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PROGRAMA DE ENZIMOLOGÍA
Asignatura de la Licenciatura de Bioquímica
Materia troncal
Crédito: 6 Totales (4 teóricos, 2 prácticos)
Profesor: Juan Parrado
[email protected]
OBJETIVOS
Objetivos de contenidos:
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Comprender el concepto de enzima y conocer sus características generales.
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Comprender los mecanismos de regulación enzimática, sobre todo mediante unión reversible de
ligandos y los conceptos de cooperatividad y alosterismo
Conocer en profundidad los aspectos cinéticos y los mecanismos que subyacen a su actividad.
Aprender las técnicas utilizadas en el aislamiento, purificación y caracterización de las enzimas.
Entender cómo las enzimas aumentan la velocidad de las reacciones.
Comprender los mecanismos de acción de algunas enzimas y saber cómo se puede determinar
experimentalmente el mecanismo de acción de una enzima.

Conocer las posibilidades técnicas de las enzimas y sus aplicaciones de interés biomédico e
industrial.
Objetivos de competencias y habilidades que el alumno debe desarrollar:

Saber diseñar, ejecutar e interpretar correctamente un experimento de cinética enzimática,
determinar los parámetros cinéticos y conocer los distintos tipos de representaciones sabiendo
qué información que se puede obtener de cada una de ellas.
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Conocer cómo se puede determinar experimentalmente el mecanismo de acción de una enzima.
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Aprender a buscar en bases de datos información acerca de las enzimas (composición,
secuencia, punto isoeléctrico, ligandos, reacciones que catalizan…).
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Conocer la existencia de programas informáticos y de sus usos, y las limitaciones en el
tratamiento matemático de los experimentos con enzimas.

Aprender a diseñar un experimento de purificación de enzimas a partir de distintos organismos
o, en su caso, a interpretar críticamente uno publicado en la bibliografía.
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Familiarizarse con el trabajo en el laboratorio, la instrumentación y los métodos experimentales
más utilizados en la investigación con enzimas, incluyendo la seguridad, la eliminación de
residuos químicos y biológicos y el uso del cuaderno de laboratorio.

Estimular la capacidad de realizar presentaciones orales ante un auditorio.
Aprender a evaluar críticamente trabajo de investigación relacionado con el uso y/o
caracterización de enzimas.
EVALUACIÓN
Para poder ser evaluado de esta asignatura es imprescindible liberar los créditos prácticos para lo
que se juzga:
a) la asistencia a prácticas
b) Participación activa en las prácticas
c) Cuaderno de laboratorio.
En la nota final el 80% corresponde al examen final y el 20% restante a los créditos prácticos. El
examen final consta de un test de unas 40 preguntas y de 2 cuestiones a desarrollar con apartados. El
examen incluye el programa teórico y los problemas de la asignatura. Durante el curso pueden
conseguirse puntos adicionales en la calificación final:
Entregando un trabajo y exponiéndolo en público sobre algún aspecto del temario de la asignatura que
se considere
Exponiendo y resolviendo los problemas de los diferentes temas de la asignatura
PROGRAM A DE ENZIMOLOGÍA
INTRODUCCIÓN
Tema 1. Introducción a la enzimología. Breve historia de la Enzimología. Descripción general
de las enzimas. Enzimas monoméricas y enzimas oligoméricas. Enzimas solubles y enzimas
ligadas a membranas. Clasificación de enzimas. Isoenzimas. Enzimas no convencionales,
Ribozimas, Anticuerpos catalíticos (Abismas), Synzimas.
ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LAS ENZIMAS
Tema 2. Purificación de enzimas .Introducción. Reglas básicas para la selección de un
proceso de purificación. Actividad total y específica. Métodos de homogenización. Métodos de
separación. Tabla de purificación. Evaluación de la purificación.
Tema 3. Análisis estructural de enzimas. Determinación de la Masa molecular, composición
aminoacídica y estructura primaria. Determinación de la estructura secundaria y terciaria.
Determinación de la estructura cuaternaria. Plegamiento/desplegamiento de estructuras.
Motivos y dominios estructurales.
