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Introducción y remoción de la mutación
G2019S del gen LRRK2 en una cohorte de
líneas iPSC derivadas de pacientes de
Parkinson e individuos control mediante
TALENs
Simposio - Herramientas para la edición génica:
ventajas y dificultades en su aplicación práctica
MADRID 2014-07-04
Carles Calatayud Aristoy
Parc Científic de Barcelona
Edición Génica en Enfermedad de Parkinson
(EP)
Generación de clones isogénicos:
•  Introducir mutaciones en individuos wild-type.
•  Reparar mutaciones en individuos portadores.
Generación de líneas reporteras usando loci endógenos.
•  Introducción de casetes de proteínas fluorescentes en la región
3’UTR de genes relevantes en el proceso de diferenciación.
Generación de Clones Isogénicos
¿Cuál es la necesidad de disponer de clones isogénicos
como controles en EP?
Base genética
incierta
Interacción con
el ambiente
Demasiadas
variables
confundentes
Multiples alelos
que modifican
el riesgo
Generación de Clones Isogénicos
EP y mutaciones en el gen LRRK2:
•  Mutación más común (≈10%).
•  Presente en individuos con EP idiopático.
•  EP indistinguible de la EP idiopática.
•  Penetrancia incompleta y muy dependiente de la población:
En la población cántabra sólo el 47% de los portadores
desarrollan la enfermedad a los 80 años (Sierra M. et al.,
2011)
Generación de Clones Isogénicos
Generación de Clones Isogénicos
Características ssODN:
•  90 nucleótidos con el nucleótido mutado en la posición central.
•  Sin ninguna modificación.
Características TALENs:
•  Generadas en el laboratorio del Dr. Claudio Mussolino (CCI-Universitätsklinikum
Freiburg).
•  Arquitectura concebida en el laboratorio de Thomas Lahaye.
•  19 pb siendo el primer nucleótido una T.
•  Uso del RVD NN para el reconocimiento de G.
•  Spacer óptimo de 12-14 pb según experiencia del laboratorio.
Generación de Clones Isogénicos
Requisitos para la edición génica en iPSC:
1.  Establecer un método de transfección eficiente (considerar FACS).
2.  Determinar el par de TALENs con mayor eficiencia de corte.
3.  Establecer un método de screening fiable.
Generación de Clones Isogénicos
1.  Establecer un método de transfección eficiente (considerar
FACS).
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• 
Electroporación/nucleofección
Ca2(PO4)3
Química (PEI)
Liposomal
Vectores virales
Administración de la proteínas
Control no transfectado
84%
FuGENE HD + pRFP + pTALENs + ssODN
Generación de Clones Isogénicos
2.  Determinar el par de TALENs con mayor eficiencia de corte.
Ensayo de la endonucleasa T7E1 para evaluar la eficiencia de corte
352pb
230pb
120pb
La combinación de TALENs más eficiente indujo un corte en el 10% de los
alelos en iPSC.
Generación de Clones Isogénicos
3.  Establecer un método de screening fiable.
0
2
Transfección
pTALENs/
ssODN
Sorting
células
RFP+
4/5
Siembra en
96wp
(1-4 clones
por pocillo)
15
25
Subcultivo*
Screening
Siembra
clonal de
los pocillos
positivos
Screening de
colonias
monoclonales
* Paralelamente se extraen lisados celulares sobre los cuales realizar el análisis
molecular.
Generación de Clones Isogénicos
3.  Establecer un método de screening fiable.
Permite hacer screening
sobre poblaciones
policlonales
PCR específica de alelo
Poco robusta
Difícil cuando se ha de
eliminar un alelo
Métodos de
screening
testados
Muy robusta
Fácil ver la desaparición de un alelo
RFLP
Enzimas poco comunes por lo general
No distingue entre NHEJ y HDR
Generación de Clones Isogénicos
293T LRRK2GS/WT
Control iPSC LRRK2GS/WT
Primeros clones con la mutación insertada en heterozigosis
Generación de Líneas Reporteras Utilizando
Loci Endógenos
Una de los mayores dificultades de la tecnología iPSC es la de
generar poblaciones homogéneas del tipo celular determinado.
El uso de sistemas reporteros permite:
•  Seleccionar dicho tipo celular.
•  Realizar estudios live sobre dicha población celular.
¿Cuál es la ventaja de utilizar loci endogenos para reportar su
expresión?
• 
• 
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Recapitular fielmente la expresión del gen.
Evitar efectos de posición (lentivirus, recombinación no homóloga).
Mínima manipulación del genoma.
Generación de Líneas Reporteras Utilizando
Loci Endógenos
Carácterísticas sistema CRISPR/Cas9:
•  Generado en el laboratorio de Keith Joung.
•  Dos plásmidos:
•  gRNA (100nt aprox) transcrito desde un promotor U6.
•  Endonucleasa Cas9 transcrito desde un promotor CMV.
•  Target site of 20nt (G-19)-NGG (GnnnnnnnnnnnnnnnnnnnNGG):
Generación de Líneas Reporteras Utilizando
Loci Endógenos
800 pb
800 pb
Próximos Retos
• 
Generar una línea 293T homozigota para la mutación con la cual
testar las TALENs dirigidas hacia la misma.
• 
Estandarizar un método de screening eficiente para detectar la
desaparación de un alelo.
• 
Generar líneas reporteras para el gen TH y caracterizar dicho
sistema de reportaje
Consideraciones Adicionales
• 
Consecuencias del pasaje clonal de las iPSC.
• 
Off-target effects.
MUCHAS GRACIAS