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INVESTIGACION CLINICA
Polimorfismo 2212A>G del gen PECAM-1 en individuos
chilenos con enfermedad coronaria y controles
Christian L. Herrera1a, Priscilla C. Jaramillo1, Fernando Lanas2, Luis A. Salazar1
1Laboratorio
de Biología Molecular y Farmacogenética, Departamento de Ciencias Básicas,
Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile
2Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco,
Chile.
aAlumno Programa Doctorado en Ciencias c/m Biología Celular y Molecular Aplicada, Universidad
de La Frontera.
Trabajo financiado por Convenio de Desempeño I -2007 (LS), Dirección de Investigación y
Desarrollo, Universidad de La Frontera, Temuco.
Resumen
Introducción: La transmigración de leucocitos al espacio subendotelial es uno de los eventos claves en el
desarrollo de la enfermedad arterial coronaria, siendo PECAM-1 (Platelet-endothelial cell adhesion molecule-1)
una de las moléculas de adhesión responsables de este proceso.
Objetivo: El objetivo de este trabajo fue evaluar la posible asociación entre el polimorfismo 2212A>G del
gen PECAM-1 y enfermedad arterial coronaria.
Pacientes y Método: Fueron evaluados 98 individuos con enfermedad coronaria confirmada angiográficamente
(estenosis mayor al 70%) y 106 controles, por medio de la reacción en cadena de la polimerasa seguida de
restricción enzimática (PCR-RFLP).
Resultados: Los genotipos y frecuencias alélicas para el polimorfismo estudiado son similares en los dos
grupos evaluados (p = 0.085 y p = 0.495 respectivamente). La OR relacionada al alelo mutado G fue 0.87
(I.C. 95%, 0.59 – 1.29, p = NS).
Conclusión: El polimorfismo 2212A>G del gen PECAM-1 no se encuentra asociado con enfermedad arterial
coronaria en individuos Chilenos.
Palabras clave: Aterosclerosis, Moléculas de Adhesión, PECAM-1, Polimorfismo.
Effect of 2212A>G Polymorphism of PECAM-1 gene in Chilean subjects with coronary disease and
controls
Background: The transendothelial migration of leukocytes is a key event in coronary artery disease (CAD) development.
Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1) is a cellular adhesion molecule responsible of this process.
Aim: to investigate the possible association between 2212A>G polymorphism at the PECAM-1 gene and CAD in
Chilean individuals.
Methods: A total of 98 individuals whit CAD confirmed by angiography (>70% of stenosis) and 106 healthy controls
were evaluated. The 2212A>G polymorphism at the PECAM-1 gene was analyzed by Polymerase Chain Reaction
(PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP).
Correspondencia: Luis A. Salazar
Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Medicina,
Universidad de La Frontera,
Av. Francisco Salazar 01145, Casilla 54-D, Temuco.
Fono: 45-325218 - Fax: 45-325236
Correo Eléctronico: [email protected]
Revista Chilena de Cardiología - Vol. 27 Nº2, 2008
147
C. Herrera, P. Jaramillo, F. Lanas, L. Salazar.
Results: The distribution of genotypes and relatives frequencies of alleles were similar between cases and controls
(p = 0.085 and p = 0.495 respectively). The Odds Ratio of CAD whit the G allele was 0.87 (C.I: 95%, 0.59 –1.29;NS).
Conclusion: 2212A>G polymorphism of the PECAM-1 gene was not associated whit CAD in Chilean individuals.
Keywords: Atherosclerosis, Cellular Adhesion Molecules, PECAM-1, Polymorphism.
Recibido el 5 de junio de 2008, Aceptado el 4 de julio 2008
Rev Chil Cardiol 2008; 27: 147-152
Introducción
En la actualidad, las técnicas moleculares han permitido
el estudio de las bases genéticas de diversas
enfermedades crónicas, entre ellas las enfermedades
cardiovasculares y específicamente la aterosclerosis,
debido a que han facilitado la identificación de genes y
vías de señalización celular involucradas en la
fisiopatología, o en una mayor predisposición al
desarrollo de estas patologías1.
La realización de estudios de asociación en base
al análisis de la presencia de polimorfismos de un
nucleótido (SNP: single nucleotide polymorphism), se
sustenta en el hecho de que estas variaciones pueden
modificar la expresión de un gen o bien su función al
provocar un cambio en la secuencia de aminoácidos
del péptido y de esta forma relacionarse a la aparición
de diferentes fenotipos que pueden estar asociados, en
mayor o menor medida, a una patología.
