Download 1. INTRODUCCIÓN El tomate cultivado (Lycopersicon

1. INTRODUCCIÓN
El tomate cultivado (Lycopersicon esculentum Mill.), como toda especie de origen
tropical, es un cultivo sensible a temperaturas inferiores a los 10°C, con las que sufre
al menos un retardo en su crecimiento. Lo anterior ha restringido el desarrollo del
cultivo a zonas y épocas del año específicas, donde se presenten temperaturas cálidas
y las heladas pueden ser evitadas.
El desarrollo de cultivares de tomate con resistencia a las bajas temperaturas es de
suma importancia, ya que permitiría la realización del cultivo en zonas marginales en
términos de temperaturas. La resistencia al frío también podría reducir el gasto
energético dentro de un invernadero. En concordancia con lo anterior, se ha
confirmado la presencia de genes de resistencia a frío, en líneas genéticas que
corresponden a una población avanzada de retrocruza, en la cual, L. hirsutum f.
typicum ecotipo LA1777 actuó como parental donador de resistencia a frío y L.
esculentum cv. E6023 como parental recurrente (TAPIA, 2002). En dicho trabajo se
evaluó
el desarrollo vegetativo y reproductivo. Además ESCALONA (2003)
confirmó un mayor contenido de ABA en líneas resistentes a frío después de un
periodo de exposición a bajas temperaturas.
El desarrollo vegetativo y reproductivo de una planta, está condicionado en gran
medida, por la absorción de nutrientes y posterior asimilación de éstos, entregando
como resultado moléculas orgánicas. Algunas de estas moléculas forman parte de la
estructura de la planta y otras sirven para el funcionamiento de la misma.
La reducción de nitrato a amonio, se cataliza por dos enzimas, nitrato reductasa (NR,
EC 1.6.6.1) encargada de reducir nitrato a nitrito y nitrito reductasa que reduce nitrito
a amonio (MARSCHNER, 1995). La tasa de conversión de nitrato en amonio y
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posterior asimilación de este último, está directamente relacionada con el nivel de
actividad de las enzimas involucradas en el proceso.
El mayor desarrollo vegetativo que presentan las líneas genéticas de tomate
resistentes a frío en condiciones de bajas temperaturas, podría estar asociado a una
mayor capacidad para mantener activos los procesos bioquímicos. En consecuencia la
actividad de la enzima nitrato reductasa, se podría mantener en forma normal o al
menos presentar una rápida recuperación post estrés por frío.
El presente estudio, tiene como objetivo evaluar la evolución de la actividad de la
enzima nitrato reductasa en líneas genéticas de tomate que presentan resistencia al
frío, antes, durante y después de un periodo de exposición a temperaturas menores a
12°C.
Por otro lado se requiere poner a punto un método de laboratorio, que permita medir
la actividad de la enzima nitrato reductasa.
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2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. Descripción de la especie en estudio:
El tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), miembro de la familia Solanaceae, es
originario de las planicies costeras del oeste de Sudamérica, que se extienden desde
Ecuador a Chile (STEVENS y RICK, 1986). Al igual que todos los miembros de la
sub-familia Solanoideae, tiene como número de cromosomas básico x=12
(ESQUINAS, ALCAZAR Y NUEZ, 1995).
Esta planta es perenne, de porte arbustivo, pero se cultiva como anual. Puede
desarrollarse de forma rastrera, semirrecta o erecta, su crecimiento es limitado en las
variedades determinadas e ilimitado en las variedades indeterminadas (CHAMORRO,
1995).
Esta especie se desarrolla bien en un amplio rango de latitudes, tipos de suelos,
temperaturas y métodos de cultivo, y es moderadamente tolerante a salinidad. Sin
embargo, se adapta mejor en ambientes cálidos, con buena iluminación y drenaje. La
exposición prolongada a temperaturas inferiores a 10°C, una iluminación diurna
inferior a las 12 horas, un drenaje deficiente o un abonado nitrogenado excesivo le
afectan desfavorablemente (CHAMORRO, 1995).
2.2. Efecto de las bajas temperaturas en el desarrollo vegetativo:
Las temperaturas óptimas para el desarrollo del tomate son de 24-25°C durante el día
y 15-18°C durante la noche, bajo los 12°C se paraliza el desarrollo vegetativo
(RODRÍGUEZ, RODRÍGUEZ y MEDINA, 1984).
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La germinación está influenciada por la temperatura. El rango óptimo es entre 18 y
24°C (MOBAYEN, 1980) y la mínima entre 8 y 11°C (PICKEN, STEWART y
KLAWIJK, 1986).
La planta alcanza el máximo crecimiento y acumulación de materia seca con
temperaturas de suelo hasta 30°C, pero bajo 15°C el crecimiento se limita
drásticamente (PICKEN, STEWART Y KLAPWIJK, 1986).
