Poster # 138 (XVIII Congreso internacional de girasol). Breccia et al., 2012,
Poster # 019 (XVIII Congreso internacional de girasol)
Arrastre por ligamiento
La introgresión de un gen de resistencia desde una variedad silvestre puede traer
aparejada la introducción de otros genes ligados al gen de resistencia.
Tolerante
Susceptible
LG 9
9.4
X
10.1
13.1
9.4
9.2
21.4
Variedades tolerantes
11.2
1.4
3.2
4.7
9.4
9.4
HA89
1-1
1-2
1-3
1-4
1-5
1-6
1-7
1-8
1-9
1-10
HA425
IMISUN-1
Genoma cultivado
Altieri et al., ASAGIR 2010
Genoma silvestre
Fragmento heterocigoto
Genética de la tolerancia a inhibidores de AHAS en girasol
Ahasl1
Ahasl2
Ahasl1-3 Ahasl1-2 Ahasl1-1
Ahasl3
Ahasl1-4
197
205
203
Chloroplastic
transit peptide
1
Clearfield Plus
122
574
200
Sures
ExpressSun
400
Imisun/Clearfield
600
Air
(Amino acid number)
Desarrollo de resistencia a imidazolinonas en girasol
Generación de una población
mutante Ej: EMS
Aplicación del herbicida a
la población mutante
Selección de una planta
resistente
Caracterización molecular
Desarrollo de la tecnología
Comparación entre la tolerancia de dos diferentes caracteres: Imisun y CLPlus.
A
9
8
7
6
5
PI
0
B
4
40
80
160
Imazapyr rate (g a.i. / ha)
3
2
C
1
0
0
40
80
160
240
320
Doses of imazapyr (g.a.i.
PI: Indice de fitotoxicidad
A: susceptible B: Imisun
400
480
ha-1)
C: CLPlus
Fuente: Sala et al., 2012. XVIII Congreso internacional de girasol
Panel de arriba: Imisun
Panel de abajo: CLPlus
320
480
Comportamiento bajo condiciones de campo
CLPlus
Imisun
Dosis de imazapyr
0
1X
Fuente: Sala et al., 2012. XVIII Congreso internacional de girasol
2x
4x
Soja resistente a sulfonilureas obtenida por mutagénesis
• Sebastián et al. en 1989, obtuvo un mutante W20, que posee un alelo
semidominante del locus als1 de soja, que brinda tolerancia a las sulfonilureas.
Este gen ha sido introgresado en varios programas de mejoramiento.
•
Antecedentes en otras plantas tolerantes: Tolerancia específica a SU
otorgada por sustituciones de prolina en la posición 197 de la enzima
Se desconocía:
el número de genes Ahas en soja
cuál/es de ellos son los que se hallan involucrado/s en la tolerancia a SU
su localización genómica
el tipo de mutación que confiere la tolerancia
Fuente: Cecilia Ghio. Tesis “Ubicación genómica y secuenciación del gen que otorga tolerancia a las sulfonilureas
en el cultivo de la soja Glycine max (L.) Merr.”
Merr.” para la Maestría en Genética Vegetal ,UNR. Septiembre 2013
Tolerancia
a inhibidores
de la acetolactato
sintetasa
El trabajo que consistió en:
1.
2.
3.
un anáilisis in silico de secuencias para determinar el n°de
genes candidatos ahas en soja.
un análisis genético por medio de mapeo con marcadores
moleculares en una población de mapeo.
Comparación de las secuencias de la línea tolerante y susceptible
para determinar la mutación responsable de la tolerancia.
Als1 ubicado
cromosoma 4
Cambio aminoacídico
P197S: Prolina por
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Serina
4 secuencias Ahas en los cromosomas
4, 6, 13 y 15 con una alta similitud con
las secuencia del gen Ahas de A.
thaliana
Cultivos transgénicos con resistencia a inhibidores de AHAS
•Soja Cultivance ®: contiene el evento CV127 que brinda resistencia a
imidazolinonas. El evento contiene el gen Als de Arabisopsis thaliana con
la mutación en la posición 653. Regulado por el promotor nativo de
A.thaliana. Posee liberación comercial en Arg pero aún no se comercializa
como producto.
• Maíz Optimun GAT ®: contiene el evento DP-98140 que brinda
resistencia a glifosato y a imidazolinonas. El evento contiene el gen als de
maíz modificado y el gen de resistencia a glifosato producto de la
recombinación in vitro de tres genes de Bacillus lucheniformis que
codifican para la N-Acetiltransferasa que acetila al glifosato. Estos genes
están regulados por promotores de maíz. Se comportan como un locus
único. Liberado comercialmente en Argenitna en el 2011 pero aún no es
comercializado por la empresa propietaria del evento.
