Download el desafío de la determinación de la actividad de xilanasas

Artículo Técnico
Autor:
Tiago Tedeschi dos Santos - gerente técnico – Latam
Ana Paula Henrique - gerente técnico – Brasil
EL DESAFÍO DE LA DETERMINACIÓN
DE LA ACTIVIDAD DE XILANASAS
EN MUESTRAS DE ALIMENTO
L
a utilización de enzimas en la nutrición de aves y cerdos ha
pasado por un proceso de crecimiento exponencial en los
últimos años, de tal forma que hoy es una tecnología de rutina
en la producción de alimentos balanceados.
De esta manera, las enzimas exógenas son responsables de una parte
importante de los nutrientes presentes en las dietas, o mejor dicho,
del incremento del aprovechamiento de los mismos. Además, la
adición de enzimas a las dietas no significa que van a permanecer
sin alteraciones, porque el procesamiento de las dietas (por ejemplo,
la peletización, la expansión, etc.) y la presencia de otros aditivos
pueden influir sobre la actividad enzimática. Dicho lo anterior, la
determinación de la actividad enzimática en el alimento que se da a
los animales se ha convertido en un factor importante en el proceso
de garantía de la calidad del mismo, por lo que actualmente es de
rutina en el caso del monitoreo de la actividad de fitasa, pero menos
frecuente para otras enzimas como las xilanasas.
El presente informe técnico expone los factores y características
que dificultan la determinación de la actividad de las xilanasas en
alimentos balanceados, además presenta alternativas para incorporar
a la rutina de producción esa importante herramienta de garantía de
calidad en el proceso de producción de alimentos para aves y cerdos.
1. Metodologías estándar para la determinación de la actividad
de las xilanasas y sus limitaciones
Cuando analizamos enzimas en muestras de alimentos, un factor
importante a recordar es que no determinamos la cantidad adicionada
de la enzima, sino su actividad, es decir el efecto que esa enzima
ejerce sobre un sustrato. Lo que inicialmente puede parecer una
cuestión semántica, tiene un gran impacto sobre las metodologías,
ya que la actividad de una enzima puede variar de acuerdo con varios
factores tales como el pH de la solución, la temperatura y la cantidad
de sustrato y/o producto de reacción presente. Por eso, siempre se
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hacen las determinaciones de la actividad enzimática bajo condiciones
específicas de pH, temperatura y concentración de sustrato,
procurando trabajar cerca de las características óptimas de la actividad
de la enzima analizada. Por el mismo motivo, la determinación de
la actividad enzimática presenta un alto grado de variación en el
análisis, intra e interlaboratorios, pues es difícil estandarizar esas
condiciones de manera precisa, lo que puede afectar la actividad a
evaluar. Además de eso, debemos recordar que el producto de la
reacción enzimática varía gradualmente las condiciones de reacción
de la solución, lo que altera sus características. La determinación de
la actividad enzimática normalmente se puede hacer de tres formas
distintas:
- Desaparición o reducción del sustrato adicionado.
- Aparición del producto de la reacción mediada por la enzima.
- Cambio en las características de la solución ocasionados por la
desaparición del sustrato y/o aparición del producto de la reacción.
Comúnmente no se utiliza la determinación de la actividad enzimática
mediante la reducción de la cantidad de sustrato. Eso se debe a
que generalmente las soluciones diseñadas para la determinación
enzimática poseen una cantidad de sustrato extrapolada, lo cual
certifica que la cantidad de sustrato no limitará la reacción enzimática.
De esta forma, el volumen de sustrato hidrolizado por la enzima a
medirse es muy pequeño en proporción a la cantidad total de sustrato
en la solución, lo que dificulta el análisis de una manera precisa.
Se puede usar también la determinación mediante cambios de
características de la solución, como por ejemplo, en el análisis de
la actividad de carbohidrasas mediante la determinación de la
viscosidad o incluso en el análisis de la actividad de las fitasas a través
de la reducción de la turbidez de la solución, debido a la relación
entre fitato y proteína. Sin embargo, esas mediciones presentan
La tecnología de ELISA se ha usado de forma rutinaria en otras áreas
como la determinación de la concentración de micotoxinas en muestras de
alimento o la presencia de anticuerpos en muestras de sangre.
La metodología más comúnmente empleada en
el análisis de la actividad enzimática en muestras
de alimento consiste en la determinación
del producto de la reacción en solución. El
análisis de la fitasa mediante la medición del
fósforo libre en una solución de fitato o el
análisis de la proteasa a través de la medición
de péptidos y aminoácidos en una solución
proteica, son ejemplos de la utilización de este
tipo de metodología. En los temas que vienen
a continuación, veremos que el análisis de la
actividad de la xilanasa puede verse influido,
como por ejemplo, por la xilanasa comercial
adicionada a los alimentos balanceados,
interferencias causadas por los ingredientes
utilizados en los alimentos, entre otros.