La temperatura diurna afecta notoriamente la velocidad de crecimiento provocando
que se adelante la formación de hojas. Cabe señalar que el aumento en 1°C de la
temperatura media por 24 horas, aumenta la velocidad de crecimiento en un 10%
(BRUYNEL, 1993).
Respecto a la temperatura nocturna, FOLQUER (1979) señala que las plantas jóvenes
alcanzan su crecimiento máximo con temperaturas nocturnas de 26 a 30°C, pero al
aumentar su edad, dicho punto óptimo desciende hasta 14 ó 17° C. Para su óptimo
desarrollo, las temperaturas nocturnas deberían aproximarse a los 18° C (GRAHAM
y PETTERSON, 1982). Según WENT (1944), y WITTWER y AUNG (1969), citados
por WOLF et al. (1986), breves exposiciones a temperaturas nocturnas entre 10 y 16°
C durante el estado vegetativo de la planta de tomate, después de la total expansión
de los cotiledones, retrasan el crecimiento vegetativo y avanzan el crecimiento
reproductivo por una iniciación temprana de las inflorescencias.
La acción de temperaturas relativamente bajas entre 10 y 13° C a nivel radicular,
incrementa el número de flores iniciadas en el primer racimo, mientras que la acción
de estas mismas temperaturas a nivel aéreo acorta el número de nudos sobre los que
se desarrolla el primer racimo floral (RAPPORT y SACHS, citados por MAROTO,
1994).
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2.3. Mecanismos de resistencia al frío:
El daño por frío, ocurre en especies sensibles a las bajas temperaturas, pero no lo
suficientemente bajas como para formar cristales de hielo. La resistencia al frío es la
habilidad de resistir daños causados por temperaturas bajo los 10° C, pero por sobre
el punto de congelación (LYONS y RAISON, 1970).
En especies vegetales sensibles al frío, los lípidos de las membranas celulares poseen
un gran porcentaje de ácidos grasos saturados, los cuales tienden a solidificarse a
temperaturas cercanas a los 0°C. Las membranas comienzan a hacerse menos fluidas
y sus componentes proteicos no pueden funcionar normalmente, trayendo consigo la
inhibición de la actividad de la H+ ATPasa y del transporte de solutos dentro y fuera
de las células, y por consecuencia la inhibición del metabolismo dependiente de
enzimas. Un mecanismo fisiológico que presentan las especies resistentes al frío,
consiste en presencia de ácidos grasos insaturados en las membranas celulares (TAIZ
y ZEIGER, 1998).
El contenido endógeno de carbohidratos y la resistencia al frío están relacionados, ya
que se ha demostrado que los contenidos endógenos de almidón y azúcar, disminuyen
rápidamente en la planta durante un periodo de oscuridad, mientras que durante un
periodo de luz, por medio de una respuesta fotosintética, se produce una recuperación
de los niveles de carbohidratos en los tejidos, por lo que el aumento de la resistencia a
las bajas temperaturas, antes de los períodos de oscuridad, estaría asociada al
contenido de carbohidratos de las plantas (KING, DARYL y MICHAEL, 1988).
Debido a que las temperaturas en el hábitat de Lycopersicon hirsutum durante el día
son siempre mayores a 10° C, pero caen rápidamente bajo los 10° C en la noche, la
capacidad de resistencia al frío, puede basarse en una alteración fotosintética muy
lenta, y en una rápida recuperación de la misma (PATTERSON, 1988).
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2.4. Reducción de nitrato a amonio:
La reducción de nitrato a amonio, requiere la participación de dos enzimas, nitrato
reductasa que consume dos electrones en la reducción de nitrato a nitrito, y la enzima
nitrito reductasa con el consumo de seis electrones en la reducción de nitrito a amonio
(MARSCHNER, 1995).
El poder reductor para la reducción de nitrato a nitrito en plantas superiores, es
suministrado por piridín-nucleotidos reducidos, siendo el NADH la forma más
común. En el caso de la reducción de nitrito a amonio la reducción requiere seis
electrones donados por la ferredoxina (MALDONADO, AGÜERA y PÉREZ, 2000).
2.4.1. Descripción de la enzima nitrato reductasa:
La enzima nitrato reductasa es codificada por un gen (MALDONADO, AGÜERA y
PÉREZ, 2000). Está conformada por dos sub-unidades idénticas de aproximadamente
100 kDa, contiene flavina adenina di-nucleótido (FAD), hemo y un cofactor de
molibdeno como grupos prostéticos (LEA y LEEGOOD, 1999). Se han identificado
tres fragmentos funcionales de 28 kDa, 14 kDa y 75 kDa, que corresponden a los
dominios del FAD, hemo, y MoCo, respectivamente (SOLOMONSON y
BARBER,1990).
