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Grado en Biología
Memoria del Trabajo de Fin de Grado
Evaluación de la capacidad antimicrobiana de dos
productos naturales, el ajo y la miel
Avaliación da capacidade antimicrobiana de dous
productos naturais, o allo e a mel
Evaluation of antimicrobial activity of two natural products,
garlic and honey
Alba Gegunde Díaz
Septiembre, 2016
Tutora académica: Mª Concepción Herrero López
Índice
Resumen .................................................................................................................. 0
Resumo .................................................................................................................... 0
Abstract ................................................................................................................... 0
1.
Introducción ..................................................................................................... 1
2.
Objetivo............................................................................................................. 3
3.
Materiales y métodos ....................................................................................... 4
3.1
Descripción de los microorganismos empleados ........................ 4
3.2
Descripción del medio de cultivo .............................................. 8
3.3
Preparación del extracto acuoso de ajo .................................... 8
3.4
Preparación del extracto acuoso de miel .................................. 9
3.5 Determinación del crecimiento microbiano: medida de densidad
óptica ............................................................................................. 9
4.
3.6
Diseño experimental ............................................................... 9
3.7
Análisis de datos ................................................................... 10
Resultados ...................................................................................................... 11
4.1
Efecto de los extractos en medio sólido TSA ........................... 11
4.2
Efecto de los extractos acuosos en medio líquido TSB ............. 11
5.
Discusión ........................................................................................................ 19
6.
Conclusiones.................................................................................................. 21
Conclusións ................................................................................................... 21
Conclusions .................................................................................................. 21
Bibliografía ............................................................................................................ 23
El presente trabajo Fin de Grado ha sido realizado en el Laboratorio de
Microbiología del Departamento de Biología Celular y Molecular de la Universidad de A
Coruña, bajo la dirección de la Dra. María Concepción Herrero López, Catedrática de
Microbiología de la Facultad de Ciencias de la Universidad de A Coruña.
Resumen:
El empleo de plantas medicinales con fines curativos se lleva a cabo desde
tiempos inmemoriales. El ajo (Allium sativum) es quizá de los bulbos más conocidos
en la antigüedad por sus propiedades curativas y ha adquirido una larga reputación
como un agente medicinal terapéutico. La miel es otro producto natural con notables
propiedades medicinales. Sus propiedades varían en función de diversos factores.
Estas propiedades han sido el motivo para realizar este estudio y comprobar el efecto
antimicrobiano de estos dos productos en diferentes tipos de microorganismos. Los
resultados muestran que el ajo tiene un efecto antibiótico notable en las cepas
estudiadas, mientras que la miel no muestra un efecto significativo en el crecimiento
de las mismas.
Palabras clave: ajo, miel, microorganismo, antimicrobiano, crecimiento.
Resumo:
O emprego de plantas medicinais con fins curativos lévase a cabo dende
tempos inmemoriais. O allo (Allium sativum) é quizáis dos bulbos máis coñecidos na
antigüidade polas suas propiedades curativas e adquiriu unha larga reputación como
axente medicinal terapéutico. O mel e outro produto natural con notables propiedades
medicinais. As súas propiedades varían en función de diversos factores. Estas
propiedades foron o motivo para realizar este estudio e comprobar o efecto
antimicrobiano destes dous produtos en diferentes tipos de microorganismos. Os
resultados mostran que o allo ten un efecto antibiótico notable nas cepas estudiadas,
mentras que o mel non mostra un efecto significativo no crecemento das mesmas.
Palabras clave: allo, mel, microorganismo, antimicrobiano, crecemento.
Abstract:
The use of medicinal herbs has been reported since immemorial times. Garlic
(Allium sativum) is one of the best known bulbs in the antiquity for its healthy
properties and it has acquired a great reputation as a medicinal agent. Honey is
another product with important medicinal properties. Its properties vary depending on
different factors. Taking into account these properties, the antimicrobial activity of these
two products was assayed against different microorganisms. Results obtained show a
remarkable antimicrobial effect of garlic extract against all the microorganisms
assayed, whereas honey did not show any effect against them.
Key words: garlic, honey, microorganism, antimicrobial, growth.
1. Introducción
Existe una gran tendencia a asociar a los microorganismos con la patogenicidad y
la virulencia que puedan tener; es decir, con la capacidad de producir enfermedades
en los huéspedes que infectan.
Pero lo cierto es que la gran mayoría de los microorganismos son inocuos e
incluso beneficiosos para otros organismos.
Cuando hablamos de microorganismos patógenos, es importante tener en cuenta
los agentes quimioterapéuticos disponibles para su tratamiento y eliminación. Las
sulfonamidas, descubiertas por Dogmak en 1932, fueron las primeras sustancias
eficaces empleadas para el tratamiento sistémico de infecciones bacterianas en el ser
humano, siendo un bactericida comparable a los antibióticos de amplio espectro.