2. Limitaciones en la determinación de
la actividad enzimática relacionadas a la
xilanasa adicionada al alimento
Puede haber limitaciones en la determinación
de la actividad de la xilanasa en muestras de
alimento debido a las características del análisis,
los ingredientes utilizados en los alimentos y de
la xilanasa comercial a analizarse.
a. Limitaciones del análisis
Según lo mencionado con anterioridad,
normalmente el análisis de la actividad
enzimática se hace por la determinación
del surgimiento del producto de la reacción
modulada por la enzima que se incubó con
el sustrato en condiciones específicas. En el
caso del análisis de la actividad de la xilanasa
en los alimentos y de otras carbohidrasas
tales como la glucanasa, mananasa, etc.,
nos encontramos con una dificultad, pues el
producto de la reacción enzimática, es decir los
azúcares libres se encuentran abundantemente
en los alimentos balanceados, constituidos
generalmente por cereales que son fuente de
almidón y azúcares, por lo que es casi imposible
la detección de una alteración sutil en la
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concentración de esos azúcares. La alternativa
normalmente usada en situaciones como
estas es la utilización de pastillas de sustratos
purificados (xilanos en el caso de xilanasa,
glucanos en el caso de glucanasa,...) asociados
a una sustancia colorida.
En este tipo de situación, la actividad de la
xilanasa, por ejemplo, hidroliza la fibra de
xilano, con lo que se libera la sustancia colorida
que deja la solución azulada, lo cual correlaciona
la actividad de la enzima a la intensidad de la
coloración obtenida. De cualquier forma, es
sumamente importante resaltar que el análisis
de la actividad de la xilanasa en muestras de
alimento se hace por una metodología diferente
de la que se usa para la determinación de la
actividad del producto comercial puro.
b. Limitaciones debido a las características
de los ingredientes
Los ingredientes de origen vegetal que
comúnmente utilizamos en las formulaciones de
alimentos para animales, producen cantidades
variables de xilanasa endógena. Dicha xilanasa
es responsable de la remodelación o crecimiento
celular, y en el caso de los granos, es responsable
de la degradación de la pared celular durante
el proceso de germinación. Además de eso,
algunos granos cuentan en su composición con
algunas proteínas responsables de inhibir la
acción de las xilanasas (lo que se va a analizar
en el siguiente tema).
Hay microorganismo como hongos y bacterias
que también pueden producir xilanasa
con el objetivo de obtener nutrientes para
su crecimiento. De esta manera, cuando
analizamos la actividad enzimática de la xilanasa
en una muestra de alimento, el resultado
obtenido no necesariamente corresponde solo
a la actividad de la enzima adicionada, sino a un
conjunto general de la actividad de la xilanasa
y su antagonista presente en dicha muestra
(xilanasa exógena adicionada + endógena de
los vegetales + microorganismos – inhibidores
de xilanasa).
Tanto las actividades de la xilanasa endógena
como de la microbiana interfieren en el análisis
de los resultados de la actividad de la xilanasa
obtenidos de las muestras de alimento,
principalmente al considerar que tanto la
actividad microbiana como la endógena se
obtienen por la presencia de moléculas de
xilanasa con baja gastro y termorresistencia. De
esta forma, al calcular la resistencia térmica de
una enzima xilanasa, por ejemplo, la misma se
puede penalizar por la baja termoestabilidad
de las enzimas endógenas y microbianas, ya
que estarán presentes en mayor concentración
en el alimento en harina, pero en menor
concentración en la peletizada. Por otro
lado, debido a la baja actividad in vivo de
dichas enzimas endógenas y microbianas, los
resultados del análisis cercano a lo esperado
pueden esconder en realidad actividades
enzimáticas bajas del producto adicionado.
Es importante resaltar que el impacto de los
inhibidores de xilanasa en la determinación de
la actividad de esta enzima de los productos
adicionados al alimento va a depender del
producto escogido. Las diferentes xilanasas
tendrán diferentes interferencias, de acuerdo
con la presencia de inhibidores. No todas las
xilanasas son iguales, como podemos observar
por la variación de actividad de las diferentes
enzimas en diferentes pH (figura 1).
Una alternativa para determinar la actividad de
xilanasa efectiva del producto adicionado es el
análisis de una muestra de alimento sin y otra
con la adición de la enzima comercial. De esa
Figura 1: Las xilanasas son diferentes en sus características
bioquímicas
actividad relativa (% actividad máxima)
algunas limitaciones de interpretación, ya que
el cambio de las características de la solución
no necesariamente tiene una relación linear
con la actividad enzimática y dichos cambios
pueden estar relacionados con la actividad de
más de una enzima presente en el alimento.
