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OBTENCIÓN DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE LIPASAS PARA LA
UTILIZACIÓN EN BIORREMEDIACIÓN DE ACEITES Y GRASAS
ANDRÉS FELIPE GIL RAVE
UNIVERSIDAD DE SANTA ROSA DE CABAL, UNISARC
BIOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS
SANTA ROSA DE CABAL
2014
OBTENCIÓN DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE LIPASAS PARA LA
UTILIZACIÓN EN BIORREMEDIACIÓN DE ACEITES Y GRASAS
ANDRÉS FELIPE GIL RAVE
TESIS DE PREGRADO
Dra. ANELISE VICENTINI KUSS
UNIVERSIDAD DE SANTA ROSA DE CABAL, UNISARC
BIOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS
SANTA ROSA DE CABAL
2014
CONTENIDO
Pag.
1. RESUMEN
7
2. ABSTRACT
8
3. INTRODUCCIÓN
9
4. ANTECEDENTES
11
5. PROBLEMA Y OPORTUNIDAD
13
6. JUSTIFICACIÓN
14
7. OBJETIVOS
15
7.1 OBJETIVO GENERAL
15
7.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
15
8. ALCANCES Y LÍMITES DEL TRABAJO
17
9. MARCO REFERENCIAL
18
10. MARCO TEÓRICO
20
10.1 Contaminación
20
10.2 Lípidos
22
10.3 Enzimas lipolíticas
23
10.4 Uso de microorganismos en la biodegradación de contaminantes
24
11. METODOLOGÍA
26
11.1 Obtención de las muestras
26
11.2 Aislamiento y purificación de microorganismos productores de lipasas
26
11.2.1 Etapa de enriquecimiento
26
11.2.2 Inoculación en placas
26
11.2.3 Aislamiento
26
11.2.4 Almacenamiento
27
11.3 Identificación y caracterización morfológica y bioquímica
27
11.3.1 Selección de bacterias lipolíticas por el método de rodamina B
27
11.3.2 Lavado de células
27
11.3.3 Cuantificación de células por medio de espectrofotometría
28
11.3.4 Test de emulsificación
28
11.3.5 Evaluación de la actividad metabólica
28
11.3.6 Identificación mediante pruebas bioquímicas
28
11.4 Análisis de los datos
29
12. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
30
12.1 Caracterización morfológica
30
12.2 Test con Rodamina B
33
12.3 Test de Emulsificación
35
12.4 Actividad metabólica
39
12.5 VITEK® 2
40
13. CONCLUSIONES
43
14. RECOMENDACIONES
44
BIBLIOGRAFÍA
45
LISTA DE TABLAS
Pag.
Tabla 1. Origen y caracterización de la morfología colonial de las
bacterias aisladas de cajas de gorduras en restaurantes y residencias y
de la empresa de lácteos de la región de Pelotas, RS.
30
Tabla 2. Morfología bacteriana, agrupamiento y coloración de Gram de
las bacterias obtenidas. G-: Gram negativo, G+: Gram positivo.
32
Tabla 3. Resultados del test de Rodamina B.
33
Tabla 4. Mediciones y porcentaje de emulsionado total para cada
bacteria aislada y una media de los porcentajes encontrados para cada
repetición.
36
Tabla 5. Test de actividad metabólica para las bacterias aisladas.
39
Tabla 6. Identificación bacteriana por medio de la VITEK® 2
41
LISTA DE FIGURAS
Pag.
Figura 1. Caja de gordura residencial.
26
Figura 2. Colonias bacterianas de coloración beige en MMS.
31
Figura 3. Crecimiento de colonias bacterianas en medio con Rodamina B
0,1M.
34
Figura 4. Comparación entre colonias bacterianas en medio con Rodamina
B 0,1M
34
Figura 5. Emulsionado de aceite de oliva por la producción de
biosurfactante por parte de bacterias lipolíticas. Bacteria número 11.
