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Titulo del proyecto: Estudio de EhCFIm-25, un elemento trans-regulador del
procesamiento del extremo 3' del RNAm de Entamoeba histolytica
Registro: 20060252
Responsable: Dra. Laurence A. Marchat M. (ENMH)
1. Resumen
En eucariontes, la mayoría de los RNA maduros poseen una cola de poli(A) en su
extremo 3´ (3´UTR, por sus siglas en inglés Untranslated Region), la cual tiene un papel
esencial en la regulación postranscripcional ya que está involucrada en casi todos los
aspectos generales del metabolismo del RNAm: transporte del RNAm procesado del
núcleo al citoplasma, estabilidad del transcrito y traducción (Sachs et al., 1997). La
formación de la cola de poli(A) en el extremo 3´ del pre-RNAm consta de dos etapas: el
corte del transcrito primario, seguido por la adición de la cola de poli (A) río abajo del sitio
de corte. Requiere la participación de varios factores entre los cuales se encuentran los
factores de corte CFIm y el CFIIm en H. sapiens (Takagaki et al., 1989). En este trabajo,
reportamos la identificación y caracterización de un gen que codifica para un posible
factor de corte EhCFIm-25 en Entamoeba histolytica. El análisis de la secuencia
aminoacídica y su comparación con proteínas homologas de otros organismos muestra
que EhCFIm-25 posee el dominio NUDIX (101-156 aa) característico de estas proteínas
en otros organismos. El gen EhCFIm-25 se amplificó por PCR y se clonó en un vector de
expresión. La proteína EhCFIm-25 recombinante expresada en bacterias se utilizó para
generar anticuerpos específicos en conejo, los cuales reconocieron la proteína en el
núcleo de los trofozoítos en ensayos de Western blot. Mediante ensayos de interacción
RNA-proteína, demostramos que la proteína rEhCFIm-25 es capaz de unirse a un sustrato
de RNA, aun en ausencia de otro factor de poliadenilación.
2. Introducción
En eucariontes, la mayoría de los RNA maduros poseen una cola de poli(A) en el 3´UTR,
la cual tiene un papel esencial en la regulación postranscripcional ya que está involucrada
en casi todos los aspectos generales del metabolismo del RNAm: participa en el
transporte del RNAm procesado del núcleo al citoplasma, confiere estabilidad al transcrito
y promueve su eficiente traducción (Sachs et al., 1997). La formación de la cola de poli(A)
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en el extremo 3´ del pre-RNAm consta de dos etapas: el corte del transcrito primario,
seguido por la adición de la cola de poli (A) río abajo del sitio de corte. Los factores
involucrados en estos procesos fueron identificados y caracterizados en mamíferos y en
levadura, y se ha demostrado que todos son esenciales para la viabilidad de las células
(Zhao et al., 1999). En Homo sapiens, se requiere de la participación de seis complejos
multiproteicos: el Factor de la Especificidad del Corte y Poliadenilación (o CPSF por su
siglas en inglés “Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor”), el Factor Estimulante
del Corte (o CstF, “Cleavage Stimulation Factor”), los Factores de Corte I y II (o CFIm y
CFIIm, “Cleavage Factor” I y II, respectivamente), la Proteína de Unión al Poli (A) (o PAB)
y la Poli (A) Polimerasa o PAP. Los diferentes complejos se unen a secuencias
específicas presentes en la región 3´ no traducida del RNAm e interactúan entre si para
formar un multicomplejo de procesamiento del extremo 3´, cuyo ensamble permite el corte
endonucleolítico y la poliadenilación (Keller et al., 1997). Proteínas homologas han sido
identificadas en levadura y las reacciones de corte/poliadenilación parecen llevarse a
cabo de una manera muy similar. Alteraciones en alguno de estos factores transreguladores y en alguno de los eventos moleculares pueden generar transcritos
aberrantes que no se pueden traducir o bien que presentan cambios estructurales que
influyen de manera directa en la estabilidad y vida media del RNAm, modificando así la
regulación de la expresión génica (Zhao et al., 1999).
Como se menciono anteriormente, el corte del extremo 3´ del pre-RNAm requiere la
participación de los factores de corte. En H. sapiens, se han identificado dos factores de
corte, el CFIm y el CFIIm (Takagaki et al., 1989). El CFIm esta formado por tres
polipéptidos de 68, 59 y 25 kDa. El RBD (o RNA Binding Domain en inglés) se identificó
en el polipéptido de 68 kDa (Ruegsegger et al., 1996). Por sí solo, el CFIm tiene una
afinidad baja por el RNA, pero su interacción con el CPSF contribuye a la estabilidad
general del multicomplejo de procesamiento. Sin embargo, aún no se ha definido cual(es)
proteína(s) presenta(n) la actividad de endoribonucleasa.