La enzima se encuentra ubicada en el citosol, aunque algunas veces se puede
encontrar unida a la plasmalema o a la membrana externa del cloroplasto
(MALDONADO, AGÜERA y PÉREZ, 2000).
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2.4.2. Mecanismos de regulación en la reducción de nitrato
La concentración de nitrato intracelular almacenado en la vacuola, es la principal
señal que controla la síntesis de nitrato reductasa en plantas superiores
(SOLOMONSON y BARBER, 1990). La adición de nitrato a las plantas produce en
las mismas un notable incremento en la actividad de la enzima nitrato reductasa
(MALDONADO, AGÜERA y PÉREZ, 2000). El aumento de los niveles de actividad
de la enzima nitrato reductasa en la raíz, por la presencia de nitrato, induce la síntesis
de novo y se obtienen plantas mas grandes. Esto depende de un incremento en la
velocidad de flujo dentro del pool metabólico de nitrato, que está condicionado por el
nivel del nitrato almacenado en la vacuola (LEA y LEEGOOD, 1999).
La luz incrementa la trascripción de los genes que codifican para la síntesis de nitrato
reductasa y nitrito reductasa. Además, ejerce un efecto regulador a través de
productos de la fijación fotosintética del dióxido de carbono, en efecto, la adición de
distintos azúcares a hojas mantenidas en oscuridad, ocasiona un aumento de la
síntesis de mRNA similar al producido por la luz, especialmente en el caso de la
nitrato reductasa. Por otra parte, el nitrógeno reducido en forma de glutamina o de
glutamato, reprime la síntesis de los mRNA de la nitrato reductasa y nitrito reductasa.
De esta manera, la inducción de la trascripción de los genes de ambas enzimas parece
estar regulada por el balance interno entre azúcares solubles y aminoácidos
(MALDONADO, AGÜERA y PÉREZ, 2000).
Además, de los mecanismos descritos, la nitrato reductasa regula su actividad por
activación /inactivación en respuesta a los cambios luz/oscuridad. En oscuridad la
enzima es fosforilada en un residuo de serina por una proteína quinasa, en ese
momento, se le adhiere una proteína inactivadora originándose una forma de baja
actividad. En presencia de luz la enzima, es desfosforilada por una fosfatasa, lo que
produce la reactivación de la enzima (LEA y LEEGOOD, 1999). La absorción de luz
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azul estimula el proceso de asimilación de nitrato, a través de una rápida activación
de la forma inactiva de la enzima nitrato reductasa. En contraste, la absorción de luz
roja estimularía la asimilación de nitrato, por medio de un aumento en la síntesis de la
enzima nitrato reductasa (MELZER, KLEINHOFS y WARNER, 1989).
2.4.3. Actividad de la enzima nitrato reductasa en tomate
Durante el crecimiento vegetativo, el sistema foliar del tomate aumenta
exponencialmente su capacidad para asimilar el nitrato disponible. Este incremento
tiene dos componentes, una mayor actividad de la enzima nitrato reductasa en las
hojas jóvenes, y un aumento en el peso fresco total del sistema foliar (BELLALOUI
y PILBEAM, 1990).
La luz estimula la actividad de la enzima nitrato reductasa, produciendo mayor
absorción de nitrato desde el sustrato, y un aumento en el transporte hacia las hojas
jóvenes, lugar donde se produce la mayor tasa de reducción de nitrato en la planta de
tomate (KIRKBY y KNIGHT, 1977).
El ritmo circadiano en la actividad de la enzima nitrato reductasa en tomate se maneja
principalmente, por los cambios en la expresión genética, y no por la fosforilación
que produce la inactivación de la enzima durante la noche. Se ha comprobado que las
oscilaciones del ritmo circadiano en la actividad de la enzima nitrato reductasa, están
sincronizadas con el nivel de transcripción de la enzima (JONES, TUCKER y ORT,
1998).La actividad de la enzima nitrato reductasa durante el ciclo de 24 h (día
/noche), aumenta por la mañana comenzando antes del alba, para tener un máximo
alrededor del medio día, y decaer durante la tarde; por la noche se registra el mínimo
de actividad (TREMBLAY et al., 1988).