Una situación específica puede direccionar
una tecnología……
Ejemplo: Orobanche cumana en lotes de girasol
Interacción girasol-Orobanche
Orobanche cumana:
• planta holoparasítica (carece
de clorofila)
• Gran problema en europa
(muchas razas y rápido sorteo
de genes de resistencia)
Broomrape control – Managment
Different approaches
Preventing actions
Physical methods
Chemical methods
Agronomic methods
Biological methods
Crop resistance
Breeder tools
Fuente: Bulos, 2014
Any approach applied alone is often partially effective and the results
are sometimes inconsistent due to variable enviromental conditions,
and because of that, integrated methods combining different strategies
into a given farm system are the most effective ones.
Herbicide resistance + Orobanche genetic resistance
Development of traits for herbicide resistance in sunflower during the last
decade permits the combination of these technologies with Orobanche
resistance genes for a more sustainable strategy.
Also it will be possible to introduce new active ingredients in herbicides
formulations that are specific for the parasitic weed control and to develop
seed coatings using a variety of AHAS inhibitors
Or…
Ahasl1-…
and
Fuente: Bulos, 2014
Herbicidas que afectan la cadena de transporte
de electrones en el aparato fotosintético
PQ: Plastoquinona
Cyt b6f: Complejo citocromo b6f
PC : Plastocianina
Fdx: Ferredoxina
FNR: Ferredoxina NADP reductasa
CF0 y CF1: Complejos de la ATP sintetasa
Organización de los componentes de la cadena de transporte de electrones
del cloroplasto y del aparato de síntesis de ATP en la membrana tilacoidea
Herbicidas
que
afectan
la cadena
de transporte
de electrones
en el
aparato
fotosintético
DCMU, un inhibidor del Fotosistema II
Triazinas
Ureas sustituidas
Uracil herbicidas
Bromoxinil
Ioxinil
Desmedipham
DBMIB, un inhibidor del complejo Cytb6f
Propanil
Pirazon
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Metribuzin
Paraquat (metil viológeno), un inhibidor
del Fotosistema I
Herbicidas que afectan la cadena de transporte
de electrones en el aparato fotosintético
QA QB : Quinonas A y B
PQ: Plastoquinona
PC: Plastocianina
Pheo: Feofitina
Cytb6f: Complejo citocromo b6f
Fx, FA y FB: Centros Fe-S
atrazina
Sitios de acción del 3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetilurea (DCMU), de la dibromoquinona
(DBMIBl) y del metil viológeno (herbicida bipiridil; Paraquat) en los complejos fotosintéticos
Triazinas
• Selectividad bioquímica
- La atrazina fue uno de los herbicidas más usados en el mundo
y corresponde al grupo de las triazinas. Se comenzó a usar en la
década del ’50 pero se está dejando de usar.
- Estos herbicidas son inhibidores fotosintéticos. Su mecanismo
de acción consiste en unirse a la proteína D1 (proteína de unión
. a QB, ubicada), impidiendo así su bloqueando el transporte de
electrones hacia el Fotosistema II.
- La atrazina se usa en cultivos como el maíz, que son
resistentes al mismo por tener la capacidad metabólica de
detoxificarlo. Esto ocurre a través de los mecanismos
enzimáticos de protección frente a compuestos xenobióticos.
Atrazina
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Triazinas
• Selectividad debida a alteraciones en
el sitio blanco del herbicida
- En el contexto de reiterado uso de triazinas en monocultivo de maíz, Se
han identificado biotipos de malezas con resistencia a las mismas. Esta
resistencia se basa en la alteración del sitio blanco de estos herbicidas
. (proteína D1).
- La proteína D1 está codificada por el gen psb A, que está ubicado en el
plastoma. En varias especies vegetales se ha reportado como base
molecular de la resistencia a triazinas una mutación de puntual en el
codón 264 del mencionado gen, que produce una substitución de serina
por glicina en la forma resistente.
Tomado de: Rios et al., TAG, 2003.
En cebada,
a partir de un
genotipo mutado
de cloroplastos,
se aislaron dos
mutantes con
resistencia a la
atrazina.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Línea madre
Mutantes
Ensayo hidropónico en presencia de atrazina
Análisis molecular de mutantes de cebada
con resistencia a la atrazina
790
BstXI
277 pb
190 pb
87 pb
Est ándar
Comparación parcial de la secuencia
del gen psbA entre la línea madre (clon 1)
y una mutante con resistencia a atrazina
(clon 5). La sustitución de un nucleótido
(A por G) crea un sitio de restricción BstXI.