Teniendo en cuenta el concepto de antibiótico (producto del metabolismo microbiano
que mata o inhibe el crecimiento de otros microorganismos), el primer antibiótico
propiamente dicho fue la penicilina, descubierta por Alexander Fleming en 1928.
No obstante, el empleo de plantas medicinales con fines curativos se lleva a cabo
desde tiempos inmemoriales, siendo el único recurso del que se podía disponer en la
antigüedad. El uso medicinal de las plantas recibe el nombre de fitoterapia
El ajo (Allium sativum) es quizá de los bulbos más conocidos en la antigüedad por
sus propiedades curativas y por su característico olor (el cual se debe a una mezcla de
principios activos) . El ajo crece durante todo el año, su tamaño depende de la especie
y del lugar de procedencia. Las propiedades antibacterianas del ajo fueron
reconocidas por Louis Pasteur y, durante la Segunda Guerra Mundial, se utilizó el ajo
como un antiséptico en la prevención de la gangrena ( Afzal et al., 2000 ). El ajo ha
adquirido así una larga reputación como un agente medicinal terapéutico.
El ajo ha sido objeto de estudio en numerosas ocasiones por sus propiedades
anti-cancerígenas, anti-trombóticas, anti-arteroescleroticas, anti-inflamatorias, antioxidantes y anti-microbianas (Colín-González et al., 2012). Esta última propiedad es
en la que nos vamos a centrar en este estudio.
El compuesto activo que se encuentra en el ajo es la alicina (S-Alil-2propentiosulfinato). Aunque muchos beneficios se pueden obtener directamente de la
alicina, su inestabilidad requiere prácticas de preparación adecuadas para el consumo.
La estructura química de la alicina es la responsable de su inestabilidad, la que hace
que sea sensible a la reactividad. La alicina sólo se comporta como un compuesto
biológicamente activo cuando el ajo se tritura o se corta, de forma que la enzima
alinasa reacciona con el compuesto aliina, obteniéndose como producto de esta
reacción la alicina (Frankel et al., 2015).
Otro producto natural con notables propiedades medicinales es la miel. Se trata
de una sustancia alimenticia natural producida por la abeja doméstica (Apis mellifera
L.). Es un producto biológico de composición compleja y diversa, variando sus
1
caracteres en función de su procedencia, las plantas que han proporcionado el néctar,
el procedimiento de extracción, etc.
Se compone principalmente de azúcares y otros componentes tales como
enzimas, aminoácidos, ácidos orgánicos, carotenoides, vitaminas, minerales y
sustancias aromáticas. Es rico en flavonoides y ácidos fenólicos que exhiben una
amplia gama de efectos biológicos y actúan como antioxidantes naturales ( Alqarni et
al, 2012 ). La composición, el color, el aroma y el sabor de la miel dependen
principalmente de las flores, regiones geográficas, especies de clima y de abejas que
intervienen en su producción, y también se ven afectados por las condiciones
meteorológicas, procesamiento, manipulación, envasado y tiempo de almacenamiento
( Escuredo et al., 2014 y Tornuk et al., 2013 ).
2
2. Objetivo
El objetivo general del presente trabajo, es el estudio de los posibles efectos
antimicrobianos de dos productos naturales, como son el ajo y la miel.
Se analiza el efecto de distintas concentraciones de estos productos naturales
sobre el crecimiento de varias especies de microorganismos de distintos grupos y
cuyas características difieren en gran medida.
3
3. Materiales y métodos
3.1 Descripción de los microorganismos empleado s
Se han utilizado seis
microorganismos diferentes, cinco bacterias y una
levadura: Escherichia. coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp., Micrococcus
lutetus, Mycobacterium phlei y Saccharomyces cerevisiae.
Escherichia coli (Fig.1)
Dominio: Bacteria
Reino: Bacteria
Filo: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Enterobacteriales
Familia: Enterobacteriaceae
Género: Escherichia
Especie: Escherichia coli
Figura 1: Células de Escherichia coli.
(Fuente: http://www.bbc.com/news/health-13639241)
Sin duda alguna es la bacteria mejor estudiada y el microorganismo de
experimentación elegido en muchos casos. Es un bacilo gram-negativo que forma
parte de la microbiota entérica normal del colon humano y de otros animales
homeotermos, y resulta bastante útil para determinar la presencia de contaminación
fecal. Es un organismo facultativo que puede presentar un crecimiento aerobio o
anaerobio (Willey et al., 2008).
La mayoría de las cepas de E. coli no son patógenas. Sin embargo, sí que existen
unas cuantas cepas potencialmente patógenas que se transmiten por alimentos.