El rol de las moléculas de adhesión celular en el
inicio y progresión de la lesión aterosclerótica es claro,
ya que es la interacción de moléculas de adhesión
presentes tanto en leucocitos como en el endotelio
vascular, la que facilita el proceso de transmigración
celular, paso de células leucocitarias al espacio
subendotelial, evento clave en la patogenia de la lesión
aterosclerótica2.
PECAM-1 (Platelet-endothelial cell adhesion
molecule-1) es una glicoproteína de membrana cuyo
gen se encuentra ubicado en el brazo largo del
cromosoma 17 (17q23)3. Esta molécula que es expresada en la superficie de plaquetas, monocitos, neutrófilos
y algunos tipos de linfocitos T, es una pieza clave en la
extravasación de leucocitos a través de las uniones
intercelulares del endotelio vascular durante el proceso
inflamatorio2,4,5,6.
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Algunas de las variantes genéticas de PECAM-1 han
sido estudiadas y asociadas al desarrollo de enfermedad
cardiovascular e infarto al miocardio, encontrándose
entre ellas con mayor frecuencia los SNPs 373C>G
(exón 3), 1688G>A (exón 8), 2212A>G (exón 12) y
53G>A (región 5`UTR)7-16.
La frecuencia y la relación de los polimorfismos
presentes en el gen PECAM-1 con enfermedad arterial
coronaria han sido previamente estudiadas, tanto en
poblaciones caucásicas como asiáticas, existiendo sólo
un antecedente previo en población latinoamericana16.
Debido a que la asociación entre polimorfismos y
enfermedad arterial coronaria continúa sin estar
clarificada en nuestra población, es que nos planteamos
los siguientes objetivos: a) Determinar la frecuencia del
polimorfismo 2212A>G del gen PECAM-1 en pacientes
chilenos con enfermedad coronaria y controles, y b)
determinar el grado de asociación entre esta variación
molecular y el desarrollo de enfermedad coronaria en
individuos de nuestra población.
Métodos
Pacientes
Durante los años 2003-2005 fueron seleccionados
204 individuos no relacionados de la Región de La
Araucanía, Chile.
Se reclutaron 98 individuos portadores enfermedad
coronaria, diagnosticada mediante angiografía en la que
presentaron estenosis > 70%. Este procedimiento fue
realizado en el Hospital Hernán Henríquez Aravena
(Temuco, Chile).
El grupo control estuvo conformado por 106
individuos, quienes no presentaban ningún signo clínico
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Polimorfismo 2212A>G del gen PECAM-1 en individuos chilenos con enfermedad coronaria y controles
de enfermedad cardiovascular al momento de participar
de este estudio.
Durante la entrevista personal se obtuvieron datos
de presión arterial sistólica y diastólica, índice de masa
corporal y presencia de diabetes mellitus, definida según
antecedentes de tratamiento hipoglicemiante o
determinaciones sucesivas de glicemia en ayunas
≥ 126 mg/dL 17 . Además se consultó respecto del
consumo de algún tipo de tratamiento antihipertensivo.
Para ninguno de los grupos evaluados existió
preselección según los niveles séricos de lípidos.
El protocolo de este estudio contó con la aprobación
del Comité de Ética Científica del de la Facultad de
Medicina de la Universidad de la Frontera y todos los
participantes firmaron voluntariamente un consentimiento
escrito.
Determinaciones bioquímicas
Después de 12 horas de ayuno, se obtuvieron
mediante punción venosa las muestras de sangre con
las que se realizó la medición de colesterol total y
triglicéridos por métodos enzimáticos-colorimétricos18,19.
El colesterol de las HDL se midió previa precipitación
de las LDL y VLDL con ácido fosfotúngstico e iones
magnesio y posterior determinación por el método
CHOD-PAP20. La concentración de colesterol de las
LDL (LDL-C) fue calculada mediante la fórmula de
Friedewald21. Los niveles séricos de glucosa y ácido
úrico se determinaron mediante métodos enzimáticocolorimétricos22,23.
Genotipificación del polimorfismo 2212A>G del
gen PECAM-1
La presencia del polimorfismo 2212A>G fue detectada
mediante la técnica de reacción en cadena de la
polimerasa y posterior análisis mediante restricción
enzimática (PCR-RFLP). Las condiciones del PCR
fueron: Denaturación inicial a 98 ºC por 3 minutos, y
30 ciclos repetitivos compuestos por una denaturación
de 1 minuto a 94 ºC, hibridación por 1 minuto a 61 ºC
y extensión de 1 minuto a 72 ºC, adicionalmente una
extensión final de 10 minutos. El producto amplificado
mediante generó un fragmento de 165 pares de bases
(bp), el cual fue evaluado en un gel de agarosa al 2%,
teñido con bromuro de etidio (0,5 mg/L) y visualizado
en un transiluminador UV.
