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DETERMINACIÓN DE ISOTERMAS DE ADSORCIÓN DE NANOPARTÍCULAS EN
ESCHERICHIA COLI.
Heiko Schwermann1, Martin Caporgno2
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Engler-Bunte-Institut, Berreich Wasserchemie, Universität Karlsruhe, Karlsruhe, Alemania
Universidad Tecnológica Nacional - Facultad Regional Villa María, Avenida Universidad 450,
(5900) Villa María, Córdoba, Argentina. E-mail: [email protected]
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1 Introducción.
La nanotecnología se ocupa de la manipulación de la materia a escala de átomos y moléculas, y
se está constituyendo como la mayor revolución tecnológica de todos los tiempos. Sus
aplicaciones actuales y potenciales abarcan un amplio espectro en el que se encuentra la
biomedicina, la farmacéutica, la industria cosmética, la alimentación, la agricultura, la industria
química y de materiales, la industria de la construcción, la industria textil, del caucho, la
informática, la computación y muchas otras. Todo lo existente está compuesto de átomos y
moléculas y es potencialmente posible de ser modificado, cambiando así sus propiedades y
encontrando nuevos usos.
Las propiedades de las nanopartículas ofrecen ventajas técnicas y económicas para su utilización,
pero por otro lado constituyen un riesgo potencial. El desconocimiento de los efectos que éstas
pueden traer sobre el medio ambiente debe ser evaluado, teniendo en cuenta que dentro de un
corto tiempo estas partículas podrían ser transportadas hasta llegar al agua que consumimos.
Para la realización de este trabajo se emplea un cultivo batch de Escherichia Coli, que provee los
microorganismos en su etapa exponencial de crecimiento. La determinación de la concentración
de las nanopartículas de hierro (III) se lleva a cabo mediante la determinación de la absorción a
400 nm en un espectrofotómetro. Anteriormente se realizó una curva de calibración en la que se
relacionan la concentración de hierro medida en un espectrofotómetro y la misma concentración
determinada por el método ICP-OES (en inglés Inductively Coupled Plasma Optical Emission
Spectrometry). Este segundo método brinda una mayor exactitud pero requiere un mayor trabajo
dificultando su aplicación en nuestras experiencias.
Los microorganismos y diferentes concentraciones de nanopartículas de Fe se ponen en contacto
y las interacciones electrostáticas son medidas. El pH de la solución es ajustado a dos valores
diferentes. Mediante centrifugación son separadas las partículas adsorbidas por las bacterias, que
sedimentan. La concentración de óxido de hierro no adsorbido es determinada fotométricamente
en el sobrenadante y matemáticamente se obtienen los valores que permiten la construcción de
las isotermas de adsorción. Finalmente se examinan los efectos toxicológicos de las
nanopartículas sobre los microorganismos mediante la evaluación del crecimiento de los
microorganismos.
2. Materiales y Métodos.
2.1. Cultivo de bacterias.
Para la realización de las experiencias las bacterias fueron generadas en un cultivo batch,
compuesto por medio Lauria-Bertani en agua. Por motivos de esterilidad el medio fue esterilizado
en autoclave y posteriormente las bacterias de Escherichia Coli incorporadas. Se inoculó a 30° C y
bajo agitación constante.
2.2. Determinación del contenido de hierro luego de la adsorción.
La determinación del contenido de hierro fue determinada mediante la medición de la absorción a
400 nm. El espectrofotómetro utilizado es marca Varian, modelo Cary 50.
La curva de calibración fue realizada con una solución de hierro estándar en el rango desde 0 a 70
mg/l en una solución 0,75 mmol/l de NaCl.
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2.3. Determinación de las curvas de adsorción.
Una porción del cultivo de Escherichia coli es centrifugado por 8 minutos a 2000 x g y 4°C, con
objeto de separar las células. El sobrenadante es desechado y el sedimento nuevamente
suspendido en solución salina 0,75 mmol/l NaCl. Bajo las mismas condiciones anteriores, la
suspensión es centrifugada una vez más y es eliminado el sobrenadante, las células que ya se
encuentran limpias de medio de cultivo, son resuspendidas en la solución salina de NaCl y la
densidad óptica es medida.
Se prepararon tubos con solución salina y diferentes concentraciones de nanopartículas de hierro.
En estos tubos es agregado una porción calculada de la suspensión de bacterias preparada
anteriormente, de manera que la densidad óptica en los mismos sea de 0,1.
Las soluciones de nanopartículas utilizadas, con tamaños de partículas aglomeradas de 80 y 100
nm, contenían 519,7 y 520,62 mg/l. Las cantidades añadidas a los diferentes tubos fueron de 50,
100, 150, 300, 500, 700 y 1000 µl y el volumen en los mismos completado a 4 ml.
