Download GUIA 7 Cinética y reactores enzimáticos

GUIA 7
Cinética y reactores enzimáticos
7.1.- Un pesticida inhibe la actividad de una mezcla “alfa”, que luego deberá ser utilizada para la detección de
este pesticida. A partir de los valores consignados en la tabla adjunta, determinar:
V (mL/L·min) · 10-6
S (mol/L)
3.3 · 10-4
5.0 · 10-4
6.7 · 10-4
16.5 · 10-4
22.1 · 10-4
Sin inhibidor
56
71
88
129
149
10-5 M inhibidor
37
47
61
103
125
a) Parámetros cinéticos
b) Expresión de la cinética de inhibición correspondiente a partir del equilibrio cinético
c) 50 mL de la misma solución enzimática de la parte (a) se mezcla con 50 mL de una solución 8 · 10-4 M de
sustrato y 25 mL de muestra problema (con pesticida), observándose una velocidad inicial de 43 µmol/min.
Calcular la concentración de inhibidor en la muestra problema, asumiendo que en ella no existe cantidad
alguna de sustrato.
7.2.- Un reactor batch de tanque agitado, esta produciendo Magneso peroxidasa a través del cultivo de
Trametes versicolor, cuando se introduce a la corriente de alimentación un inhibidor que actúa
competitivamente con el sustrato. Determine el tiempo necesario para convertir una concentración inicial de
So a S de sustrato. Deje la expresión en función de los parámetros cinéticos (Km, Ki, Vm), concentración de
células, So y S.
7.3.- En relación con cinética enzimática, responda las siguientes preguntas:
a) Explique cuáles son las diferencias que presenta una gráfica 1/v vs 1/S de una inhibición no competitiva
frente a una inhibición competitiva por sustrato.
b) ¿Qué pasa con los valores de KM y Vmáx en cada caso?
c) Diseñe un experimento para mostrar en forma comparativa, cuándo la enzima es inhibida en forma
competitiva y cuando es no competitiva.
7.4.- Se conoce parcialmente la reacción de inhibición de la hidrólisis de la urea por ureasa. Los datos de la
hidrólisis de la reacción se dan a continuación para dos concentraciones de sustrato.
a) Determine la constante de Michaelis-Menten para esta reacción.
b) ¿Qué tipo de inhibición tiene esta reacción? Fundamente
su respuesta.
c) Basada en la respuesta de la parte b, ¿Cuál es el valor de Ki?.
S1 = 0.2 M
1/v
I
0.22
0
0.33 0.0012
0.51 0.0027
0.76 0.0044
0.88 0.0061
1.10 0.0080
1.15 0.0093
S2 = 0.02M
1/v
I
0.68
0
1.02 0.0013
1.50 0.0022
1.83 0.0032
2.04 0.0037
2.72 0.0044
3.46 0.0057
Diseño de Bioreactores
7.5.- Los siguientes datos fueron obtenidos para dos concentraciones iniciales de enzima para una reacción
catalizada por esta enzima:
[ S ] (g/L)
20.0
10.0
6.7
5.0
4.0
3.3
2.9
2.5
a) Encontrar Km
V (g/L min) [E0] = 0.015 g/L
1.14
0.87
0.70
0.59
0.50
0.44
0.39
0.35
V (g/L min) [E0] = 0.00875 g/L
0.67
0.51
0.41
0.34
0.29
b) Encontrar Vm para [E0] = 0.015 g/L
c) Encontrar Vm para [E0] = 0.00875 g/L
d) Encontrar K2 (referida a reacción limitante)
7.6.- En el estudio de la cinética de la acción de una enzima que está sujeta a inhibición se han obtenido los
siguientes datos experimentales.