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Se comprobó que tratamientos de frío, con temperatura constante de 4°C aplicados
sobre tomate, uno por seis horas en condiciones de iluminación permanente (450-500
µmoles fotones⋅m-2⋅s-1), y otro durante 10 horas en condiciones de oscuridad, retardan
el ritmo circadiano en la actividad de la enzima nitrato reductasa en intervalos de
tiempo similares a la duración de los tratamientos. Sin embargo, se produce una
recuperación más rápida del ritmo circadiano en las plantas expuestas a la luz
constante (JONES, TUCKER y ORT, 1998). Por otro lado TUCKER y ORT (2002),
afirman que la aplicación de un tratamiento de frío con temperatura de 4°C , por un
periodo de seis horas en condiciones de luz constante, rompe el ritmo circadiano en la
enzima nitrato reductasa, ya que tres horas después de la aplicación del tratamiento,
se produce un aumento en la actividad de la enzima, de forma independiente de la
fase oscilatoria del ritmo circadiano en que fue aplicado el tratamiento. Esta
afirmación concuerda con una propuesta que sugiere que el ritmo circadiano en la
enzima nitrato reductasa, se debe a las oscilaciones de la regeneración metabólica en
lugar de un reloj molecular interno (LILLO et al., 2001).
2.4.4. Cuantificación de la actividad de la enzima nitrato reductasa
Para la medición de la actividad de la enzima nitrato reductasa se han descrito dos
métodos, uno in vitro, y otro in vivo.
El método in vitro, tiene como principio la utilización de nucleótidos reducidos
(piridinas o flavinas), como donadores de electrones para la reducción de nitrato a
nitrito, debido a que en las plantas la enzima nitrato reductasa utiliza NADH como
principal donador de electrones. La actividad de la enzima, se mide normalmente por
determinación colorimétrica del nitrito producido; sin embargo, también puede
medirse siguiendo la oxidación de nucleótidos a 340 nm (HAGEMAN y REED,
1980).
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El principio del método in vivo, indica que mientras los trozos de tejido de la planta
contengan cantidades adecuadas de nitrato endógeno, y substratos para la generación
de NADH; por medio de la enzima nitrato reductasa y en condiciones de oscuridad,
se producirá un aumento del contenido de nitrito. Este método, se ha desarrollado
para proporcionar una estimación mas exacta de la reducción de nitrato in situ, pero el
resultado en términos de actividad de la enzima es 50 – 80% más bajo que con la
utilización de un método in vitro, sin embargo, ellos son correlativos (HAGEMAN y
REED, 1980).
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3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Ubicación:
El ensayo, se realizó en el Laboratorio de Fitogenética, y en la Estación Experimental
La Palma, Facultad de Agronomía, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso,
comuna de Quillota, provincia de Quillota, V Región, Chile.
3.2. Material vegetal:
En el ensayo, se utilizaron líneas casi-isogénicas, las que corresponden a una
población avanzada de retrocruza, en la cual L. hirsutum f. typicum LA1777
actuó
como parental donador de resistencia a frío y L. esculentum cv. E6023 como parental
recurrente. Estas líneas fueron seleccionadas por contener segmentos cromosómicos
distintos introgresados desde L. hirsutum en el trasfondo genético de L. esculentum.
Los segmentos cromosómicos donados por L. hirsutum, corresponden a pequeñas
regiones bien definidas que contienen genes que afectan características cuantitativas o
QTLs (quantitative trait loci), los que han sido ubicados en el genoma del tomate,
gracias al uso de marcadores moleculares (MONFORTE y TANKSLEY, 2000).
Para la realización del ensayo, se utilizaron las líneas, TA1315, TA1303, TA1111.
Estas líneas fueron seleccionadas por tener incorporados QTLs únicos en sus
cromosomas que les confieren resistencia a bajas temperaturas, en este caso las
introgresiones se encuentran en los cromosomas 3, 7, y 8, para las líneas TA1111,
TA1303, y TA1315 respectivamente (MONFORTE y TANKSLEY, 2000). Además,
se utilizó el cultivar E6203 como testigo.
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3.3. Ensayo: Evaluación de la actividad de la enzima Nitrato reductasa y
crecimiento vegetativo en líneas genéticas de tomate resistentes al frío:
3.3.1. Metodología
El ensayo se realizó entre el 3 de octubre y el 2 de diciembre del 2003.
La siembra, se efectuó el 3 de octubre (vivero). El trasplante se efectuó el 7 de
noviembre, con un índice de tres a cuatro hojas verdaderas en macetas de 0.75 l de
capacidad. Se utilizó como sustrato una mezcla de turba y perlita en una proporción
de 7:3. La mitad de las plantas se establecieron en una cámara bioclimática a 25 °C en
el día y 18 °C en la noche, con una intensidad de luz de 100 µmoles fotones m-2⋅ s-1, y
14 horas de iluminación; el tratamiento de frío, se realizó tres días post-trasplante
bajando la temperatura de la cámara a 12 °C en el día y 8 °C en la noche, por siete
días, y seguidos por siete días a la temperatura inicial. La otra mitad de las plantas, se
utilizaron como control siendo ubicadas en un invernadero frío sobre una mesa de 1
m de altura. Los registros de temperatura de ambos ambientes (frío y control), fueron
obtenidos con la utilización de un sensor de temperatura Thermocron (Dallas
Semiconductor Inc.), con intervalos de registro de 15 minutos (Anexo 1).