Entonces, los análisis que hacen uso de la
determinación de cambios de las características
de la solución pueden darnos una idea de la
actividad enzimática, pero no lo harán de la
manera más correcta y precisa.
100
80
60
40
20
0
3
3.5
Econase XT
4
4.5
Xilanase A
5
5.5
6
6.5
7
pH
Xilanase B Xilanase C Xilanase D
forma, se descuenta el valor de la actividad
presente en el alimento sin enzima del valor
obtenido en el alimento con adición de enzima,
para así calcular la actividad real de la enzima
adicionada. A pesar de ser una alternativa
posible, este procedimiento presenta algunas
limitaciones con la dificultad de recolección de
muestras sin adición de enzima en la rutina de
algunas plantas de alimento, el aumento del
volumen de muestras necesarias para acercarse
Como toda tecnología, la utilización de ELISA para la determinación de la
actividad de xilanasa tiene algunos puntos de control que se deben tener en
consideración.
xilanasa vayan a actuar/inhibir la cantidad extra
de enzima adicionada, para dejar la xilanasa
previamente adicionada al alimento “libre”
para mantener su actividad y analizarse de
forma adecuada.
El cálculo de la actividad de la muestra con
enzima se hace por la diferencia de actividad
en los alimentos con y sin adición de xilanasa.
Las limitaciones de ese procedimiento serían la
necesidad de obtener una muestra del mismo
alimento a analizarse sin adición de xilanasa
comercial y una muestra del mismo producto
que será analizado.
Además, es un procedimiento que genera un
cálculo extra, que trae consigo una acumulación
de errores en el proceso del análisis final, y da
incluso más inconsistencia y variabilidad para el
análisis.
3. Determinación de la actividad de xilanasa
en muestras de alimento mediante la
metodología ELISA
a los resultados y la inclusión de una variable de
error de más en el proceso.
Esto es porque el procedimiento anterior tiene
en consideración que la actividad endógena y
microbiana está distribuida uniformemente
en la mezcla del alimento, cuando en realidad
esta actividad es variable, en función de la
concentración de hongos en diferentes partes de
la mezcla y de la distribución del alimento, pues
la actividad de la xilanasa endógena presenta
mayor o menor concentración, dependiendo
de la porción del grano. Esta acumulación de
errores, aunque pequeños individualmente,
puede generar variaciones importantes en el
análisis final de los datos generados.
c. Limitaciones debido a las características
de la enzima a analizar
Una de las formas de protección de los cereales
contra el ataque de hongos y bacterias es la
producción de proteínas inhibidoras de xilanasa.
Dichas proteínas actúan como antagonistas
competitivos al bloquear el sitio de acción de
las xilanasas y al reducir la actividad de estas
enzimas, así protege la integridad celular
contra posibles ataques de hongos y bacterias.
La cantidad de estos inhibidores de xilanasa
dependerá del grado de maduración del cereal,
tipo de cereal y variedades del mismo cereal,
entre otros factores. Tales inhibidores actúan
no solo en las xilanasas microbianas, sino
también sobre las presentes en los productos
comerciales del mercado. Cabe mencionar que
hay una gran variación en el grado de inhibición
que pueden presentar las xilanasas comerciales.
Como ese es un mecanismo de defensa de los
cereales con la finalidad de inactivar el efecto
de la enzima, entonces podemos suponer que
eso podría afectar el efecto in vivo de la adición
de xilanasas en los alimentos. Sin embargo, en
la literatura existen trabajos que demuestran
que se trata solamente de un problema
análitico (que dificulta el análisis in vitro) y que
no afecta la eficiencia de la enzima y otros que
demuestran que realmente puede haber un
efecto negativo en enzimas.
La tecnología de ELISA se ha usado de forma
rutinaria en otras áreas como la determinación
de la concentración de micotoxinas en muestras
de alimento o la presencia de anticuerpos en
muestras de sangre, la cual puede ser una
alternativa también para la determinación de la
actividad de xilanasa en muestras de alimento.
En dicha alternativa, se utilizan anticuerpos
contra la molécula a analizarse (ya sean las
La verdad es que dichos productos sensibles a
los inhibidores de xilanasa sufrirán el impacto
de la presencia de los mismos y presentarán
actividades por debajo de las esperadas.
Para
superar
este
problema,
muchos
proveedores de xilanasas comerciales utilizan
un procedimiento denominado “spiking”. En
dicho procedimiento se utiliza una muestra
de alimento con y otra muestra sin adición de
enzima. Durante el proceso de extracción se
incluye junto con la solución extractora una
cantidad extra (y conocida) de enzima en la
solución. El objetivo es que los inhibidores de
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La adición de enzimas a las dietas no significa que van a permanecer sin
alteraciones, porque el procesamiento de las dietas y la presencia de otros
aditivos pueden influir sobre la actividad enzimática.
se correlaciona con la actividad de muestras
estandarizadas, se convierte en un análisis con
menos interferencia de las variaciones normales
de los procedimientos de análisis, y de esta
forma proporciona resultados mucho más
consistentes y con mayor repetibilidad.