Cebada sensible
(línea madre)
Cebada resistente
(línea madre)
Colza
sensible
Colza
resistente
Est ándar
Detección por PCR-RFLP de una mutación
del gen psbA que confiere resistencia a
triazinas. Un fragmento interno de 277 bp
del mencionado gen fue amplificado por PCR
y posteriormente digerido con la enzima BstXI
y separado en un gel de agarosa de 2%.
Tolerancia
a atrazinas
• La proteína de 32 kDa (proteína de unión a QB o D1)
fue identificada como sitio de unión de las triazinas
en Amaranthus hybridus. Esta proteína integra el
núcleo del centro de reacción del Fotosistema II.
• En líneas resistentes de Amaranthus, se vio que las
triazinas no se unían a la proteína y se encontró una
mutación puntual de Ser a Gly en la posición 228.
• Se observaron mutaciones similares de la Ser 264
a Gly en la proteína de 32 kDa de Chlamydomonas
reinhardtii, Chenopodium album y Solanum nigrum.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
• La búsqueda de resistencia por ingeniería genética
se ha orientado a la introducción de proteínas de 32
kDa mutadas en plantas transgénicas y a la
detoxificación de atrazinas mediante la introducción
de un gen que codifica glutation-S-transferasa (GST).
El segundo enfoque ha dado mejores resultados.
Herbicidas
que
afectan
la síntesis de
carotenoides
• Tolerancia a pirazoles
- Los pirazoles son una familia de herbicidas inhibidores
de la enzima HPPD (4- hidroxifenilpiruvato-dioxigenasa).
- Topramezone es un herbicida selectivo de la familia de
los pirazoles para ser usado en el cultivo de maíz.
- Efecto de “bleaching” en las plantas produciendo la
muerte de las mismas.
- Se obtuvieron plantas transgénicas de soja resistentes
a inhibidores de HPPD.
- Estas plantas son resistentes a campo a los herbicidas
y están siendo evaluadas para su liberación
comercial en Argentina.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Efecto del herbicida
sobre plantas de soja
Otras
tolerancias
metabólicas
• Genes bacterianos detoxificantes
- Se obtuvieron plantas transgénicas de varias especies,
resistentes al ácido 2,4-dicloro fenóxiacético (2,4-D;
regulador de crecimiento de tipo auxínico) por expresión
de una monooxigenasa con gran especificidad
de sustrato, obtenida de Alcaligenes sp.
- Se obtuvieron plantas transgénicas de varias especies
que expresan una secuencia codificante para
una dehalogenasa, obtenida de Alcaligenes sp.
que confiere resistencia al herbicida dalapon
(inhibidor de la síntesis de lípidos).
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
- Se obtuvieron plantas transgénicas de varias especies
que expresan una secuencia codificante para
una carbamato hidroxilasa, obtenida de Alcaligenes sp.
que confiere resistencia al herbicida metolachlor
(pertenece al grupo de las cloroacetamidas que
inhiben la síntesis de lípidos).
Metabolismo de xenobióticos en plantas
Las enzimas responsables de la detoxificación de los xenobióticos están localizadas en, o asociadas con, distintas
organelas celulares. Las líneas discontinuas representan una ruta propuesta de glicosilación en el Golgi seguida
por exocitosis al apoplasma.
CT: Transportador de glutatión conjugado; AT: Transportador de xenobióticos aniónicos ATP dependiente;
GT: Transportador de glucósidos conjugados; VP: Peptidasa vacuolar.
Otras
tolerancias
metabólicas
• Genes eucarióticos detoxificantes
- Se obtuvieron plantas de tabaco que expresan
una glutation S-transferasa de maíz, tolerantes
a cloroacetamidas.
- Se obtuvieron plantas transgénicas de papa
con expresión constitutiva de 3 secuencias codificantes
de citocromo-P450 monooxigenasas humanas.
Estas fueron tolerantes a herbicidas de varios grupos.
- Se expresó en papa, bajo control de un promotor
inducible por benzotiadiazol, una secuencia
que codifica la citocromo-P450 monooxigenasa
de rata, sola o fusionada con una de levadura.
Las plantas fueron tolerantes a herbicidas del grupo
de las fenilureas.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
- Se obtuvieron plantas de tabaco y Arabidopsis
con expresión constitutiva de una citocromo-P450
monooxigenasa de topinambur (Helianthus tuberosus).
Estas resultaron tolerantes a fenilureas.
New Breeding techinques (NBTs):
Están surgiendo como una alternativa a los transgénicos, básicamente por
el costo de desarrollo y desregulación.
Existen distintos sistemas para lograr un mismo objetivo, pero todas basadas en
la edición genómica. Algunas de ellas con propiedad intelectual.