Tema 4. Coenzimas. Características generales y clasificación. Cofactores metálicos. Vitaminas
como Cofactores. a) Procesos redox, b). Transferencia de grupos, c. Función mixta.
Tema 5. Catálisis enzimática. Introducción. Conceptos termodinámicos. Teoría del Estado de
transición. Perfil energético de una reacción enzimática. Centro activos de las enzimas
Tema 6. Mecanismo de acción enzimática 1. Efectos energéticos, Efectos entrópicos,
Efectos de orientación y proximidad, Efecto del anclaje de los substratos sobre la enzima
.
Tema 7. Mecanismo de acción enzimática. Catálisis ácido-base. Catálisis covalente. Catálisis
por iones metálicos.
Tema 8. Aproximaciones experimentales para la determinación del mecanismo de
acción. Estudios cinéticos. Detección de intermediarios, modificación química de aminoácidos,
mutagénesis dirigida.
Tema 9. Mecanismos de acción de enzimas seleccionadas. Quimiotripsina, Triosafosfato
isomerasa, etc.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Tema 10. Cinética química. Velocidad de reacción. Molecularidad y Orden de reacción;
Ecuaciones cinéticas. Reacciones reversibles. Determinación de la constante de velocidad de
primer orden.
Tema 11. Efecto de la temperatura sobre las velocidades de reacción. Teoría de las
velocidades absolutas de reacción. Equivalencia entre la aproximación experimental de
Arrhenius y la teoría de las velocidades absolutas de reacción de Eyring.
Tema 12. Introducción a la cinética enzimática. Introducción del concepto de complejo
enzima-sustrato Cinética enzimática de reacciones monosustrato. Aproximación del equilibrio
rápido: Ecuación de Henri-Michaelis-Menten. Aproximación del estado estacionario:
Tratamiento de Briggs-Haldane.Ecuación de Michaelis-Menten. Significado de los parámetros
cinéticos: Km, Vmax y kcat. Poder catalítico de una enzima. Medida de la eficiencia y la
especificidad de una enzima: kcat/Km .
Tema 13. Obtención y análisis de datos cinéticos.
Integración de la ecuación de Michaelis-Menten.. Representación gráficas de la ecuación de
Michaelis-Menten: v frente a [S], Doble reciprocos (1/v  1/[S]), Representación de Hanes ([S]/v
 [S] ) Representación de Eadie-Hofstee (v  [S]/v), Representación directa o representación
de Eisental-Cornish-Bowden o representación de Macarulla
Tema 14. Reversibilidad en el mecanismo de Michaelis-Menten. Ecuación de velocidad
reversible, Relación de Haldane
Tema 15. Las enzimas en los seres vivos. Velocidad total. Resolución de la ecuación de
velocidad en el estado estacionario. Método de King y Altman, Relaciones de Haldane
Tema 17. Inhibición enzimática I. Introducción. Inhibición reversible. Inhibición competitiva
(inhibición específica). Inhibición no-competitiva. Inhibición incompetitiva o acompetitiva.
Representación de Dixon. Inhibición por sustrato
Tema 17. Inhibición enzimática II. Inhibición pseudoirreversibles
Inhibidores irreversibles o venenos catalíticos: Análisis de la velocidad de inactivación
enzimática. Tipos de mecanismos de inhibición irreversible
Tema 18. Reacciones multisustrato. Introducción. Nomenclatura.Reacción enzimáticas con
2 sustratos y 2 productos. Resolución de la ecuación de velocidad para un sistema de dos
sustratos con formación de un complejo ternario al azar. Resolución de la ecuación de
velocidad para reacciones multisustrato mediante el método de King & Altman: Mecanismo BiBi ordenado, Mecanismo Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong.
Tema 19. Efecto de la temperatura y el pH. Dependencia de la temperatura.. Efecto del pH
sobre la actividad enzimática. Deducción de los pKa de los aminoácidos del centro activo.
Efecto del pH sobre la ionización del substrato.
REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Tema 20. Estrategias de control de actividad enzimática I. Regulación en la cantidad de
enzima. Regulación por modificaciones covalentes: Modificaciones covalentes irreversibles
Modificaciones covalentes reversibles
Tema 21. Estrategias de control de actividad enzimática II. Regulación por Cambios
Conformacionales. Interacción proteína-ligando.Función de Scatchard, Ecuación de Hill.
Modelo concertado de Monod, Wyman y Changeux (MWC), Modelo secuencial (KNF).
APLICACIONES DE LA ENZIMOLOGÍA
Tema 22. Aspectos clínicos de la enzimología
1. Introducción
4. Determinación de actividades enzimáticas en el diagnostico clínico
5. Terapia enzimática
6. Inhibidores enzimáticos
ENZIMOLOGIA INDUSTRIAL: Estructura, función y aplicaciones de enzimas industriales
(SEMINARIOS).
PRÁCTICAS ENZIMOLOGÍA 2006/07
1. Utilización de herramientas informáticas.
Programa Proteins Estudios de procesos de purificación de proteínas.
Programa Enzpack
Determinación de parámetros cinéticos Km y Vmax
Estudios de inhibición: determinación de la Ki y tipo de inhibición
2.
Estudio cinético de la Succinato deshidrogenasa.
Aislamiento y purificación de mitocondrias
Medida de parámetros cinéticos
Estudios de inhibición.
3. Purificación de la lisozima mediante cromatografía de intercambio iónico
Medida y evaluación de la purificación mediante SDS-Page
Estudios de la estabilidad de la estructura terciaria
.
BIBLIOGRAFÍA BÁSICA RECOMENDADA
Núñez de Castro I (2001). Enzimología. Editorial Pirámide, Madrid.
Tratamiento formal de la cinética química y enzimática. Fundamentos y aplicaciones del
análisis enzimático.
Price NC and Stevens L (1999) Fundamentals of Enzymology: The cell and molecular
biology of catalytic proteins. Oxford University Press.
Enzimología básica y acercamiento a sistemas biológicos.
de Arriaga M D, Soler J, Busto F y Cadenas E (1998) Manual de ejercicios de cinética
enzimática. Secretariado de Publicaciones, Universidad de León. León.
Colección de problemas sobre cinética enzimática.
Segel, IH (1982) Cálculos de Bioquímica. Ed. Acribia. Zaragoza.
Aunque es un texto general, se trata de un libro muy pedagógico con múltiples
problemas de Bioquímica y que contiene una explicación teórica a cada tema. Como
indica su nombre está muy enfocado al tratamiento cuantitativo de la Bioquímica. El
capítulo dedicado a las enzimas está centrado sobre todo en la cinética con abundantes
representaciones gráficas.
Mathews CK y Van Holde KE (1999) Bioquímica (2ª edición). MacGraw-HillInteramericana, Madrid.
Introducción a las técnicas utilizadas en el estado preestacionario
cap. 11: Herramientas de la Bioquímica 11a: "Cómo medir las velocidades de las
reacciones catalizadas por enzimas".
Voet D y Voet JG (1992) Bioquímica. Ediciones Omega, Barcelona.
Nociones básicas de cinética monosustrato.
Introducción a la inhibición enzimática
cap. 13: “Velocidad de las reacciones enzimáticas”
Explica varias técnicas utilizadas en la purificación de enzimas. Buenos gráficos.
Cap. 5: “Técnicas de purificación de las proteínas”
Stryer L, Berg JM y Tymoczko JL (2003) Bioquímica, Editorial Reverté, Barcelona.
Estudio del mecanismo de acción de enzimas seleccionadas: proteasas, anhidrasa
carbónica, enzimas de restricción y nucleósido monofosfato quinasas.
cap. 9: “Estrategias catalíticas” (p. 227-260).
Godfrey T y West S, Eds. (1996) Industrial Enzymology. (2nd edition) Stockton Press,
New York.
Texto de referencia acerca del uso industrial de las enzimas. Suministra información
acerca de aplicaciones agroalimentarias, químicas, farmacéuticas e industrias
relacionadas con el media ambiente. También se discuta acerca de la legislación y
regulación del uso comercial de las enzimas
ENLACES DE INTERÉS
Terminología y nomenclatura
Terminología Química y Bioquímica. Recomendaciones de la IUPAC/UIBBM sobre
terminología Química y Bioquímica
(Department of Chemistry, Queen Mary and Westfield College, London).