Los partidores utilizados son los que se detallan a
continuación: sense 5´-CAA CTA GGT CAC AAT GAC
GAT GCC -3´ y antisense 5´- TGG GAA ATT ATC CAC
AGT CCT TCA -3´, y fueron descritos previamente por
Elrayess et al. en el año 200413.
La restricción enzimática de los productos
amplificados, se realizó con la endonucleasa MspI
(Fermentas, Lituania), de acuerdo al siguiente protocolo:
10 µL de producto de PCR, 5 U de la enzima de
restricción, 2 µL de tampón de reacción 10X; conteniendo
este último: Tris–HCl 10mM (pH 8,5), MgCl2 10mM, KCl
100 mM y BSA 0.1 mg/mL y agua destilada estéril
suficiente para completar un volumen final de 20 µL. La
mezcla fue incubada por 12 horas en baño
termorregulado a 37° C y finalmente los fragmentos de
restricción fueron analizados en gel de agarosa al 2%.
El genotipo salvaje (AA) se identificó por la presencia
de un fragmento de 165 bp; el genotipo mutado
heterocigoto (AG) por fragmentos de 165, 141 y 24 bp,
y el genotipo mutado homocigoto por dos fragmentos
de 141 y 24 bp.
Control de calidad de las determinaciones
bioquímicas y moleculares
Fueron utilizados sueros comerciales, normales
y patológicos (Human, Alemania), para controlar
la exactitud y precisión de las determinaciones
bioquímicas. La correcta genotipificación del polimorfismo 2212A>G del gen PECAM-1 fue confirmada
mediante la repetición al azar del 10% de los análisis
previamente realizados. Se excluyó la posibilidad de
contaminación en los análisis moleculares al incluir en
cada serie de amplificación un control de reactivos.
Análisis estadístico
Para el análisis estadístico se utilizaron los programas
SigmaStat®, versión 2.0 y GraphPad Prism®,
versión 3.0. Se analizaron todas las variables
descriptivamente. Se calcularon promedios, desviaciones
estándar, valores mínimos y máximos. La asociación
entre las diferentes variables analizadas fue comprobada mediante la prueba t de Student. Además, se utilizó
la prueba de Chi-cuadrado (c2) para el análisis de las
variables no continuas y verificación del cumplimiento
del equilibrio de Hardy-Weinberg. La Odds ratio (OR) y
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C. Herrera, P. Jaramillo, F. Lanas, L. Salazar.
su respectivo intervalo de confianza de 95% fueron
también calculadas. El nivel de significancia estadístico
considerado en este estudio fue p < 0.05.
ácido úrico (p<0.001) que el grupo control. No se
encontró diferencias significativas entre los grupos,
para las concentraciones de colesterol total (p=0.056)
y LDL-C (p=0.659) (Tabla 1).
Resultados
Tanto la distribución de genotipos como la frecuencia
Las características biodemográficas de la población
estudiada muestran diferencias significativas en relación
a edad, frecuencia masculina y cantidad de individuos
diabéticos (p<0.001). Respecto de los análisis bioquímicos, se observó niveles más bajos de colesterol
HDL (p<0.001) y niveles significativamente más elevados de glucosa (p=0.02), triglicéridos (p<0.001) y
relativa de alelos para el polimorfismo 2212A>G del
gen PECAM-1 fueron similares entre casos y controles
(p=0.085 y p = 0.495, respectivamente). Además,
la OR asociada al alelo mutado G fue 0.87 (I.C. 95%,
0.59-1.29; p>0.05). Las frecuencias genotípicas
observadas en ambos grupos analizados, cumplen con
la ley de Hardy-Weinberg (Tabla 2).
Tabla 1. Características demográficas y valores séricos de lípidos, glucosa y ácido úrico (Media ± DS) de los pacientes chilenos
con enfermedad arteriocoronaria y controles.
Casos
(98)
Controles
(106)
60.5 ± 9.2*
41.7 ± 8.8
Sexo (% masculino)
76.5*
44.6
Diabetes mellitus (%)
34.9*
6.3
Colesterol Total (mg/dL)
185.0 ± 55.6
200.1 ± 53.7
Colesterol LDL (mg/dL)
115.5 ± 37.0
118.1 ± 41.4
Edad, años
31.9 ± 8.5 *
51.1 ± 11.4
Triglicéridos (mg/dL)
Colesterol HDL (mg/dL)
193.3 ± 205.5*
135.0 ± 97.0
Glucosa (mg/dL)
113.2 ± 44.3 **
97.1 ± 41.6
5.7 ± 1.7 *
4.6 ± 1.5
Ácido úrico (mg/dL)
*p<0.001, **p=0.02
Tabla 2. Distribución de genotipos y frecuencia relativa de alelos del polimorfismo 2215 A>G del gen PECAM-1 en pacientes
chilenos con enfermedad arteriocoronaria y controles.