Todas estas cepas son patógenos intestinales y varias de ellas se caracterizan por su
capacidad de producir enterotoxinas muy potentes. Existen unas 200 cepas conocidas
de E. coli. Algunas causan enfermedades diarreicas graves e infecciones del tracto
urinario. (Madigan et al., 2009).
4
Staphylococcus aureus (Fig.2)
Dominio: Bacteria
Reino: Bacteria
Filo: Firmicutes
Clase: Bacilli
Orden: Bacillales
Familia: Staphylococcaceae
Género: Staphylococcus
Especie: Staphylococcus aureus
Figura 2: células de Staphylococcus aureus. (Fuente:
http://www.bacteriainphotos.com/Staphylococcus%20aureus
%20electron%20microscopy.html)
Es un coco gram-positivo que se disponen en forma de racimos que se dividen en
varios planos. Forman colonias amarillas y son anaerobios facultativos, es decir, que
crecen mediante respiración aeróbica o bien por fermentación con producción de ácido
láctico. (Madigan et al., 2015)
Es una causa importante de la bacteriemia, que con frecuencia da lugar a
infecciones secundarias graves, tales como endocarditis infecciosa, osteomielitis y
artritis séptica. La capacidad de S. aureus para causar una amplia gama de
infecciones, se ha atribuido a su enorme arsenal de diferentes factores de virulencia
(Painter et al., 2014).
Salmonella sp. (Fig. 3)
Dominio: Bacteria
Reino: Bacteria
Filo: Proteobacteria.
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Enterobacteriales
Familia: Enterobacteriaceae
Género: Salmonella
Especie: Salmonella sp.
Figura 3: células de Salmonella sp. (Fuente:
http://www.wales.nhs.uk/sites3/page.cfm?orgid=457&pid=48
023#a)
5
Se trata de enterobacterias bacilares y gram-negativas, que son anaerobios
facultativos. Son bacterias productoras de ácido sulfhídrico (H2S) que emplean la
glucosa como fuente de nutrientes (Willey et al., 2008).
Estructuralmente constan de flagelos peritricos y no desarrollan cápsula ni
esporas. (Madigan et al., 2015).
Es un huésped habitual de los intestinos de cualquier animal homeotermo. Es
un agente productor de zoonosis, que normalmente se transmite por contacto
directo, en el procesado de alimentos o por vía sexual (Willey et al., 2008).
Staphylococcus aureus puede causar diversas formas de infecciones
subclínicas y clínicas en seres humanos y animales. Estas bacterias son capaces
de producir una gran variedad de factores de virulencia (Fijalkowski et al., 2008).
Micrococcus luteus (Fig. 4)
Dominio: Bacteria
Reino: Bacteria
Filo: Actinobacteria
Clase: Actinobacteria
Orden: Actinomycetales
Familia: Micrococcaceae
Género: Micrococcus
Especie: Micrococcus luteus
Figura 4: células de Micrococcus luteus. (Fuente:
http://www.dailymail.co.uk/home/you/article-2788036/whylearn-love-bacteria-s-time-easy-antibac-spray.html)
Es un coco gram-positivo y aerobio estricto que oxida hidratos de carbono y agua
a CO2 y que no produce ácido a partir de glucosa (Madigan, et al., 2015).
M. luteus se puede encontrar en diversos hábitats, tales como la piel humana, el
agua, el polvo o en el suelo. Fue aislado por primera vez por Alexander Fleming en
1929 (Ganz et al, 2003). Generalmente se considera una bacteria inofensiva, aunque
ha habido algunos casos de infecciones de Micrococcus en personas
inmunocomprometidas (Madigan et al., 2015).
Tiene algunas características en común con S. aureus, tales como la morfología y
color de las colonias (Madigan et al., 2015).
6
Mycobacterium phlei (Fig.5)
Dominio: Bacteria
Reino: Bacteria
Filo: Actinobacteria
Orden: Actinomycetales
Familia: Mycobacteriaceae
Género: Mycobacterium
Especie: Mycobacterium phlei
Figura 5: células de Mycobacterium phlei. (Fuente:
http://visualsunlimited.photoshelter.com/image/I0000gThDOnFb2c8)
Fue nombrada por Lehmann y Neumann en 1899 (Gordon et al. 1953).
Se trata de un bacilo aerobio e inmóvil no esporulador . Es ácido-alcohol
resistente, carece de cápsula. (Murray et al., 2015).
Al igual que el resto de las micobacterias, posee una pared celular característica
de éste género; más gruesa que la de la mayoría de las bacterias, cerosa y rica en
ácidos micólicos (Murray et al., 2015).