En nuestro grupo de trabajo, estamos interesados en estudiar los mecanismo de corte y
poliadenilación de los transcritos en Entamoeba histolytica, el parásito protozoario
entérico responsable de la amibiasis humana. Esto con la finalidad de conocer mas
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acerca de los mecanismos que regulan la expresión de las proteínas involucradas en los
procesos de virulencia, patogenecidad y resistencia a drogas. Recientemente,
identificamos en el genoma de E. histolytica (htpp:www.tigr.org y http://www.sanger.ac.uk)
genes que codifican para proteínas homólogas a las que participan en el procesamiento y
poliadenilación del extremo 3´ del RNAm en mamíferos y levadura (López-Camarillo et al.,
2005). Nuestros resultados muestran que la amiba posee la mayoría de los factores
identificados en otros eucariontes, pero el análisis de los 3´UTR sugiere que las
secuencias cis-reguladoras podrían ser un poco divergentes, lo que hace de este parásito
un modelo interesante para estudiar las reacciones de corte/poliadenilación en la escala
evolutiva. Recientemente, reportamos la identificación y caracterización inicial de una
posible poli(A) polimerasa nuclear (EhPAP) en E. histolytica (Garcia-Vivas et al., 2005;
Proyecto 20040056). En el presente proyecto, nos enfocaremos al estudio del factor de
corte EhCFIm-25, ya que es un factor clave en la reacción de corte del 3´UTR del preRNAm, y por lo tanto en la formación de la cola de poli(A) del RNAm en este parásito.
3. Materiales y métodos
3.1. Cultivos de E. histolytica
Los trofozoítos (clona A de la cepa HM1:IMSS) se cultivaron axénicamente en el medio
TYI-S-33.
3.2. Clonación, análisis de secuencia, expresión y purificación de la EhCFIm25
recombinante
La secuencia codificante completa del gen EhCFIm-25 se amplificó por PCR usando
oligonucleótidos específicos, DNA genómico de la clona A y la enzima DNA Taq
polymerase high fidelity (2.0 U). El producto de PCR se clonó en los sitios de restricción
BamHI y HindIII del vector pBS, y posteriormente se subclonó en el vector de expresión
pRSET A (Invitrogen). Las construcciones se secuenciaron. La secuencia predicha de la
proteína
EhCFIm-25
se
analizó
con
los
programas
BLAST,
ClustalW
(http://www.expasy.org), Prosite (http://www.expasy.org), Pfam (http://www.sanger.ac.uk),
BioEdit
(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)
(http://www.megasoftware.net),
para
identificar
dominios
funcionales, así como realizar un análisis filogenético.
y
conservados
MEGA
y
regiones
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El vector pRSET-A conteniendo el gen EhCFIm-25 se utilizó para transformar bacterias E.
coli BL21-PLysS. La proteína EhCFIm-25 recombinante (rEhCFIm-25-6xHis) se expresó
en bacterias (IPTG 1 mM; 3 horas a 37 ºC) y se purificó por cromatografía de afinidad con
columnas de Ni2+-NTA (Qiagen). La identidad de la proteína fue confirmada por ensayos
de Western blot usando anticuerpos dirigidos contra la etiqueta de 6xHis (Roche) y el kit
de inmunodetección ECL Plus (Amersham).
3.3. Inmunolocalización
La proteína r EhCFIm-25 purificada (100 µg) diluida en el adyuvante de Freund se inoculó
por vía intramuscular (cuatro veces, cada 7-10 días) a un conejo libre de patógenos. La
calidad del anti-suero se verificó mediante ensayos de Western blot con la proteína
recombinante. También realizamos ensayos de Western blot con extractos nucleares y
citoplásmicos de trofozoítos de la clona A para determinar la localización subcelular de la
proteína nativa.
3.4. Interacción RNA-proteína
Utilizando el kit Riboprobe (Promega) se preparó una sonda de RNA radiactiva mediante
la transcripción in vitro del fragmento PSIII256 que contiene el extremo 3´ del gen EhPgp5
(López-Camarillo et al., 2003). Varias cantidades de la proteína rEhCFIm-25 purificada en
condiciones nativas se incubaron en presencia de la sonda y las interacciones se
analizaron por PAGE. Como controles, se adicionó RNAsa, PKC o RNA sin marcar.
4. Resultados
4.1. Análisis de la secuencia nucleotídica y aminoacídica
El gen EhCFIm-25 se identificó en el locus 40.m000216 (33615-32884 nt). Su longitud es
de 768 nt y codifica para una proteína de 255 aminoácidos con un peso molecular
predicho de 30 kDa. EhCFIm-25 presentan alta similitud con las proteínas eucarióticas
homologas, mostrando 27-35% de identidad y 45-59% de homología con las proteínas
homologas de levadura, protozoarios, nematodos, plantas y vertebrados. De manera
interesante, identificamos en el genoma de la amiba otro gen (locus 40.m000210, 707 nt)
cuyo producto (218 aa, 26 kDa) comparte una identidad y homología del 85% con
EhCFIm-25, por lo que ambas proteínas son consideradas como paralogas. Al analizar
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con mas detalles el scaffold 40, nos dimos cuenta que parece resultar de una duplicación
génica ya que contiene varios locus con la misma secuencia nucleotídica y que codifican
para la misma proteína.