3.3.2. Variables evaluadas
3.3.2.1. Actividad de la enzima Nitrato Reductasa
Esta variable se evaluó antes del tratamiento de frío, durante el tratamiento, y luego
de siete días de recuperación a 25/18 °C (día/noche). Las plantas mantenidas en el
invernadero (testigo) fueron evaluadas a los mismos tiempos.
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Se utilizó el método in vivo, ex planta desarrollado por JAWORSKI (1971) y
modificado por O’CALLAGHAN (2000). Las muestras se obtuvieron entre dos y tres
horas después de iniciada la iluminación de la cámara. De cada planta, se extrajo con
un saca bocado dos muestras de tejido de 1 cm de diámetro (30 mg
aproximadamente) correspondientes a hojas nuevas expuestas a la luz. Cada muestra
se almacenó en un tubo de ensayo de 10 mL de capacidad, sobre un baño de agua
con hielo en condiciones de oscuridad. A cada tubo se agregó 5 mL de una solución
de incubación que tiene una concentración de 0.1M de K3PO4, 0.1M de KNO3, 3% de
1-propanol y pH 7.5. Inmediatamente después de agregar la solución a todos los
tubos, cada uno se burbujeo con N2, fue sellado con parafilm, se almacenaron en agua
con hielo y baja luminosidad; cuando todos los tubos estaban preparados, fueron
agitados durante 30 minutos en un baño de agua a 30 °C. Una vez terminado este
periodo de incubación, se zambulleron por medio de gradillas todos los tubos en un
baño de agua con hielo, para detener la actividad enzimática. De cada tubo, se tomó
una alícuota de 1 mL de extracto enfriado y se depósito en tubos de ensayo de 5 mL
de capacidad, los que contenían 1 mL de solución 11 mM de sulfanilamida disuelta
en HCl 3M; cuando todos los tubos contenían el extracto enfriado y la sulfanilamida,
se procedió a depositar 1mL de una solución 11mM de NEDD (N-1 naphthilethilenediamine dihydrochloride) en cada tubo. Los tubos fueron agitados para
mezclar la solución y almacenados en oscuridad durante 30 minutos, antes de que
fuesen leídos en espectrofotometro a 540 nm.
Para obtener la concentración de nitrito presente en el extracto enfriado, se interpoló
las lecturas de absorbancia obtenidas por medio del espectrofotometro; con una curva
de calibración (Figura 1) conseguida a partir de diferentes concentraciones (0, 20 ,40
60, 80, y 100 µM de nitrito de sodio) sometidas al mismo tratamiento del extracto
enfriado.
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3.3.2.2. Acumulación de materia seca
La medición de esta variable, se llevó a cabo transcurridos 20 días desde la fecha de
trasplante, para lo cual, se cortaron las plantas a nivel de cuello y se deshidrataron en
un horno hasta obtener el peso constante.
3.3.3. Análisis estadístico
El ensayo se analizó como un experimento factorial con un diseño completamente al
azar, tomando cada planta en una maceta como unidad experimental y unidad de
muestreo, siendo utilizadas 20 repeticiones por línea genética. El factor línea genética
contó con cuatro niveles, TA1315, TA1303, TA1111, y E6203; el factor temperatura
tuvo dos niveles, frío, y control.
La materia seca, se analizó utilizando los mismos factores y niveles que la variable
actividad de la enzima nitrato reductasa.
El modelo matemático para un diseño factorial considerando tres factores es el
siguiente:
Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij + ξijk , donde:
Yijk
:
Valor observado en cada unidad experimental
µ
:
Efecto de la media general sobre cada observación
αi
:
Efecto del i-ésimo valor de cada línea genética
βj
:
Efecto del j-ésimo valor de cada tratamiento de temperatura
(αβ)ij
:
Efecto de la interacción causada por la i,j-ésima combinación de los
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niveles de los factores
ξijk
:
Efecto del error experimental aleatorio sobre cada observación
Se verificó si existe efecto de los tratamientos con el análisis de Fischer. En aquellos
casos en que el análisis de varianza indicó que al menos un tratamiento es distinto de
los otros (P≤0.05), se realizó una comparación de medias con el test de Tukey,
comparando los tratamientos entre sí, con un α= 0.05. Los análisis se realizaron con
el software Minitab (Minitab Inc. Pennsylvania, EE.UU.).