Esta pared celular se compone de peptidoglicano (PG) unido con con
arabinogalactano (AG), y ácidos micólicos. La capa más externa consiste en una
variedad de forma no covalente de glucolípidos, polisacáridos, lipoglucanos y
proteínas, incluyendo las proteínas formadoras de poros (Kaur et al., 2009)
Saccharomyces cerevisiae (Fig.6)
Dominio: Eukarya
Reino: Fungi
Filo: Ascomycota
Clase: Saccharomycetes
Orden: Saccharomycetales
Familia: Saccharomycetaceae
Género: Saccharomyces
Especie: Saccharomyces cerevisiae
Figura 6: Células de Saccharomyces cerevisiae. (Fuente:
https://www.emaze.com/@AZZLOWO/fermentaci%C3%B3n)
7
Es un microorganismo eucariota. Es una levadura de color amarillo-verdoso con
forma globular. La mayoría de las veces se encuentra en las zonas donde puede
producirse la fermentación, como la de la superficie de la fruta, bodegas de
almacenamiento y en los equipos utilizados durante el proceso de fermentación
(Mortimer, 2000) aunque también aparece en la superficie de plantas, tractos
gastrointestinales y superficies corporales de insectos y animales de sangre caliente,
también en suelos de todo el mundo e incluso en ambientes acuático (Madigan et al.,
2015).
S. cereviseae también es considerado un “organismo modelo” por los científicos,
debido a que es un organismo unicelular y eucariota. Como eucariota, la mayoría de
los genes de la levadura y las proteínas tienen homólogos en humanos (Morsomme et
al., 1996), y por tanto, una mayor comprensión del genoma de la levadura ayudaría a
comprender mejor el genoma humano. Otra ventaja es su rapidez en el crecimiento.
3.2
Descripción del medio de cultivo
En todos los casos se utilizó para el cultivo de los microorganismos el medio de
cultivo de tripticasa y soja (Tabla 1). Este (medio de digerido de soja y caseína) es un
medio para enriquecimiento de uso general utilizado en procedimientos cualitativos
para la prueba de esterilidad y para el enriquecimiento y cultivo de microorganismos
aerobios no exigentes en exceso. En la microbiología clínica, puede utilizarse para la
suspensión, el enriquecimiento y el cultivo de cepas aisladas en otros medios. Se ha
utilizado tanto en forma sólida (TSA = tripticasa soja agar) como líquida (TSB =
tripticasa soja caldo).
Tabla 1: Composición de TSB pra un volumen final de 1 litro de caldo de cultivo.
(Fuente: Scharlab, S.L.)
Composición de TSB (1L)
Componente
Cantidad
Caseína
Peptona de soja
Dextrosa
Cloruro de sodio
Fosfato dipotásico
3.3
17 g
3g
2,5 g
5g
2,5 g
Preparación del extracto acuoso de ajo
Para la preparación del extracto acuoso del ajo se partió de 50 g de ajo
previamente pelado, a los que se le añadieron 100 ml de agua destilada que actuará
como diluyente.
8
Se colocan ambos componentes en una bolsa que introducimos en un
homogenizador Stomacher, el cual se pone a funcionar a alta potencia durante 6
minutos.
Una vez que tenemos el ajo homogeneizado en el agua se procede a centrifugar
a 4500 rpm durante 15 min y a 4ºC. Una vez centrifugado, obtenemos el sobrenadante
y se centrifuga de nuevo en las mismas condiciones para eliminar los restos que
pudieran haber quedado, completando así la obtención del extracto de ajo que ya está
listo para ser utilizado.
3.4
Preparación del extracto acuoso de miel
Partimos de 50 g de miel, los cuales serán diluidos en 50 ml de agua destilada. Se
homogeniza la mezcla hasta que tiene un aspecto totalmente homogéneo.
3.5 Determinación del crecimiento microbiano: medida de
densidad óptica
El método escogido para determinar el crecimiento de los microorganismos fue la
medida de densidad óptica (expresada como 100-Transmitancia), para lo que se utilizó
un espectrofotómetro Spectronic 20 (Bausch & Lomb). Para ello se utilizaron cultivos
en medio TSB realizados en tubos de ensayo de 18 x 150 mm con 3 ml de medio de
cultivo. La densidad óptica (como transmitancia) se midió a 530nm de longitud de
onda, siempre frente a un blanco. Los blancos fueron diferentes para las distintas
concentraciones de cada compuesto ensayado; para cada concentración de cada uno
de los compuestos se utilizó como blanco una solución que contenía la cantidad de
medio de cultivo y de extracto correspondiente en cada caso sin inocular, es decir,
libre de microorganismos.
