Download Expresión Génica: DNA MICROARRAYs

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS
PUCMM (SANTIAGO)
OCTAVA SESIÓN: LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR
Expresión Génica: DNA MICROARRAYs
1. INTRODUCCIÓN.
El análisis de un chip de ADN ó DNA microarrays es una nueva y potente
herramienta de investigación que nos permite visualizar e interpretar al mismo
tiempo la expresión celular de cientos de genes. La detección de patrones y
cambios en la transcipción génica es una forma de entender cómo es el
funcionamiento celular normal así como el anormal o patológico.
Un chip de ADN se fabrica con una matriz sólida, como por ejemplo un
portaobjetos de vidrio, donde se dispone un patrón de diferentes spots o
manchas. Cada spot corresponde a una copia de un oligonucleótido específico
que representa a una parte de un genoma.
Un DNA microarrays será usado para analizar los DNAs complementarios
o cDNAs que fueron aislados previamente de células patológicas (cancerosas)
o no patológicas (no cancerosas) pertenecientes a un mismo tejido. Estas
muestras de ADN son teñidas y aplicadas para su hibridación en el chip. La
unión de cada gen “teñido” a su complementario del DNA microarrays indica
en que medida ocurre la transcipción. Los análisis computacionales de estos
chips de DNA revelan qué genes fueron transcritos en el tejido patológico y qué
genes en el tejido normal, proporcionándonos marcadores para el diagnóstico.
Un microarrays de DNA puede contener mas de 30,000 spots de DNA
cada uno de ellos representando a un gen diferente de un organismo. En este
laboratorio usted simulará un de chip de ADN para estudiar la expresión de
seis genes diferentes de células de pulmón cancerígenas y normales. Los
resultados que se obtendrán nos mostrarán cómo se transcriben dichos genes
en ambas situaciones celulares.
Algunos genes son silenciados o no transcritos en células cancerígenas,
pero si en el tejido normal, pudiendo jugar un papel muy importante en el
desarrollo de la enfermedad. Otros se transcriben mucho más en estas células
que en las células sanas, siendo también importantes en la conversión celular
maligna. Algunos no cambian su expresión y parece que no juegan un papel
decisivo en el proceso cancerígeno. Finalmente existen los que no se expresan
en ninguna de las dos situaciones. ¿Sabrías decir por qué?.
2. OBJETIVOS.
a. Aprender que el chip de ADN es una herramienta tecnológica, que se
utiliza en la actualidad, para medir la actividad (transcripción) de cientos
de genes a la vez.
b. Comprender que la expresión de los genes está regulada
diferencialmente. Todas las células de un organismo contienen los
mismos genes pero no todos se expresan a la vez sino que su
transcripción va a depender
tanto del tipo celular como de las
condiciones. Esto es lo que proporciona a cada tejido su fenotipo
particular.
(Es importante hacer saber que los genes que no son fuertemente
expresados (transcritos) pueden jugar un papel importante en la función
celular).
3. MATERIALES.
Portaobjetos simulando el chip (Se pueden lavar y secar para reutilizar).
6 muestras con cada uno de los seis genes a estudiar:
Gen 1;C4BPA (Componente 4 del Sist.del Complemento)
Gen 2 ODC1 (Ornithine decarboxilasa 1)
Gen 3 FGG (Fibrinógeno, polipeptido gamma)
Gen 4 HBG1 (Hemoglobina,gamma A)
Gen 5 SIAT9 (Sialitransferasa 9)
Gen 6 CYP24 o CYP24A1 (Citocromo P450)
Buffer de hibridación. (Manipular con precaución, contiene NaOH).
Hot plate
Guantes
Hoja de trabajo.
4. PROCEDIMIENTO
Pre-lab
Para presentar el concepto de microarrays pueden visualizar los
siguientes enlaces:
www.bio.davison.edu/courses/genomics/chip/chip.html
www.gcat.davidson.edu/Pirelli/index.htm
www.bio.davidson.edu/GCAT
www.bio.davidson.edu/projects/GCAT/HSChips/Hschips.html
www.gslc.genetics.utah.edu/units/biotech/microarray/
www.hinsdale86.org/staff/kgabric/labsOnline/Microarrayer2.doc
www.bio.davidson.edu/projects/GCAT/HSChips/hs_kit_math_module_v2
.pdf
www.hhmi.org/biointeractive/genomics/genechipdata/index.htlm
1. Escriba en sequencia los pasos principales realizados en un
experimento de DNA microarrays.
2. Complete el cuadro:
DESCRIPCIÓN DEL GEN
COLOR DE LA CELDA O SPOT
(INDIQUE EL GEN/GENES))
El gen se expresó (transcribió) más
en células cancerígenas de pulmón
que en células normales de pulmón.
El gen se expresó igual en ambas
clases de células.
El gen no se expresó en ningun caso.
El gen se expresó (transcribió) más
en células normales de pulmón que
en células cancerígenas de pulmón.
1. PREPARACION DEL MICROARRAY
En este laboratorio los estudiantes realizarán una simulación similar
a la que llevan a cabo los genetistas. Obsérvese el proceso en la
imagen superior.
Para el experimento, prepare el portaobjetos de vidrio suministrado
para el DNA microarray, colocando una gota de la muestra, de cada
uno de los diferentes genes, en el lugar especificado. Los spots están
numerados con el número del gen.
2. HIBRIDACIÓN
Coloque, cuidadosamante, en cada celda o spot, una gota del Buffer de
hibridación. CUIDADO!!: EL BUFFER CONTIENE NaOH, una base
corrosiva, por lo que no deben tocar la solución con las manos. Deje
caer la gota del buffer sin poner en contacto, en ningún momento, la
punta dispensadora del bote del buffer con la solución de ADN.
A continuación, deje en reposo hasta que apareca un cambio de color.
3. VISUALIZACIÓN DE RESULTADOS
Para ello coloque su muestra sobre un papel blanco
4. TOME NOTA DE LOS RESULTADOS Y LIMPIE EL SOPORTE.
Limpie cuidadosamente el soporte de vidrio con un papel absorbente
siguiendo las indicaciones de su profesor.
5. A LA VISTA DE LOS RESULTADOS, RESPONDA A LAS
SIGUIENTES PREGUNTAS:
a) ¿Qué gen o genes se transcribieron en las células de cáncer
de pulmon?.¿Cúal es su conclusión?.
b) ¿Qué gen o genes no se expresaron en las células de cáncer
de pulmon? Explique la respuesta.
c) ¿Dónde no se expresaron los genes en ambos tipos de
células? Explique qué tipo de gen puede ser.
5. RESULTADOS EXPERIMENTALES ESPERADOS
Gen1(C4BPA)= rosa (gen inducido en células cancerosas).
Gen 2(ODC1) =púrpura (mezcla de rosa y azul; expresado igualmente
en células cancerosas y normales).
Gen 3 (FGG)= azul (gen no expresado en células cancerosas).
Gen 4(HBG1)= sin color (gen no expresado, ni en células normales ni en
células cancerígenas).
Gen 5(SIAT9)= rosa claro (gen ligeramente inducido en células
cancerígenas).
Gen 6(CYP24)= azul claro (gen ligeramente reprimido en células
cancerígenas).