Para mejorar la estabilidad de las partículas, el pH fue estabilizado en dos ocasiones diferentes en
valores de 4 y 10, mediante la adición de 7µl de 0,1 mol/l HCl y 40µl de 0,1 mol/l NaOH.
La suspensión con las nanopartículas fue agitada durante períodos de 20, 90 y 180 minutos en
distintas experiencias. Posteriormente las pruebas fueron centrifugadas durante 14 minutos, 1500
x g y 4°C. Con una pipeta se separó el sobrenadante y mediante espectrofotometría se determinó
el contenido de hierro en el mismo con ayuda de la curva de calibración.
La medición del tamaño de las partículas en la dispersión permitió analizar las interacciones entre
las partículas puestas en contacto. El equipamiento utilizado para la medición es el Zetasizer Nano
ZS, fabricado por la firma Malvern Instruments Ltd.
El precipitado se resuspendió en solución salina y distintas diluciones del mismo fueron
sembradas en placas de cultivo para evaluar la toxicidad.
2.4. Separación de las bacterias y las nanopartículas de Fe2O3 – Optimización de la
separación.
Para la correcta elección de las condiciones de centrifugación necesarias para lograr una mejor
separación entre ambas partículas, una prueba fue sometida a diferentes condiciones de
centrifugación, y los porcentajes de ambas partículas que permanecían en solución fueron
determinados. Los resultados se resumen en la tabla 1:
Tabla 1 Velocidad de centrifugación para tres tiempos diferentes.
Tiempo
velocidad
% Escherichia coli
% Fe2O3
400 g
71,0 %
99,4 %
600 g
56,1 %
97,3 %
7 Min
700 g
59,5 %
97,2 %
2000 g
23,6 %
95,1 %
700 g
25,6 %
94,2 %
1200 g
5,7 %
92,1 %
14 Min
1500 g
1,3 %
94,4 %
2000 g
1,5 %
86,1 %
20 Min
700 g
9,8 %
95,7 %
Mediante esta experiencia se puede ver que las condiciones de 14 minutos, 1500 x g y 4°C llevan
a una óptima separación, debido a que se sedimenta la mayor parte de las bacterias, mientras que
las nanopartículas no adsorbidas permanecen en su mayoría en solución.
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3. Resultados y Discusión.
3.1. Curva de Potencial Zeta: dependencia con el pH.
En la figura 1 se puede observar el comportamiento del potencial zeta de la suspensión de
bacterias y de la solución de hierro con la variación del pH. Las mediciones fueron realizadas con
el equipo Zetasizer Nano ZS, fabricado por la firma Malvern Instruments Ltd.
Figura 1: Dependencia del potencial zeta a diferentes valores de pH.
El análisis de esta gráfica permite observar que la diferencia entre la carga de los dos tipos de
partículas es mayor a pH 4. Esta diferencia determina que exista una gran interacción entre las
partículas cuando son puestas en contacto. Por el contrario, para pH 10, la similitud en los valores
del potencial zeta determinados en ambos casos permite predecir un predominio de fuerzas de
repulsión y la adsorción del hierro es mínima en este caso.
3.2. Isotermas de adsorción con E. Coli.
En las figuras 2 y 3 pueden verse los resultados de la adsorción de las nanopartículas de hierro
sobre la superficie de las bacterias para diferentes tiempos de agitación. La cantidad adsorbida
depende no solo de la superficie del adsorbente sino también de la concentración de las
nanopartículas en la suspensión.
1
80 nm
Carga [pg/célula]
0,9
0,8
0,7
0,6
20 min
90 min
180 min
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
βsobrenadante [m g/l]
0
0
20
40
60
80
100
120
Figura 2: Resultados de la adsorción de partículas de 80 nm para diferentes tiempos de agitación.
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Las curvas presentan una gran similitud. Un gran incremento al principio y posteriormente se
mantienen aproximadamente constantes en el tiempo.
1
110 nm
Carga [pg/célula]
0,9
0,8
0,7
0,6
20 min
90 min
180 min
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
βsobrenadante [m g/l]
0
0
20
40
60
80
100
120
Figura 3: Resultados de la adsorción de partículas de 110 nm para diferentes tiempos de
agitación.
Para las partículas con diámetro de 110 nm el incremento en la cantidad adsorbida es más lento,
sin embargo las curvas tienden a un valor constante, debido posiblemente a una saturación de la
superficie de la bacteria disponible para la adsorción
3.3. Cambio del tamaño de las partículas luego de la adsorción.
La distribución del tamaño de partículas de diámetro 110 nm se determinó luego de la adsorción.