3.6 Diseño experimental
Se utilizaron placas de TSA para determinar la producción de halos de inhibición
utilizando discos impregnados con el extracto acuoso de la sustancia a ensayar (ajo o
miel). Se preparan discos impregnados en los extractos acuosos. A continuación, se
realiza una siembra en césped de cada uno de los microorganismos. Para ello, se
toman inóculos procedentes de cultivos en fase exponencial de crecimiento. A
continuación se incuban durante 48 horas a 37ºC, excepto la levadura S. cerevisiae
que se incuba a 30ºC. Transcurrido el tiempo de incubación se observa la presencia o
no de halo de inhibición.
9
Para cuantificar el efecto sobre el crecimiento se realizan cultivos en medio líquido
(TSB). Los cultivos se realizaron en tubos 18 x 150 mm con 3 ml de medio. Se
prepararon tubos con 3 ml de TSB a los que se añadieron 0, 25, 50, 100, 150, 200,
250 y 300 l d cada extracto, quedando las siguientes concentraciones: 0, 4, 178, 25,
33, 42 y 50 mg/ml El tubo sin adición de extracto actúa como control (0). Se preparan
tres tubos de cada concentración y del blanco. Cada tubo se inocula con el
microorganismo correspondiente, para lo que se utilizan cultivos en fase exponencial
de crecimiento. Todos los cultivos se incuban a 37º C durante 48h, excepto S.
cerevisiae que se incubó a 30º C. Durante este periodo de incubación se determinó el
crecimiento a las 24h y a las 48h, midiendo la densidad óptica como se ha descrito
anteriormente. Cada ensayo se realiza por triplicado.
3.7 Análisis de datos
Todos los datos obtenidos fueron analizados para comprobar que se cumpliesen
los requisitos de homogeneidad de la varianza y normalidad para realizar los test
paramétricos.
Los valores obtenidos de las EC50 para cada especie y para cada tiempo (24 y 48
horas) fueron comparados a través de análisis de varianza de un factor (ANOVA), en
la que el factor principal fue la especie. Cuando el ANOVA fue significativo, se realizó
una prueba post hoc de test de Tukey para determinar qué medias difieren entré sí y
con respecto al control.
Para el análisis estadístico de los datos se usó el programa IBM SPSS Stadistic
19.0 (IBM Corporation, Armok, NY, EUU)
El nivel de significación aceptado fue el de un p-valor <0,05.
10
4. Resultados
4.1 Efecto de los extractos en medio sólido TSA
Las placas sembradas y tratadas con el extracto de ajo han mostrado inhibición
en los cultivos de todos los microorganismos. En las placas sembradas con extracto
de miel, a pesar de la existencia de halo inhibitorio, éste es mucho más sutil (Fig. 7).
Figura 7: Resultado de la siembra en placa con los discos de extracto de ajo.
(Fuente: Alba Gegunde)
Se aprecia un halo de inhibición notable alrededor del disco (derecha) en
comparación con la placa control (izquierda) en la que no existe halo de inhibición.
4.2 Efecto de los extractos acuosos en medio líquido TSB
4.2.1 Efecto del extracto de ajo sobre el crecimiento de los diferentes
microorganismos
- E. coli
La adición de distintas concentraciones de extracto de ajo al medio de cultivo,
inhibió significativamente (p < 0.05) el crecimiento de E. coli con todas las
concentraciones ensayadas (Fig. 8) tanto a las 24h como a las 48h de cultivo.
Los resultados del test ANOVA muestran diferencias significativas a las 24 horas
en las muestras tratadas con extracto con respecto a la muestra control. El test Tukey
establece que la concentración mínima a la que se producen diferencias significativas
con respecto al control es de 4 mg/ml de extracto de ajo.
11
A las 48 horas también existen diferencias significativas de crecimiento con
respecto al control. El test de Tukey establece que la concentración mínima a la que
se produce una diferencia significativa del crecimiento con respecto al control es de 8
mg/ml.
Crecimiento
(D.O 530 nm)
E. coli
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
24 h
48 h
0
4
8
17
25
33
42
50
Concentración de extracto (mg/ml)
Figura 8: Crecimiento celular de E.coli con diferentes concentraciones de extracto de
ajo medido a las 24 y a las 48 horas.
Se elaboró una recta dosis-respuesta del efecto del extracto de ajo sobre el
crecimiento de E. coli en la que se representa el porcentaje de inhibición del
crecimiento, en relación a un control sin extracto, frente al logaritmo de la
concentración del extracto a las 24h y a las 48h. La recta de concentración-respuesta
obtenida en base a la tasa de crecimiento de los cultivos presenta una respuesta de
tipo lineal (Figuras 9 y 10). Mediante la correspondiente ecuación se calculó el valor
de la EC50, es decir, la concentración de extracto que provoca una respuesta a mitad
de camino entre la línea base (la inexistencia de inhibición en este caso) y la respuesta
máxima (la inhibición total).