38
Figura 6. Test de actividad metabólica, cambio de coloración 30 minutos
después de la adición de 2,3,5 Trifenil Tetrazolio.
40
1. RESUMEN
En los últimos años, los problemas de contaminación medio ambiental causadas
por procesos antrópicos han generado deterioro en los diferentes ecosistemas.
Como medida contra estos problemas, el hombre ha ejecutado estrategias que
contra resten el impacto hacia el ambiente, realizando procesos de remediación
química o biotecnológica en los ecosistemas perturbados o directamente sobre los
residuos producidos por el hombre. Las industrias alimentarias son unas de las
mayores productoras de residuos orgánicos en el mundo, generando problemas
principalmente en ambientes acuáticos, por la difícil remoción de estos materiales.
El presente trabajo tiene como objetivo obtener bacterias productoras de enzimas
lipasas para la utilización en procesos de biorremediación de aceites y grasas.
Esta investigación se realizó en el laboratorio de microbiología ambiental de la
Universidad Federal de Pelotas, Rio Grande del Sur, Brasil. Se colectaron
muestras de material gorduroso de cajas de gorduras de residencias y
restaurantes como también de un tratamiento de aguas residuales de una
empresa de lácteos localizadas en la cuidad de Pelotas. Los microorganismos
aislados fueron evaluados mediante test comunes para la verificación de
producción de enzimas lipasas extracelular (test de Rodamina B), actividad
metabólica, producción de biosurfactante y fueron identificados taxonómicamente
hasta especie mediante la VITEK® 2. Se aislaron 12 bacterias las cuales
presentaron una degradación de 55% de aceites de oliva, además el 66% de las
bacterias (8 aisladas) produjeron enzima lipasas extracelular. Mediante la VITEK®
2 se identificaron 8 especies de bacterias de los 12 microorganismos aislados,
Serratia marcescens (5 individuos), Klebsiella oxytoca (1 individuo), Enterobacter
aerogenes (1 individuo) y Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae (1 individuo). La
especie Serratia marcescens presentó mayor número de individuos aislados,
además se puede observar buenos resultados en todos los test realizados, lo cual
podría concluir como una bacteria promisoria para ser utilizada en procesos de
biorremediación de aceites y grasas.
7
2. ABSTRACT
In recent years, the problems of environmental pollution caused by anthropogenic
processes have led to deterioration in different ecosystems. As a measure against
these problems, man has executed strategies that detract from the impact to the
environment, carrying out chemical or biotechnological processes remediation in
disturbed ecosystems or directly on the waste produced by humans. The food
industries are one of the largest producers of organic waste in the world,
generating problems mainly in aquatic environments, by the difficult removal of
these materials. The aim of this study is obtaining bacteria producing lipase
enzymes for use in bioremediation processes of oils and fats. This research was
done in the laboratory of environmental microbiology at the Federal University of
Pelotas, Rio Grande do Sul, Brazil. The fatty samples were collected at the fats
box from the houses, restaurant and the treatment of wastewater from a dairy
company; they located in the Pelotas city. The isolated microorganisms were
evaluated by checking common for production of extracellular lipase enzymes (test
Rhodamine B), metabolic activity, biosurfactant production and they were
taxonomically identified to species by VITEK ® 2 test. It was isolated 12 bacteria,
which showed a 55% degradation of olive oil, also, it 66% of the bacteria (8
isolated) produced extracellular lipase enzyme. By the VITEK® 2 were identified 8
species of bacteria of the 12 isolated microorganisms, Serratia marcescens (5
individuals), Klebsiella oxytoca (1 individual), Enterobacter aerogenes (1 individual)
and Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae (1 individual). The species Serratia
marcescens showed a higher number of isolated individuals, also, it can be seen
good results in all tests carried out, it which could be concluded as a promising
bacteria for use in bioremediation processes of oils and fats.
8