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Curva de calibración
Y = 0.02585 + 0.009997X
R2 = 0.9962
1,2
Absorbancia
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
20
40
60
80
100
120
Concentración de NaNO2 (µM)
FIGURA 1: Curva de calibración utilizada para calcular la concentración de nitrito en
el extracto enfriado, a partir de concentraciones micromolares conocidas
de nitrito de sodio.
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4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1. Evaluación de la actividad de la enzima Nitrato Reductasa y crecimiento
vegetativo:
4.1.1. Actividad de la enzima Nitrato Reductasa
Durante la fase exponencial de crecimiento vegetativo, el tomate presenta un aumento
de la actividad de la enzima nitrato reductasa (BELLALOUI y PILBEAM, 1990). Se
esperaba que las líneas al ser expuestas a condiciones de baja temperatura,
mantuviesen la actividad de la enzima nitrato reductasa, o al menos presentaran una
rápida recuperación post estrés por frío (BLOOM et al., 1998).
Al analizar los resultados de este parámetro no se detectó interacción entre los
factores, línea genética, y temperatura por lo que cada factor se estudió por separado.
Del análisis del Cuadro 1, es posible afirmar que en el tiempo 0, hubo diferencia
significativa entre las líneas TA1315 y TA1303, donde la línea TA1315 presentó un
14.2 % más de actividad de la enzima nitrato reductasa que la línea TA1303. En el
tiempo 1 la línea E6203 (control), presentó un 24.4 % más de actividad de la enzima
nitrato reductasa que la línea TA1303. En el tiempo 2 (recuperación) no se observó
diferencias significativas entre las líneas.
En cuanto al factor temperatura, según indica el Cuadro 1, se observa que, para el
caso del tiempo 0, la actividad de la enzima nitrato reductasa en las plantas dispuestas
en el invernadero (control) fue 3.6 veces la actividad registrada en las plantas de la
cámara (frío). En el tiempo 1 la situación fue inversa, ya que las plantas de la cámara
produjeron dos veces más actividad de la enzima nitrato reductasa que las plantas del
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invernadero. En el tiempo 2 (recuperación) las plantas del invernadero vuelven a
presentar una mayor actividad de la enzima nitrato reductasa que las plantas
dispuestas en la cámara.
CUADRO 1. Actividad de la enzima nitrato reductasa en líneas genéticas de tomate,
antes, durante, y después de ser sometidas a un estrés por frío.
Factor
Nivel
Línea genética
E6203
TA1315
TA1303
TA1111
Temperatura
frío (cámara)
control (inv.)
Actividad de la enzima Nitrato reductasa (µmol NO2.mg-1.h-1)
Tiempo 0
Tiempo 1
Tiempo 2
25/18°C
7 días a 12/8°C
7 días rec. a 25/18°C
1,6647 ab
0,6950 a
0,3119NS
1,7639 a
0,6104 ab
0,3175
1,5182 b
0,5585 b
0,3001
1,6038 ab
0,6097 ab
0,2875
0,7163 y
2,5591 x
0,8271 x
0,4097 y
0,1025 y
0,5059 x
Letras iguales en la columna indican que no se detectó diferencias significativas entre
las medias. Test de Tukey (α=0.05).
NS: No significativo (P>0.05)
rec: recuperación.
inv: invernadero
Según el análisis realizado, no hay evidencia fenotípica de los QTLs introgresados en
las líneas con resistencia a frío, expresada como actividad de la enzima nitrato
reductasa, lo que indica que no habría relación de dicha variable y la resistencia a
frío presente en las líneas casi-isogénicas, expresada en términos de desarrollo
vegetativo y reproductivo (TAPIA, 2002).
TRUCO et al. (2000), detectaron QTLs donados por L. hirsutum a L. esculentum por
medio de retrocruza inter-específica. Para la variable desarrollo vegetativo, medida
durante y después de un tratamiento de frío a 4° C (temperatura de suelo),
reconocieron entre 2 y 4 QTLs que otorgaban resistencia a frío. Para el caso de la
captación de amonio, los híbridos F1 no produjeron el efecto deseado, ya que, la
captación de amonio post estrés por frío disminuyó en comparación a L. hirsutum.
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El aumento observado en este ensayo en la actividad de la enzima nitrato reductasa,
que se produce después de un periodo de exposición a bajas temperaturas, ha sido
descrito previamente en tomate por TUCKER y ORT (2002), quienes comprobaron
que después de tres horas post tratamiento de seis horas de exposición a 4° C de
temperatura, se producía un aumento en la actividad de la enzima nitrato reductasa.
Por lo tanto, el aumento que se produce en el presente ensayo de la actividad de la
enzima nitrato reductasa durante el tratamiento de frío, se puede deber a la exposición
de las plantas a 8° C durante la noche, ya que, las muestras utilizadas para medir la
actividad de la enzima nitrato reductasa eran obtenidas entre dos y tres horas después
de iniciada la iluminación de la cámara, donde la temperatura aumentaba a 12° C.