La EC50 fue calculada para las 24 y a las 48 horas. El valor obtenido para esta
EC50 fue 7,40 mg/ml a las 24h y 7,34 mg/ml a las 48h.
12
E. coli 24 horas
120
% inhibición
100
80
y = 60,927x - 3,3572
R² = 0,9888
60
40
20
0
0
0,5
1
1,5
2
log [extracto] (mg/ml)
Figura 9: Recta dosis-respuesta del % de inhibición del crecimiento en el cultivo frente al
logaritmo de la concentración de extracto de ajo de E. coli a las 24 horas.
E. coli 48 horas
120
% inhibición
100
80
60
y = 51,905x + 4,6776
R² = 0,9672
40
20
0
0
0,5
1
1,5
2
log [extracto] (mg/ml)
Figura 10: Recta dosis-respuesta del % de inhibición del crecimiento en el cultivo frente al
logaritmo de la concentración de extracto de ajo de E. coli a las 48 horas.
- S.aureus
La adición de distintas concentraciones de extracto de ajo al medio de cultivo,
inhibió significativamente (p < 0.05) el crecimiento de S. aureus con todas las
concentraciones ensayadas (Fig. 11) tanto a las 24h como a las 48h de cultivo.
13
El test ANOVA muestra diferencias significativas a las 24 horas en las muestras
tratadas con extracto con respecto a la muestra control. El test Tukey establece que la
concentración mínima a la que se producen diferencias significativas con respecto al
control es de 4 mg/ml de extracto de ajo.
A las 48 horas también existen diferencias significativas de crecimiento con
respecto al control .El test de Tukey establece que la concentración mínima a la que
se produce una diferencia significativa del crecimiento con respecto al control es de 4
mg/ml.
Crecimiento
(D.O 530 nm)
S. aureus
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
24h
48h
0
4
8
17
25
33
42
50
Concentración de extracto (mg/ml)
Figura 11: Crecimiento de S. aureus con diferentes concentraciones de extracto de ajo
medido a las 24 y a las 48 horas.
Al igual que en caso anterior se hicieron las curvas dosis-respuesta y se calculó el
valor de la EC50 a las 24 y a las 48 horas, y en este caso el resultado fue de 8,37
mg/ml a las 24 horas y de 8,27 mg/ml a las 48 horas.
- Salmonella sp.
La adición de distintas concentraciones de extracto de ajo al medio de cultivo,
inhibió significativamente (p < 0.05) el crecimiento del microorganismo con todas las
concentraciones ensayadas (Fig. 12) tanto a las 24h como a las 48h de cultivo; el test
ANOVA corrobora estas diferencias significativas (p < 0.05) en el crecimiento de los
cultivos tratados con extracto con respecto a la muestra control, tanto a las 24 como a
las 48 horas. El test de Tukey muestra que la concentración de extracto a la que
producen diferencias significativas con respecto al control es de 4 mg/ml en los dos
tiempos medidos (24 y 48 horas).
14
Crecimiento
(D.O 530 nm)
Salmonella Sp.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
24 h
48h
0
4
8
17
25
33
42
50
Concentración de extracto(mg/ml)
Figura 12: Crecimiento de Salmonella sp. con diferentes concentraciones de extracto de
ajo medido a las 24 y a las 48 horas.
Los resultados de EC50 Salmonella sp. son de 18,19 mg/ml a las 24 horas de
incubación y de 17,88 mg/ml a las 48 horas.
- Mycobacterium phlei
El test ANOVA para M. phlei mostró diferencias significativas en el crecimiento de
los cultivos tratados con extracto de ajo a las 24 y a las 48 horas (Fig. 13). El test de
Tukey determinó que 4mg/ml es la concentración mínima a la que se producen
diferencias significativas en el crecimiento de M. phlei , pero sin embargo, a las 48
horas, éste valor se eleva hasta los 17 mg/ml.
Crecimiento
(D.O 530 nm)
M. phlei
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
24 h
48 h
0
4
8
17
25
33
42
50
Concentración de extracto (mg/ml)
Figura 13: Crecimiento de Mycobacterium phlei con diferentes concentraciones de
extracto de ajo medido a las 24 y a las 48 horas.
15
En este microorganismo, el valor de la EC50 a las 24 horas es de 19,64 mg/ml y a
las 48 horas de 18,86 mg/ml.