El análisis in silico de la proteína EhCFIm-25 y su comparación con proteínas homologas
muestra que posee las principales características de estos factores, es decir el dominio
NUDIX (101-156 aa) y una posible señal de localización nuclear (26-42 aa). Además,
presenta varios sitios putativos de fosforilación que podrían ser importantes para la
regulación de la actividad de la proteína. El análisis filogenético mostró que EhCFIm-25
está agrupada con proteínas homologas de otros parásitos protozoarios, mientras que
parece ser mas divergente de las proteínas de levadura, plantas y vertebrados.
4.2. Expresión de la proteína EhCFIm-25 recombinante
El gen EhCFIm-25 se amplificó por PCR y se clonó en el vector de expresión pRSET-A.
Este se utilizo para transformar bacterias E. coli y obtener la proteína recombinante
EhCFIm-25, la cual fue reconocida por anticuerpos anti-His en ensayos de Western blot.
La proteína se purificó por cromatografía de afinidad en una columna de níquel y se
inoculó a un conejo para obtener el anti-suero. La calidad de los anticuerpos fue
comprobada mediante el reconocimiento de la proteína recombinante en ensayos de
Western blot.
4.3. Localización subcelular de EhCFIm-25
Par estudiar la localización subcelular de EhCFIm-25, realizamos ensayos de Western
blot con extractos nucleares y citoplásmicos de trofozoítos. De manera interesante, el antisuero identificó una proteína en el núcleo de los trofozoítos, lo que concuerda con la
posible función biológica de EhCFIm-25, involucrada en el corte y poliadenilación del preRNAm en el núcleo. Sin embargo, debido a la alta similitud en secuencia que existe entre
las dos proteínas EhCFIm-25 paralogas, no podemos descartar que los anticuerpos
reconozcan a ambas proteínas en las células. El peso molecular observado corresponde
a aproximadamente el doble del peso esperado, lo que sugiere que la proteína forma un
dimero, que no se disocia en las condiciones reductivas utilizadas (β-mercaptoetanol y
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calor). El anticuerpo detecto la misma banda en el citoplasma donde se realiza la
traducción.
4.4. Interacción RNA-proteína
Para iniciar el estudio funcional de rEhCFIm-25, evaluamos su actividad de unión al RNA.
Se realizó la transcripción in vitro del fragmento PSIII156 que comprende la región 3´UTR
del gen EhPgp5 en presencia de ATP radiactivo. Este fragmento contiene cuatro posibles
señales de poliadenilación y tres posibles sitios de corte. Los resultados muestran que la
proteína rEhCFIm-25 fue capaz de formar tres complejos específicos con la sonda de
RNA. Además, se observó una inhibición de la formación de los complejos al adicionar
anticuerpos anti-rEhCFIm-25, lo que confirma la especificad de la interacción.
5. Referencias
Keller et al., 1997. Curr Opin Cel Biol 9:329-336.
Sachs et al., 1997. Cell 89:831-838.
Zhao et al., 1999. Microbiol and Mol Biol Review 405-445.
Takagaki et al., 1989. Genes Dev 3:1711-1724
Ruegsegger et al., 1996. J Biol Chem 271:6107-6113.
López-Camarillo et al., 2005. Exp Parasitol 110, 184-190.
Garcia-Vivas et al., 2005. Exp Parasitol 110, 226-232
6. Impacto
El estudio de los factores responsables de la formación de la cola de poli(A) del RNAm en
E. histolytica nos provee de conocimientos y herramientas moleculares, las cuales podrán
ser utilizadas en el mejor entendimiento de la regulación de la expresión de genes
involucrados en la resistencia a drogas o virulencia de este parásito, para diseñar nuevas
drogas o vacunas en el futuro. Este trabajo es el primer reporte acerca del factor de corte
EhCFIm-25 en este parásito. Su caracterización molecular y funcional nos permitirá
entender mejor como se lleva a cabo el corte del pre-RNAm, una etapa esencial en el
procesamiento de los transcritos en E. histolytica.
En la realización de este proyecto, han participado varios estudiantes de la Maestría en
Biomedicina Molecular de la ENMH así como varios alumnos del programa PIFI. Dos
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alumnos obtendrán el grado de M. en C. en los próximos 6 meses. Con los resultados
obtenidos, se esta preparando una ponencia para presentar en un congreso nacional.