Zinc Fingers (ZFN)
CRISPR/CAS9
TALEN
CRISPR/CAS9
Este sistema es el más versátil y eficiente de los desarrollados hasta la fecha :
Se pueden generar :
•
Inserciones de secuencias nuevas (simil transgénico)
•
Sustituión nucleotídica (mutación dirigida)
•
Deleciones (Knock out de genes)
New Breeding techinques (NBTs)- Ejemplos
Desarrollos de OGMs en soja. Con aprobación comercial
1993 – RR1 Soybean (Monsanto)
1996 – LL Soybean (Bayer)
2012 – Intacta (Monsanto)
2013 – FG72 (Bayer)
2014 – Cultivance (BASF) , Enlist (Dow)
Croplife.com
Consideraciones sobre el uso
de cultivos / herbicidas
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
Criterios a
considerar
para evitar el
surgimiento
de resistencia
en malezas
• Transferencia de resistencia del cultivo a malezas
- No se conocen ejemplos de transferencia en 50 años
de uso intenso de herbicidas. La resistencia a herbicidas
en malezas evoluciona a partir del propio genoma de las
mismas. La transferencia de genes de resistencia
de malezas a plantas cultivadas es generalmente difícil.
- Una especie silvestre no se convierte en maleza
por incorporar un gen de resistencia a herbicidas.
• Cultivos que se convierten en malezas
- Las malezas voluntarias son un problema
anterior al desarrollo de las nuevas biotecnologías
(caso de la colza en Canadá).
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
- Ampliar el espectro de herbicidas a utilizar
en una especie particular para facilitar el control
de malezas voluntarias.
- Reservar un respaldo químico para el control
de malezas voluntarias.
Perspectivas
• Enfoques para mitigar la introgresión de genes de
tolerancia a herbicidas desde cultivos a malezas
emparentadas
- Utilización de apomixis.
- Selección de eventos de transformación ubicados
en genomas no compatibles con malezas
relacionadas al cultivo.
- Utilización de plantas transplastómicas.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
- Utilización de genes de resistencia a herbicidas
divididos, dirigidos a genomas diferentes y cuyos
productos se ensamblan de manera funcional
por trans-splicing de proteínas (inteínas).
Perspectivas
• Prevención del surgimiento de resistencia en malezas
- Evitar la utilización repetida del mismo herbicida.
- Evitar resistencia cruzada por herbicidas que actúan
sobre el mismo blanco (ejemplos, sulfonilureas,
imidazolinonas y triazolopirimidinas sobre ALS).
- No introducir resistencia a herbicidas en un cultivo
si hay malezas que se puedan cruzar con el mismo
(ejemplos, avena cultivada/Avena fatua y sorgo
cultivado/sorgo de alepo) y si estos herbicidas se utilizan
para controlar las mismas malezas en otros cultivos.
- Manejo agronómico que incluye rotación de cultivos,
conocer las malezas existentes en el lote, elección correcta
del o los herbicidas, fechas de siembra, densidad de
siembra.
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
- Apilamiento de genes de resistencia a herbicidas Ej: STSRR en soja. Se vienen eventos: RR x LL, 2,4D x FOPs, LL
x Dicamba, RR + herbicidas selectivos (Ej: Kixor en soja),
triples eventos.
- Necesidad de desarrollar nuevos herbicidas basados en
nuevos modos de acción.
Mayor
sustentabilidad
de los sistemas de
producción actuales
Fuente: Argenbio, ASA y Casafe
Manejo preventivo y no reactivo:
• limpieza de máquinas al ingresar al lote
• control de los primeros manchones
• monitoreo permanente y de calidad
• inclusión de cultivos de cobertura
• rotación de cultivos
• rotación de mecanismos de acción herbicida
• dosis adecuada
• calidad de aplicación
Nuevos enfoques basados para una reducción en el uso de herbicidas
• Utilización de biocontroladores transgénicos (hongos o insectos que
afecten a las malezas)
• Desarrollo de cultivos transgénicos con mayor expresión de substancias
alelopáticas
• desarrollo de cultivos transgénicos que compitan mejor contra las
malezas (uso de fertilizantes que puedan ser utilizados solo por los
transgénicos, como por ej; fosfitos (PO3-3)
• desarrollo de bioherbicidas
• aumento en la tasa de crecimiento vegetativo
• rotaciones de cultivos diversas
• intercropping
• control físico de malezas
• destrucción de la semilla de la maleza
• reducción en la semilla de la maleza
• RNAi technology (aplicación tópica y con dsRNA de secuencias de
enzimas resistentes a herbicidas)
source: Monsanto.com
Referencias
Agrobiotecnología
Aplicaciones
de la biotecnología
al control
de malezas
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Papa, J.C. 2012. Interferencia de Maíz Voluntario o Guacho (Zea mays L.) sobre
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