- M. luteus
En este caso, de nuevo, existen diferencias significativas para las mediciones de
crecimiento en ambos tiempos de incubación (24 y 48 horas) (Fig. 13). Cuando se
realiza el test de Tukey para ver cuáles son las concentraciones mínimas que
provocan diferencias significativas en el crecimiento de los cultivos tratados con
extracto con respecto al control, éste concluye que, para las 24 y las 48 horas dicha
concentración fue de 4 mg/ml.
Crecimiento
(D.O 530 nm)
M. luteus
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
24 h
48 h
0
4
8
17
25
33
42
50
Concentración de extracto (mg/ml)
Figura 13: Crecimiento de M. luteus con diferentes concentraciones de extracto de
ajo medido a las 24 y a las 48 horas.
Los valores de EC50 obtenidos, fueron de 8,03 mg/ml a las 24 horas y de 7,53
mg/ml a las 48 horas.
- S. cerevisisiae
En el caso de esta levadura, al igual que en el resto de microorganismos vistos
anteriormente, se observan diferencias significativas (Fig. 14) en el crecimiento de las
muestras contenientes de extracto de ajo con respecto a la muestra tomada como
control tras la realización del test ANOVA. Una vez que se realiza el test Tukey, se
observa que 4mg/ml es la concentración mínima a la cual se producen dichas
diferencias significativas en los dos tiempos medidos (24 y 48 horas).
16
Crecimiento
(D.O 530 nm)
S. cerevisiae
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
24 h
48 h
0
4
8
17
25
33
42
50
Concentración de extracto (mg/ml)
Figura 14: Crecimiento de S. cerevisiae con diferentes concentraciones de extracto de
ajo medido a las 24 y a las 48 horas.
El valor de EC50 a las 24 horas es de 7,19 mg/ml y a las 48 horas de 5,86
mg/ml.
4.2.2 Efecto del extracto acuoso de miel en los diferentes
microorganismos
Tras los pobres resultados obtenidos con los halos de inhibición en medio sólido,
solo se ensayaron las distintas concentraciones del extracto de miel frente a una
bacteria gram-negativa (E. coli) y una gram-positiva (S. aureus).
La adición de las concentraciones de extracto de miel al medio de cultivo no
afectó al crecimiento de E. coli ni tampoco al de S. aureus (Fig. 15 y 16) . Los
resultados del ANOVA no muestran diferencias significativas entre los crecimientos de
los cultivos tratados con respecto al control, por lo que el extracto de miel no inhibe el
crecimiento de E. coli. Es más, se observa (Fig.15) un mayor crecimiento a medida
que se incrementa la concentración de extracto. Esto se puede atribuir a la elevada
concentración en azúcares de la miel, que aportan nutrientes extra y favorecen el
crecimiento de las bacterias.
17
Crecimiento
(D.O 530 nm)
E. coli
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
24 h
48 h
0
4
8
17
25
33
42
50
Concentración de extracto (mg/ml)
Figura 15: Crecimiento de E. coli con diferentes concentraciones de extracto de miel.
medido a las 24 y a las 48 horas.
Crecimiento
(D.O 530 nm)
S. aureus
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
24 h
48 h
0
4
8
17
25
33
42
50
Concentración de extracto (mg/ml)
Figura 16: Crecimiento de S. aureus con diferentes concentraciones de extracto de miel.
medido a las 24 y a las 48 horas.
18
5. Discusión
Las diferentes especies bacterianas y la levadura mostraron una sensibilidad
variable al extracto acuoso de ajo. En S. aureus, Salmonella sp., M.luteus y S.
cerevissiae la concentración mínima que produce cambios significativos en el
crecimiento fue de 4 mg/ml. En E. coli la concentración mínima a la que se produce
inhibición es también 4 mg/ml a las 24 horas, sin embargo a las 48 horas es de 8
mg/ml. En el caso de M. phlei la concentración mínima a la que se producen
diferencias significativas en el crecimiento es de 4 mg/ml, sin embargo a las 48 horas,
esta concentración se eleva hasta los 17 mg/ml.
Teniendo en cuenta lo descrito anteriormente se observa que, el extracto de ajo
presenta un amplio espectro de actividad antibacteriana contra bacterias gram
positivas y gram negativas, así como micobacterias y levaduras. Esta hipótesis se ve
respaldada por estudios anteriores llevados a cabo aplicando extracto de ajo a
diferentes microorganismos. En el año 1999, Ankri & Mirelman llevaron a cabo una
investigación en la que comprobaron el efecto antimicrobiano del ajo en distintos
microorganismos, entre los que se encontraban especies de Escherichia, Salmonella y
Staphylococcus, observando que, el ajo tenía un notable efecto antibiótico en todas las
bacterias anteriormente descritas. Curiosamente, varias cepas bacterianas resistentes
a algunos antibióticos, tal como es el caso de Staphylococcus aureus y su resistencia
a la meticilina, o E.coli y su resistencia a varios fármacos, tuvieron una elevada
sensibilidad al componente del ajo denominado “alicina”.
