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Establecimiento de la prevalencia de la enfermedad producida por el Virus
del Oeste del Nilo en el Noreste de México y análisis de las cepas
circulantes del virus (SIP 20060351)
RESPONSABLE: DR. MIGUEL ÁNGEL REYES LOPEZ.
ALUMNOS PIFI: MC. MARÍA DE LOURDES GARZA RODRÍGUEZ
MC. CELIA NOHEMÍ SÁNCHEZ DOMÍNGUEZ
Introducción.
El Virus del Oeste del Nilo (VON) es un RNA virus que pertenece a la familia
de los flaviviridae y es similar a muchos otros virus transportados por
mosquitos, como el virus de la encefalitis Japonesa, dengue, entre otros. Desde
su llegada a América en 1999, el VON se ha esparcido rápidamente en EU y
Canadá. Este virus causa una enfermedad que puede ir de leve a severa que se
transmite a los humanos por picaduras de mosquitos infectados, sangre y
órganos infectados. El período de incubación es de 3-14 días y alrededor del
20% de las personas infectadas desarrollan fiebre. La enfermedad leve, es
similar a la gripe, y se conoce como fiebre del oeste del Nilo; las formas
severas de la enfermedad, son potencialmente mortales, y evolucionan a
encefalitis o meningitis del Nilo. Las manifestaciones clínicas van desde fiebre,
dolor de cabeza, salpullido, linfoadenopatía, dolor ocular, anorexia y vómito,
hasta casos de meningoencefalitis severa caracterizada por deterioro mental,
parálisis flácida, coma y muerte. El tratamiento es principalmente de soporte,
en algunos casos se recomienda el ingreso a cuidados intensivos. La prevención
de la infección consiste en la eliminación del mosquito y el uso de material de
protección, el uso de repelentes con DEET y la utilización de mangas y
pantalones largos para evitar picaduras. El diagnóstico de la infección por el
VON se confirma detectando anticuerpos contra el virus. El aislamiento del
virus a partir del líquido cefalorraquídeo (LCR) y el suero se complica debido a
la baja viremia. Las nuevas técnicas incluyen la detección de antígenos virales
por medio de ELISA, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR en
tiempo real. La PCR en tiempo real es la técnica más sensible, para la
identificación y cuantificación de agentes virales. El estándar de diagnóstico
de la infección es la detección de anticuerpos IgM en LCR o suero. Existe la
posibilidad de que el VON se propague en México, ya que recientemente se han
registrado casos en humanos en el Norte del país. Los Centros de Control de
Enfermedades (CDC) de EU alertaron al gobierno mexicano sobre los riesgos
de contagio en nuestro país, sin embargo hasta ahora no se han tomado las
medidas necesarias para la prevención y diagnóstico oportuno de esta
enfermedad. El riesgo de que el VON se propague en México es muy alto
debido a la cercanía con EU y la alta migración existente. En base a lo anterior,
es de suma importancia monitorear la presencia del VON en nuestra región.
Para ello es importante contar con herramientas diagnósticas sensibles y
específicas como el diagnóstico inmunológico y molecular. Además, este último
permitirá aumentar la sensibilidad en la detección independientemente de la
muestra clínica, de la etapa de la enfermedad y dependerá solo de la presencia
del virus.
Justificación
Como mencionamos anteriormente después de que el VON ingreso hace 5 años
a EU, se ha esparcido muy rápidamente a través de toda la Unión Americana.
Actualmente se siguen reportando brotes anuales de la infección por VON. Ya
han sido reportados los primeros casos de enfermedad del virus del oeste del
Nilo en el Norte de México en caballos, mosquitos y un caso en humanos. El
riesgo de que el virus del Nilo se propague en nuestro país es muy alto, por lo
que es importante establecer medidas de prevención y diagnóstico veraz y
oportuno.
Objetivo
Conocer la prevalencia de la enfermedad producida por el Virus del Oeste del
Nilo en humanos en el Noreste de México y analizar filogenéticamente las
cepas circulantes.
Metodología
Muestras biológicas: Las muestras biológicas que se incluirán en este estudio
serán principalmente sangre total, plasma, suero y/o líquido cefalorraquídeo
(LCR) de pacientes con probable infección por el virus del oeste del Nilo.