4.1.2. Análisis del método de laboratorio utilizado
El método in vivo, ex planta, desarrollado por JAWORSKI (1971) y modificado por
O’CALLAGHAN (2001), proporciona una medición más exacta de la reducción de
nitrato in situ. Sin embargo, como se trabajó con tejido vivo, fue necesario tener
algunos cuidados, como bajar rápidamente la temperatura de la muestra, para
disminuir el metabolismo, pero sin llegar a provocar daño al tejido por la formación
de cristales de hielo. Por otro lado, se preparó las muestras en condiciones de
oscuridad para inactivar la enzima (LEA y LEEGOOD, 1999). La solución de
incubación tuvo pH 7.5, condición necesaria para el óptimo funcionamiento de la
enzima (SOLOMONSON y BARBER, 1990), además, la solución de incubación
contievo n-propanol alcohol necesario para aumentar la permeabilidad de las
membranas (JAWORSKI, 1971), para este ensayo se utilizó 1-propanol, solvente que
fue probado durante el experimento en un ensayo preliminar a distintas
concentraciones en la solución de incubación, obteniéndose los mejores resultados
con un 3%, concentración utilizada en el ensayo definitivo.
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Al comparar el método in vivo utilizado en este ensayo, con un método in vitro, se
puede afirmar que el método utilizado requiere de pequeños trozos de tejido,
permitiendo realizar varias mediciones en plantas pequeñas, además es recomendado
para especies con alto contenido de proteínas inactivadoras (HAGEMAN y REED,
1980), ya que utilizando el método in vitro, estas pueden actuar antes de la extracción
de la enzima nitrato reductasa, obteniéndose datos errados. El resultado en términos
de actividad de la enzima nitrato reductasa es 50 – 80% más bajo en el caso del
método in vivo con respecto al método in vitro, sin embargo, ellos son correlativos
(HAGEMAN y REED, 1980).
4.1.3. Materia seca
Este parámetro, es el resultado del crecimiento desarrollado por las plantas hasta los
20 días post transplante. Se utilizó para comparar la acumulación de materia seca en
las diferentes líneas genéticas, sometidas a dos tratamientos de temperatura.
Al analizar los resultados de este parámetro, no se detectó interacción entre los
factores línea genética y temperatura, por lo que cada factor se estudió por separado.
De acuerdo a lo descrito en el Cuadro 2, se puede observar que no existe diferencia
significativa entre las líneas resistentes a frío y la línea E6203. Solamente se puede
afirmar que la línea TA1303 acumuló un 15% más de materia seca que la línea
TA1111.
En el caso del efecto producido por el factor temperatura el Cuadro 2, muestra una
clara diferencia donde las plantas control acumularon un 93% más de materia seca
que las plantas expuestas al frío. Al comparar la temperatura de las plantas en
invernadero y cámara, se observa que el control tuvo un promedio de 20.4° C,
mientras en
la cámara se registró 11.7/8.5° C durante los siete días con bajas
21
temperaturas, y 22.9/18.1° C durante la recuperación. PICKEN, STEWART y
KLAPWIJK (1986) establecieron que las bajas temperaturas reducen la acumulación
de materia seca.
CUADRO 2. Acumulación de materia seca.
Factor
Línea genética
Nivel
E6203
TA1315
TA1303
TA1111
Materia seca (g)
0,7970 ab
0,7710 ab
0,8365 a
0,7268 b
Temperatura
frío
control
0,5341 y
1,0315 x
Letras iguales en la columna indican que no se detectó diferencias
significativas entre las medias. Test de Tukey (α=0.05).
El hecho de que las plantas control, presentan una mayor actividad de la enzima
nitrato reductasa durante más tiempo podría estar relacionado con la mayor
acumulación de materia seca, ya que según BELLALOUI y PILBEAM (1990) la
actividad de la enzima nitrato reductasa aumenta el crecimiento vegetativo en tomate.
Las condiciones ambientales en el invernadero no son controladas. En experimentos
futuros se debiera mantener el grupo control en una cámara de crecimiento a
temperatura normal (25/18° C).
22
5. CONCLUSIONES
El método in vivo, ex planta, permite cuantificar la actividad de la enzima Nitrato
reductasa.
La temperatura no afecta la evolución de la actividad de la enzima nitrato reductasa,
en las líneas de tomate resistentes al frío, por lo que en este caso, no hay evidencia
que indique la expresión fenotípica de los genes introgresados a los cromosomas 3,
7, y 8, correspondientes a las líneas TA1111, TA1303, y TA1315 respectivamente.
