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IDENTIFICACION GEN nuc de S. aureus
DESDE CULTIVO PURO POR PCR
TRADICIONAL
Sección Microbiología
Alimentos
1.
PRT-712.07.076
Fecha emisión:
05-05-2008
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Fecha revisión:
05-05-2008
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OBJETIVO
Identificación de S. aureus por PCR desde cepa pura o colonia aislada.
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
Aplicar este procedimiento a colonias aisladas o ADN purificado de cepas aisladas y confirmadas
como S. aureus.
3.
FUNDAMENTO
La reacción en cadena de la polimerasa PCR es una técnica de alta sensibilidad por que se
recomienda tomar máximas precauciones, para evitar la contaminación de reactivos y muestras. El
análisis de muestras por PCR consta de: extracción y purificación de las muestras, preparación de la
mezcla de reacción y las muestras, reacción de PCR y confirmación de los productos de PCR en gel
de agarosa.
Este procedimiento describe la identificación de genes de especie Stahlylococcus aureus y se basa
en la detección del gen nuc, descrito por Odd G. Brakstad, Kjetill Savac and Johan Maeland, en
“Detection Stahlylococcus aureus by Polimerase Chain Reaction Amplification of the nuc Gene”,
Journal of Clinical Microbiology. Julio 1992.
4.
REFERENCIAS
4.1 Curso Teórico-práctico “PCR aplicada a microbiología de alimentos”, dictado entre el 27 de
noviembre y 7 de diciembre del año 2007 por experto JICA Doctor Katsuhiko Omoe.
4.2 “Detection Stahlylococcus aureus by Polimerase Chain Reaction Amplification of the nuc
Gene”, Odd G. Brakstad, Kjetill Savac and Johan Maeland, Journal of Clinical Microbiology.
Julio 1992. Vol 30 Nº 7 p. 1654 – 1660.
5.
TERMINOLOGÍA
5.1 ADN.: Acido desoxiribonucleico
5.2 PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
5.3 TBE : Buffer Tris- borato-EDTA
5.4 Tm: Temperatura de fusión
5.5 PM= Peso molecular
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MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1 Tubos Eppendorff de 10µl,50µl,100µl,500µl
6.2 Tubos Eppendorf Minispin
6.3 Micropipetas de rangos:1-20 µl, 10-100µl, 100-500µl
6.4 Gradillas para tubos de 0,5 mL, 1,7 mL y 2,0 mL
6.5 Taq polimerasa QUIAGEN multiplex PCR Kit (QUIAGEN S.A.,Cat. N° 206143)
6.6 Partidores SAnucF y SAnucR :
target gene: nuc, 279 bp (Brakstad OG, JCM 30:1654, Yamagishi N, Vet Rec 161:381)
SAnucF 5’- GCGATTGATGGTGATACGGTT -3’, Tm 65.67
SAnucR 5’- AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC -3’, Tm 69.12
6.7 Buffer TBE 0,5X
6.8 Cultivo de S. aureus de colonia pura
6.9 Caldo cerebro Corazón
6.10 Agarosa ( se recomienda Nusieve 3:1 al 3% usando 0,5X TBE buffer)
6.11 Agua calidad PCR
6.12 Reactivo Lyse-N-Go™ PCR (Pierce S.A. Cat.N° 78882, 10 ml/caja)
6.13 Termociclador
6.14 Equipo electroforesis
6.15 Transiluminador
6.16 Marcador
6.17 Bromuro de etidio 0,5%
6.18 Guantes
7.
7.1
DESARROLLO
CULTIVO DE S. aureus:
7.1.1 Sembrar por aislamiento cepa en estudio de S. aureus en agar cerebro corazón o agar infuso
corazón.
7.1.2 Incubar por 24 h a 35°C.
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7.2 Preparación mezcla de reacción para PCR:
7.2.1 Preparar la mezcla de reacción, según el esquema adjunto y luego agregar 45 uL de mezcla a
cada una de las muestras. Calcular el volumen de mezcla a preparar considerando el número
de muestras a analizar más un volumen para el control positivo, un volumen para control
negativo (mezcla sin ADN) y un volumen de reserva, este número multiplicarlo por el
“volumen/muestra”, Si el número de muestra es mayor a 15 considerar dos volúmenes de
reserva. Guardar la mezcla en hielo hasta realizar la lisis de L. monocytogenes y de las
colonias sospechosas.
Reactivo
Premix 2X (QIAGEN multiplex
PCR kit)
Mezcla de partidores lmo 2234
F/R
Agua calidad biología molecular
Volumen total
Volumen/muestra
25 µL
Concentración final
1X
4,0 µL
0,4 µM
16 µL
45 µL
-----------------------------
7.2.2 Centrifugar por dos a tres segundos entre 4.000 a 5.000 rpm cada reactivo antes de usar y
mantener en frío.
7.2.3 Una vez completa la mezcla de reacción centrifugar brevemente para evitar perdida de
reactivos en las paredes y tapas de los tubos. Guardar la mezcla refrigerada hasta su uso.
7.3 Lisis de S. aureus (Extracción de ADN genómico de S. aureus):
7.3.1 Agregar 5 µL de reactivo Lyse-N-Go en un tubo de PCR.
7.3.2 Tocar las colonias aisladas con mondadientes esterilizados y suspenderlas en el reactivo
Lyse-N-Go.
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7.3.3 Someter la suspensión al siguiente ciclo de desnaturación en termociclador.
N° Ciclo Temperatura °C
Tiempo
1
65
30 segundos
2
8
30 segundos
3
65
90 segundos
4
97
180 segundos
5
8
60 segundos
6
65
180 segundos
7
97
60 segundos
8
65
60 segundos
9
80
5 minutos
7.4 PCR:
7.4.1 Una vez terminados los ciclos en el punto 7.3, agregar 45 µL de la mezcla de reacción
preparada en 7.2.3 a cada una de las suspensiones sometidas a lisis.
7.4.2 Al tubo identificado como control positivo agregar 1µL de ADN genómico de S. aureus.
7.4.3 Al tubo identificado como control negativo agregar 1µL de agua.
7.4.4 Mezclar por centrifugación breve.
7.4.5 Someter las muestras al siguiente ciclo de temperatura:
N° Ciclo Temperatura °C
Tiempo
1
95
15 minutos
35
94
30 segundos
57
90 segundos
72
90 segundos
1
72
10 minutos
-----4
---7.5 Electroforesis:
7.5.1 Evaluar por electroforesis en geles de al 3% preferentemente marca Nusieve en buffer 0,5X
TBE.
7.5.2 Mezclar 2 µL de colorante con 10 µL de muestra. Mezclar con micropipeta. Aplicar en
pocillos del gel preparado.
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7.5.3 Incluir 10 µL del marcador en ambos extremos de las muestras sembradas
7.5.4 Someter a electroforesis por aproximadamente 1 hora a 120 volt.
7.5.5 Teñir el gel con una solución de Bromuro de etidio (EtBr) 0,5 mg/L durante 20 minutos.
7.5.6 Visualizar y fotografiar el gel en transiluminador.
7.5.7 Un resultado positivo de amplificación corresponde a un amplificado de tamaño esperado de
279 pb igual al control positivo. El control negativo no debe presentar ningún amplificado.
7.5.8 Informar como identificación positiva de S. aureus en colonia aislada
8.
REGISTROS
8.1. Registro de Análisis Identificación de S. aureus por PCR.
8.2. Fotografías de geles de Identificación de S. aureus por PCR
9.
ANEXOS
No Aplica