Mediante una curva de distribución se pueden ver los resultados de mejor manera.
La gráfica muestra un desplazamiento hacia la derecha del valor medio con respecto a la solución
original y una disminución de la intensidad que es mayor cuando la concentración de hierro en la
solución es menor. Esto demuestra una mayor adsorción de las partículas pequeñas. El mismo
comportamiento pudo observarse con las partículas de 80 nm.
Figura 4: Distribución del tamaño de partículas de hierro, expresado como una relación entre la
carga en el sobrenadante y la carga en la solución original.
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3.4. Isotermas de adsorción para diferentes valores de pH.
Las fuerzas de repulsión en medio alcalino hace que la adsorción sea insignificante si los valores
se comparan con los resultantes a pH 4.
0,8
pH 10
Carga [pg/zelle]
0,7
0,6
0,5
pH 4
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
20
40
60
80
100
120
140
-0,1
βsobrenadante[m g/l]
-0,2
Figura 5: Comparación de la adsorción para diferentes valores de pH.
3.5. Test de toxicidad.
En la figura 6 pueden verse los efectos tóxicos que causan las nanopartículas a las bacterias. Para
esto se evaluó la tasa de crecimiento para diferentes concentraciones de nanopartículas y dos
valores de pH.
120%
pH 4
pH 10
Tasa de crecimiento
100%
80%
60%
40%
20%
0%
0 mg/L Fe2O3
6 mg/L Fe2O3
24 mg/L Fe2O3
60 mg/L Fe2O3
Concentración de hierro
Figura 6: Grado de toxicidad para los dos valores de pH utilizados.
Para pH alcalino puede observarse la ausencia de efectos negativos sobre el crecimiento de las
bacterias dado a la escasa interacción entre las partículas y las bacterias. Sin embargo en pH
ácido existe una gran disminución del crecimiento a medida que se incrementa la concentración de
nanopartículas en contacto con las bacterias.
4. Conclusiones.
•
La interacción entre las partículas en la solución, determinadas con la medición del
potencial zeta, se ve influenciada por el pH del medio. Esto queda demostrado observando
la mayor adsorción que resulta a pH 4.
5
•
La cantidad de partículas de hierro en la superficie de las bacterias depende de la
concentración de hierro en la solución inicial. Además está influido por el tamaño de las
partículas a adsorber. Las más pequeñas se adsorben con mayor facilidad que las
grandes, posiblemente debido a causa de impedimentos estéricos.
•
La evaluación de la toxicidad indica que una mayor cantidad de partículas adsorbidas
causa mayores efectos tóxicos a las bacterias. Una de las posibles causas sería la
dificultad que encuentran las bacterias para realizar el transporte de sustancias a través de
su membrana cuando esta se halla recubierta por las nanopartículas, causando la muerte
de las mismas.
5. Agradecimientos.
El agradecimiento es principalmente para Heiko Schwegmann por la conducción en el trabajo.
Para el Prof. Dr. Frimmel por autorizar la realización del mismo y para todos los miembros del
instituto de química del agua la Universidad de Karlsruhe, Alemania por la colaboración.
6. Referencias
Prof. Dr. Rainer H. Müller, Berlin
Unter Mitarbeit von Dr. Gesine E. Hildebrand, TU Braunschweig
Zetapotential und Partikelladung in der Laborpraxis
ISBN 3-8047-1465-X
Karl Höll,
Wasser : Nutzung im Kreislauf ; Hygiene, Analyse und Bewertung.
Berlin: de Gruyter 2002.
ISBN 3-11-012931-0
Fritz H. Frimmel, Gudrun Abbt-Braun
Wassertechnologisches und wasserchemisches Praktikum.
Karlsruhe : Lehrstuhl für Wasserchemie, 2006
ISSN 1612-118X
Lingling Zhang, Yunhong Jiang, Yulong Ding
Investigation into the antibacterial behaviour of ZnO nanoparticles (ZnO nanofluids)
Journal of Nanoparticle Research (2007) 9: 479-489
Antoine Thill, Ophélie Zeyons, Oliver Spalla
Cytotoxicity of CeO2 Nanoparticles for Escherichia coli. Physico-Chemical Insight of the
Cytotoxicity Mechanism.
Environ. Sci. Technol. 2006, 40, 6151 - 6156
Laura K. Adams, Delina Y. Lyon, Pedro J.J. Alvarez
Comparative eco-toxicity of nanoscale TiO2, SiO2, and ZnO water suspensions.
Water Research 40 (2006) 3527 - 3532
Bernard Nowack, Thomas D. Bucheli
Occurrence, behavior and effects of nanoparticles in the environment.
Sciencedirect, Environmental Pollution xx (2007) 1-18
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