Además, en 2006, Indu et al., también obtuvieron unos resultados positivos en
cuanto a la actividad antibacteriana del ajo en E. coli.
Los valores de EC50 en E. coli y en S. aureus son similares, estos resultados
concuerdan con los de otras investigaciones anteriores (Ankri & Mirelman, 1999),
donde la concentración de alicina necesaria para matar a los individuos en ambos
microorganismos fue muy similar, lo que indica que la sensibilidad al ajo de ambos
microorganismos es muy similar, a pesar de las diferencias estructurales de su pared
celular.
Mycobacterium , a las 24 horas tiene una alta sensibilidad al extracto de ajo, en
cambio, a las 48 horas el valor de concentración mínimo que produce diferencias
significativas en el crecimiento es más elevado. Esto podría deberse a la composición
de su pared celular, que tiene un alto contenido en ácidos micólicos. El ajo es
considerado como una de las fuentes vegetales más ricas en compuestos fenólicos
(Martins et al.,2016), lo que implica que tendría dificultades para penetrar en la pared
ácido alcohol resistente de M. phlei.
En cuanto a la levadura, en S. cerevisiae se observa un gran efecto del extracto
de ajo sobre el crecimiento de ésta ( la concentración de extracto más baja que
provoca diferencias significativas en el crecimiento con respecto al control es de 4
mg/ml en los dos tiempos medidos). Estos resultados concuerdan con estudios
anteriores que relacionaron este microorganismo con el ajo. En 1996, Naganawa et al.,
estudiaron los efectos de un componente concreto presente en el ajo, el ajoene, en
19
diferentes tipos de microorganismos, entre los cuales se encontraba S. cerevisiae. Los
resultados obtenidos de dicho estudio determinaron la inhibición en el crecimiento de
S. cerevisiae a concentraciones de 30 g/ml. Este mismo estudio de Naganawa et al.
Incluye otros microorganismos, como es el caso de Micrococcus luteus. Este
microorganismo se inhibía a concentraciones de 136 g/ml de ajoene. Estos
resultados concuerdan con los obtenidos en este estudio, en el que los resultados
muestran una menor efectividad del ajo en el Micrococcus que en la levadura.
En el caso de la miel, no se obtuvieron diferencias significativas con respecto al
control en ninguna de las concentraciones de extracto de miel administradas a los
cultivo de los microorganismo. En el año 2007, Basualdo et al., realizaron un estudio
sobre la comparación de la actividad antibacteriana de la miel contra diferentes
bacterias y obtuvieron que, en algunos de los microorganismos estudiados, entre los
que se encontraban S. aureus y E. coli, todas las muestras a las que se les aplicó miel
sin diluir producen la inhibición del crecimiento. En cambio, cuando se aplica la miel
diluida, no se observa inhibición del crecimiento bacteriano. La dilución de la miel
podría explicar la ausencia de inhibición en las muestras de este estudio. Además, el
efecto antimicrobiano de la miel sin diluir podría explicarse por la alta concentración de
azúcares presentes en la miel; es decir, que no es que exista la producción de
sustancias antimicrobianas, si no que el efecto puede ser debido a un choque
osmótico a causa de la elevada concentración de azúcares. En el año 2010, Rahman
et al. , obtuvieron resultados de efecto antimicrobiano de la miel en S. aureus, pero
estos efectos eran producidos a concentraciones muy altas de extracto de miel (370
mg/ml), reforzándose la hipótesis de que la inhibición puede ser debida a la gran
concentración de azúcares.
20
6. Conclusiones
1. El extracto de ajo presentó una actividad antimicrobiana de amplio
espectro, teniendo efecto inhibitorio en todas los tipos de microorganismos
estudiados: dos bacterias gram positivas, dos gram negativas, una
micobacteria y un a levadura.
2. El extracto de miel no presentó actividad antimicrobiana de ningún tipo
en los microorganismos de estudio.
Conclusións
1. O extracto de allo amosou una actividade antimicrobiana de amplio
espectro, tendo efecto inhibitorio en tódolos tipos de microorganismos
estudados: dúas bacterias gram positivas, dúas gram negativas, una
micobacteria e una levadura.
2. O extracto de mel non presentou actividade antimricrobiana de ningún
tipo nos microorganismos de estudo.
Conclusions
1. Garlic extract showed broad-spectrum antimicrobial activity, showing
inhibitory effect on the growth of all of the microorganisms assayed: two grampositive bacteria, two gram-negative bacteria, one mycobacteria and one yeast.
2. Honey extract did not show antimicrobial activity on the growth of any
of the microorganisms assayed.
21
22
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