Simbología y nomenclatura de cinética enzimática. Normas de la IUPAC/UIBBM sobre
simbología y nomenclatura de cinética enzimática.
(Department of Chemistry, Queen Mary and Westfield College, London).
Nomenclatura de enzimas.Normas de la IUPAC/IUBBM sobre nomenclatura de enzimas
Permite búsquedas de enzimas concretas
(Department of Chemistry, Queen Mary and Westfield College, London).
ExPASy: Nomenclatura de enzimas. Busca una enzima y devuelve su clasificación
(Expert Protein Analysis System (ExPASy) Molecular Biology Server, from the Swiss Institute of
Bioinformatics)
Glosario de Bioquímica y Biología Molecular. Definiciones concisas de términos y
técnicas utilizados en Bioquímica y Biología Molecular. Permite búsquedas
(David M. Glick. Glossary of Biochemistry and Molecular Biology. Portland Press, London).
Bases de datos sobre enzimas
ExPASy: Expert Protein Analysis System. Múltiples herramientas para búsqueda de
secuencias, estructuras tridimensionales y predicciones sobre proteínas.
(Expert Protein Analysis System (ExPASy) Molecular Biology Server, from the Swiss Institute of
Bioinformatics)
ExPASy: SWISS-PROT. Base de datos de secuencias de proteínas (SWISS-PROT) con
posibilidad de realizar búsquedas. Información detallada acerca de la secuencia,
mutaciones, número de clasificación de enzima (E.C.) requerimiento de cofactores,
modificaciones postraduccionales, bibliografía y mucho más. Enlaces directos con múltiples
herramientas que permiten, por ejemplo, estimar la masa molecular y el punto isoeléctrico o
realizar predicciones estructurales.
(ExPASy Molecular Biology Server, from the Swiss Institute of Bioinformatics)
ExPASy: "Boehringer Mannheim Biochemical Pathways" Permite localizar una enzima
en un mapa metabólico detallado e interactivo del metabolismo celular (“Boehringer
Mannheim Biochemical Pathways”).
(ExPASy Molecular Biology Server, from the Swiss Institute of Bioinformatics)
BRENDA La mayor base sobre datos funcionales de las enzimas (Km, pH óptimo,
dependencia de cofactores, inhibidores, métodos de almacenamiento y purificación,
referencias bibliográficas...) Incluye datos de aproximadamente 3500 enzimas. Es gratuita
pero hay que registrarse.
(Institute of Biochemistry, Cologne University, Germany)
National Institutes of Health (NIH): NCBI Múltiples bases de datos acerca de secuencias
de proteínas, ácidos nucleicos, mapas genéticos y físicos de distintos organismos y múltiples
herramientas de predicción y visualización de estructuras. Pueden buscarse artículos
originales en MEDLINE a través de PubMed.
(National Center for Biotechnology Information (NCBI). National Library of Medicine. National Institutes
of Health (NIH)
Protein Data Bank (PDB). Protein Data Bank (PDB): obtención, tratamiento y visualización de
datos estructurales de macromoléculas (3D) obtenidos principalmente mediante cristalografía
de rayos X y RMN.
(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics: RCSB)
Enzyme Structures Database: E.C.- PDB. Base de datos con la estructura de todas las
enzimas conocidas ordenadas por clase (E.C.). Cada entrada incluye la secuencia de la
enzima, mapa de su estructura secundaria, número de acceso a la estructura tridimensional
(PDB), dibujos, información sobre el sitio activo y alineamientos con secuencias de proteínas
relacionadas.
(Biomolecular Structure and Modelling Group, University College, London)
LIGAND: todas las reacciones catalizadas por enzimas Una gran base de datos sobre
todas las reacciones catalizadas por enzimas, ofreciendo detallada información sobre
sustratos, productos y las propias enzimas. Incluye además rutas bioquímicas, secuencias de
genes y enfermedades genéticas ligadas a vías específicas o enzimas.
(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG), Kyoto University, Japan)