Asimismo, no se descarta la posibilidad de recibir diferentes muestras
biológicas de aves, caballos, mosquitos u otros animales posiblemente
infectados. Los pacientes provendrán de los centros de salud públicos y
privados del Noreste de México o de cualquier estado de la república Mexicana
que solicite el diagnóstico en nuestro laboratorio. Las muestras serán
recolectadas en nuestro laboratorio o fuera del mismo, siguiendo las
indicaciones para evitar la degradación ARN del VON.
El diagnóstico de infección por el VON se valorará en todas las muestras por
medio de tres técnicas para lograr identificar el mayor número de casos
posibles, las metodologías serán: ensayos inmunoabsobentes ligados a enzima
(ELISA), RT-PCR y PCR en tiempo real.
Ensayos Inmunológicos: Los ensayos de ELISA serán los primeros en
realizarse, ya que este tipo de ensayos son de rápido proceso y nos permiten
identificar aquellos sujetos que han estado infectados con el virus. Se utilizará
un ensayo de ELISA de tercera generación que detecta anticuerpos IgG e IgM
en contra del VON. Estas pruebas están basadas en la identificación de una
proteína recombinante ya aprobada por el Centro de Prevención y Control de
Enfermedades (CDC). La reacción consiste en la exposición de la muestra con
una proteína recombinante localizada en los pocillos de la placa de ELISA, se
agrega un conjugado de peroxidasa que reacciona con los anticuerpos IgM e
IgG y por último se agregan el sustrato y el cromógeno para que se desarrolle
el color. El cambio de colorse cuantifica por espectrofotometría leyendo la
densidad óptica (DO). El valor de DO de la muestra se compara con la lectura
de DO del control de referencia (cut off) para determinar la presencia de los
anticuerpos en la muestra analizada.
Resultados
Recolección de muestras de pacientes:
Se diseñó la carta de consentimiento y la hoja de recolección de datos (Anexo
1 y 2). El proyecto fue aprobado por el comité de ética de la Facultad de
Medicina de la UANL y el comité de Investigación del Hospital 33 del IMSS.
Muestras recolectadas a la Fecha:
Grupo de Pacientes
Pacientes Neurológicos
Pacientes con probable fiebre por
VON
Pacientes con Dengue
Número
29
169
44
Ensayos Inmunológicos:
Se estandarizaron las pruebas de ELISA para detección de anticuerpos del
tipo IgG e IgM.
Se estandarizó también las pruebas de detección de anticuerpos del tipo IgG
para el virus del Dengue por ser este virus endémico en nuestra región y por
que al pertenecer a la misma familia que le VON se presenta una reacción
cruzada de anticuerpos.
Se realizaron las pruebas de ELISA para VON y Virus del Dengue y se
obtuvieron los siguientes resultados:
Grupo de pacientes
IgG VON
+
Pacientes Neurológicos n=29
38%
Pacientes con cuadro clínico sugestivo 40.4%
de fiebre por VON n=169
Pacientes con Infección reciente por 79.5%
Dengue n=44
IgM VON
+
0 = 0%
0 = 0%
IgG
Virus
Dengue +
58.6%
57.9%
0 = 0%
100%
del
Conclusiones de las pruebas inmunológicas:
Se encontró una alta prevalencia de los anticuerpos IgG del VON en los
pacientes estudiados (38%), de los cuales desconocemos cuales están
realmente infectados por el VON. El diagnóstico serológico de pacientes
infectados con el VON se complica en la población del Noreste de México
debido a que las pruebas para detección de anticuerpos presentan reacción
cruzada con el Virus del Dengue, el cual es endémico en esta región. Es
necesario realizar un diagnóstico confirmatorio por medio de pruebas que
permitan diferenciar entre varios tipos de flavivirus. Otros experimentos a
realizar son los de detección del genoma viral en estas muestras, lo cual nos
permitiría además analizar las cepas circulantes del virus en nuestra región.
Impacto
Se creará un Sistema de diagnóstico molecular de VON en pacientes con
síntomas iniciales. Se contribuirá con la publicación de al menos un artículo en
revistas nacionales o ISI. Presentación de resultados en congresos nacionales
e internacionales en un campo del conocimiento que para nuestro país es
incipiente, sobre todo en el aspecto de salud humana