Genotipos
Alelos
AA
AG
GG
A
G
Casos
(98)
19,4 %
(19)
59,2 %
(58)
21,4 %
(21)
0,49
0,51
Controles
(106)
30,2 %
(32)
44,3 %
(47)
25,5 %
(27)
0,52
0,48
Χ2 = 4,91; 2 g.l.; p = 0,085
Número de individuos entre paréntesis.
Equilibrio Hardy-Weinberg: Casos: Χ2 = 3,32 (p=NS)
150
Controles: Χ2 = 1,31 (p=NS)
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Χ2 = 0,47; 1 g.l.; p=0,495
Polimorfismo 2212A>G del gen PECAM-1 en individuos chilenos con enfermedad coronaria y controles
Discusión
Los resultados de los análisis bioquímicos mostraron
que el grupo casos presenta niveles significativamente
más bajos de colesterol HDL y más altos de glucosa,
triglicéridos y ácido úrico, todos parámetros asociados
tradicionalmente con mayor riesgo de desarrollar
enfermedad coronaria. Sin embargo, contrariamente
a lo esperado, se observaron concentraciones de
colesterol total y LDL-C sin diferencias estadísticamente
significativas entre casos y controles. La explicación
más probable a este hecho es el uso de fármacos
hipolipemiantes por parte de los pacientes con
enfermedad coronaria.
Si bien, actualmente, establecer relaciones entre
polimorfismos de genes candidatos y enfermedad arterial
coronaria es una tarea compleja, como consecuencia
de su origen multifactorial, existe evidencia que permite
afirmar que las variaciones en la genética de los procesos
inflamatorios pueden modificar el riesgo de desarrollar
esta patología24.
En el caso del gen PECAM-1, diferentes
polimorfismos han sido asociados al desarrollo de
enfermedad coronaria e infarto agudo al miocardio
en diversas poblaciones. Específicamente la asociación
de los distintos genotipos y alelos del polimorfismo
2212A>G con estenosis coronaria ha sido investigada
sólo en un trabajo previo, donde se demostró que los
individuos homocigotos para el alelo G presentan
mayor progresión de estenosis coronaria que los
portadores homocigotos para el alelo A (p = 0.04). En
esta misma investigación, no se encontraron diferencias
significativas entre los genotipos (AA/AG/GG) y el
riesgo de desarrollar enfermedad arterial coronaria
en la cohorte estudiada; sin embargo, sí se comprobó
una asociación positiva entre la presencia del genotipo
AA con el desarrollo de infarto agudo al miocardio en
individuos fumadores al compararlo con el genotipo
GG13.
Otras investigaciones también han asociado el
genotipo AA con infarto agudo al miocardio en
poblaciones de Japón (p = 0.048) e Italia (p = 0.02)9, 11.
Sin embargo, contrariamente a lo mostrado en el año
2004 en población de origen italiano, un nuevo estudio
publicado por Listi et al. durante el año 2007, no encontró
asociación entre los polimorfismos del gen PECAM-1 e
infarto agudo al miocardio, al estudiar su frecuencia en
individuos longevos de origen italiano25.
Si bien nuestros resultados no muestran asociación
entre el polimorfismo 2212A>G del gen PECAM-1 y
enfermedad arterial coronaria, esto es concordante con
los hallazgos previos de Elrayess et al.13 y Listi et al.25.
Las causas de la variabilidad de resultados obtenidos
por distintos autores se puede explicar por diversos
factores, entre los que destacan el diverso origen racial
de las poblaciones estudiadas (Asiática, Europea y
Latinoamericana) y la influencia del tamaño muestral
utilizado en cada estudio, debido a que cuando el tamaño
muestral es poco adecuado, podría no proporcionar el
poder estadístico suficiente para la detección de
pequeños ORs (Odds ratios)26.
En resumen, los datos obtenidos sugieren que el
polimorfismo 2212A>G del gen PECAM-1 no se
encuentra asociado a enfermedad arterial coronaria en
la población analizada. A pesar de esto, la importancia
de este trabajo más allá de su objetivo principal, radica
en la generación de información que a mediano o largo
plazo podría llegar a ser llevada a la práctica clínica en
nuestro país ya que permitirá, en conjunto, el estudio
de otras variantes genéticas y establecer perfiles de
riesgo genético para el desarrollo de enfermedad
cardiovascular en individuos de nuestra población.
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