23
6. RESUMEN
Debido a la necesidad de disponer de variedades de tomate resistentes al frío, se ha
obtenido mediante procesos de retrocruza y utilización de marcadores moleculares
líneas casi-isogénicas con segmentos cromosómicos de L. hirsutum, que aporta genes
de resistencia al frío y L. esculentum, con las otras características agronómicamente
relevantes. Gracias a respuestas fenotípicas a condiciones de baja temperatura
expresadas en desarrollo vegetativo, reproductivo, y cambios moleculares, se han
identificado líneas casi-isogénicas con resistencia al frío.
El mayor desarrollo vegetativo que presentan las líneas genéticas de tomate
resistentes a frío en condiciones de bajas temperaturas, podría estar asociado a una
mayor capacidad para mantener activos los procesos bioquímicos. En consecuencia la
actividad de la enzima nitrato reductasa (NR, EC 1.6.6.1), se podría mantener en
forma normal o al menos presentar una rápida recuperación post estrés por frío.
En esta investigación, se analizó el comportamiento de la actividad de la enzima
nitrato reductasa. Para medir esta variable, se utilizó un método in vivo ex planta,
donde se necesitó como medio de reacción una solución que contuvo nitrato de
potasio, fosfato de potasio, y 1-propanol, con pH 7.5, en la cual se incubaron
pequeños trozos de hoja, luego por colorimetría utilizando una alícuota del estracto
enfriado y otra del reactivo NEDD (N-1 naphthil-ethilenediamine dihydrochloride),
se midió el nitrito producido en un tiempo determinado. Esta variable, se cuantificó
en líneas genéticas de tomate resistentes al frío, antes, durante, y después de un
periodo de exposición a temperaturas inferiores a 12° C. Se utilizaron las líneas
TA1315, TA1303, y TA1111 que presentan introgresiones provenientes de L.
hirsutum en los cromosomas 8, 7, y 3 respectivamente, además del cv E6203 como
testigo (padre recurrente). Dichas líneas fueron expuestas a dos ambientes de
temperatura distintos, frío (cámara bioclimática 11.7/8.5° C), y control (invernadero
24.8/12.6° C). Al término del experimento se cuantificó la acumulación de materia
seca.
No se detectó expresión fenotípica de las introgresiones en los cromosomas 3, 7, y 8
respecto de las variables analizadas. Tal vez al aumentar el tamaño del experimento y
evaluar otras líneas se pueda detectar la expresión fenotípica de QTLs (Quantitative
Trait Loci) asociados a un aumento en la actividad de la enzima nitrato reductasa en
condiciones de frío.
24
7. ABSTRACT
Given the necessity of producing tomato varieties with increased chilling tolerance, a
backcrossing process using the wild species Licopersicon hirstum (donor of chilling
tolerance genes) and a cv of L. esculentum (donor of the other agronomically relevant
characteristics), and aided by molecular markers, has obtained nearly-isogenic lines
presenting chilling tolerance. The phenotypic responses to chilling temperatures as
expressed in vegetative and reproductive development and in molecular changes,
have allowed the identification of nearly-isogenic lines presenting chilling tolerance.
These tomato lines showed a higher level of vegetative growth under chilling
temperatures when compared to the commercial tomato cultivar. This could be
associated with the ability to maintain the activity of the biochemical processes. The
hypothesis of this work was that the activity of the Nitrate Reductase enzyme (NR,
EC 1.6.6.1) might be normal or at least have a rapid recuperation after being
subjected to chilling stress.
In this study, the activity of the NR enzyme was analyzed. To achieve this an in-vivo,
ex-planta approach was used. This consisted of the incubation of small leaf pieces in
a solution containing potassium nitrate, potassium phosphate, and 1-propanol with a
pH of 7.5. After which, the nitrite produced was measured in one aliquot of the
cooled extract and in one aliquot of the NEDD (N-1 naphthil-ethilenediamine
dihydrochloride) reagent by a colorimetric method before, during, and after a period
of exposure to chilling temperatures below 12° C. This variable was measured in the
TA1315, TA1303, and TA1111 genetic lines, which were introgressed with genes of
L. hirsutum, on chromosomes 8, 7, and 3, respectively. The recurrent parent, cv
E6203, was also measured as a control. These lines were subjected to two
temperature treatments, one in a bioclimatic chamber 11.7/8.5° C the other in a
greenhouse with a temperature of 24.8/12.6° C as a control. At the end of the
experiment the dry matter accumulation was measured.
No phenotypic expression of the introgressions on chromosomes 3, 7, or 8, was
detected among the variables analized. An increase in the size of the experiment and
the evaluation of other genetic lines might be useful in further detection of QTLs
(Quantitative Trait Loci) associated with an increase in the activity of the NR enzyme
under chilling conditions.
25
8. LITERATURA CITADA
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