Además, por ser un análisis más común en el
proceso de análisis de laboratorio, es mucho
más sencillo y con menos reactivos y equipos
que un análisis por vía húmeda estándar. Por
último, al no reaccionar positivamente con la
presencia de xilanasas endógenas, microbianas
y/o de otras enzimas adicionadas, los resultados
de actividad de xilanasa obtenidos son mucho
más consistentes en ser la actividad real de la
xilanasa objetivo, lo que mejora el proceso de
control de calidad, pues es esta actividad la que
tiene efecto sobre el desempeño animal y la
que efectivamente se debe monitorear.
micotoxinas y anticuerpos en los casos descritos
con anterioridad, así como para la molécula
proteica de la enzima xilanasa adicionada al
alimento para el caso de la utilización en la
determinación de la actividad de xilanasa),
los cuales se ligan a una molécula de prueba
y en un proceso específico se leen mediante
la inclusión de un agente reactivo de color.
Cuanto mayor sea la reacción de color, mayor
es la concentración del producto de prueba. Esa
reacción de color puede entonces compararse
con las concentraciones estándar de la misma
molécula de prueba, con lo que se calcula con
precisión la concentración de esa molécula en
la muestra analizada.
Como toda tecnología, la utilización de ELISA
para la determinación de la actividad de
xilanasa tiene algunos puntos de control que
se deben tener en consideración. En este caso
específico, el principal punto de control es el
desarrollo de anticuerpos monoclonales que
reaccionen solo contra la enzima xilanasa activa
que se adiciona al alimento. Los anticuerpos
monoclonales no van a reaccionar con posibles
productos de la competencia y/o hasta incluso
las xilanasas endógenas y/o microbianas
producidas por los cereales componentes de
los alimentos o por posibles contaminaciones
fúngicas, con lo que se garantiza la seguridad
del método. Es importante incluso analizar
si el anticuerpo desarrollado presenta
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reacciones de unión positiva contra la enzima
objetivo desnaturalizada. Por el hecho que los
procesos normales de producción de alimento
(como el desafío de la peletización) pueden
desnaturalizar la xilanasa, es importante que
el anticuerpo no reaccione con esa enzima
desnaturalizada, con lo cual se evitan resultados
falsos positivos, donde el análisis presenta una
reacción positiva, pero la enzima no tiene el
efecto deseado in vivo.
Ambos controles en el desarrollo de la
determinación por ELISA son posibles, ya sea
por la evaluación de muestras de alimento sin
adición de xilanasa o evaluación de alimentos
con otras xilanasas disponibles comercialmente
(cuando se espera que el análisis de ELISA
dé resultados negativos), o ya sea por la
determinación de la actividad de xilanasa en una
muestra de alimento con la xilanasa objetivo
que sea posteriormente desnaturalizada y
vuelta a analizar, donde los resultados antes
positivos deban tornarse menores o incluso
hasta negativos.
De tomarse las precauciones anteriores, la
determinación de la actividad de xilanasa vía
ELISA presenta ventajas, incluso en comparación
con análisis estándar de determinación de
actividad de xilanasa por vía húmeda. En primer
lugar, como el análisis de ELISA determina la
cantidad de enzima presente en la muestra que
A nivel productivo, una alternativa más sencilla
y fácil para el monitoreo de la presencia de
actividad de xilanasa en muestras de alimento,
sería la utilización de metodologías cualitativas
de la presencia de la enzima objetivo en
muestras de alimento.
Esa alternativa se utiliza también de la
metodología ELISA para la determinación de
la presencia de la enzima en el alimento, pero
como el objetivo no es cuantificar la presencia
de la enzima, acaba siendo un método mucho
más sencillo y práctico para utilizarse en la
rutina de análisis de plantas de alimentos
balanceados o integraciones.
En esta opción, se mezclan muestras de
alimento recolectadas donde se estime que
haya la presencia de la enzima con agua para
la extracción y solubilización de la enzima, y a
continuación dicha solución extraída se pone en
contacto con tiras que contengan el anticuerpo
para la enzima en cuestión. Al estar presente
la enzima en la solución, se da la reacción con
el anticuerpo y aparece una línea oscura, lo
que comprueba la presencia de la enzima en
la muestra de alimento. El beneficio de una
prueba como esta es que es muy sencilla y
práctica, y se puede utilizar incluso en galpones
o casetas de producción con respuestas en
menos de 5 minutos.
Para mayor información, contactarse con el
Ing. Fernando Cazorla (Director Técnico de
Nutrición de Globalvet) al teléfono: 998177945
o al correo: [email protected]