S (mmol)
0.001
0.0012
0.0014
0.0016
0.0018
V (I = 0.1)
0.00141
0.00165
0.00182
0.00195
0.00206
V (I = 0.5)
0.000994
0.001097
0.001232
0.001237
0.001276
V (I = 0)
0.002018
0.002369
0.002724
0.003177
0.003536
I = mmol V = mmol/h
a) Determine los parámetros cinéticos para cada una de las reacciones
b) ¿Qué tipo de inhibición es la que presenta el inhibidor sobre la enzima? Justifique.
7.7.- Un carbohidrato A se descompone en presencia de enzima E. Se sospecha que el carbohidrato B,
también presente en la mezcla, tiene algún efecto en esta descomposición. Para estudiar este fenómeno se
realizaron experimentos con diferentes composiciones de A y B y flujo a través de un reactor perfectamente
agitado (continuo operado en regimen estacionario) de volumen 240 cm3.
a) A partir de los datos mostrados en la tabla, encuentre la ecuación de la velocidad de reacción de
descomposición de A
b) Qué puede señalar respecto al papel de B en la descomposición
S0 (mol/m3)
500
300
200
600
400
70
Departamento de Ingeniería Química
Noviembre, 2005
A (mol/m3)
400
100
20
400
100
20
B (mol/m3)
0
0
0
200
200
200
2
F (cm3/min)
480
120
36
144
60
120
E0 (mol/m3)
20
20
20
20
20
20
IIQ-461
Diseño de Bioreactores
Diseño de Bioreactores
7.8.- Durante la purificación de una proteína (A) se encuentra que la acción enzimática es inhibida por un
compuesto (B). A partir de la siguiente información encuentre el tipo de inhibición y todos sus parámetos.
S
Velocidad de consumo de la proteína (µmol / L min )
V (sin inhibidor)
V ( I = 2.5 µmol/L )
0.400
0.625
0.333
0.910
0.500
1.330
0.625
Concentración de proteína (µmol/L)
0.5
1.0
2.0
4.0
7.9.- Usted está trabajando con una enzima sujeta a inhibición por sustrato. Los parámetros cinéticos son:
Vm = 1 min-1
Km = 2 mmol
KSI = 0.1 mmol
¿Cuál será el tiempo de residencia que necesitaría usar en un reactor de tanque agitado para obtener una
conversión del 50%, si la concentración de sustrato en la alimentación es de 100 mmol?
7.10.- La cinética de conversión de lactosa por β-galactosidasa se puede asumir sigue la cinética de
Michaelis-Menten, con parámetros K2 = 0.6 (mmol/mg ε min) y Km = 0.5 mM. Si la concentración de lactosa en
la alimentación es de 10 mM, calcule:
a) El tiempo de reacción en operación batch en un reactor perfectamente agitado si se necesita una
conversión del 95% de lactosa para una concentración de enzima de 75 mg/mL.
b) El tiempo de residencia en un reactor continuo para el mismo grado de conversión con las mismas
concentraciones de enzima y lactosa.
7.11.- Para la determinación de Vmax y de Km por inspección, no es necesario recurrir a métodos gráficos muy
sofisticados. Dichos valores pueden determinarse rápidamente a partir de las velocidades de reacción con
concentraciones de sustrato crecientes. Empleando las definiciones de Vmax y de Km, calcular el valor
aproximado de los parámetros antes mencionados de la reacción catalizada por una enzima a partir de la cual
se obtuvieron los siguientes datos:
[S] (M)
V (mol/L min)
2.5 x 10-6
28
4 x 10-6
40
1 x 10-5
70
2 x 10-5
95
4 x 10-5
112
1 x 10-4
128
2 x 10-3
139
1 x 10-2
140
7.12.- En un experimento de laboratorio dos estudiantes aislaron independientemente la anzima lactato
deshidrogenasa de corazón de pollo, que cataliza la reducción de piruvato a lactato. La enzima se obtuvo en
forma de disolución concentrada. Los estudiantes midieron después la actividad de sus propias disoluciones
enzimáticas en función de la concentración de sustrato en condiciones idénticas y determinaron de este modo
la Vmax y la Km de sus preparaciones. Cuando compararon sus resultados observaron que sus valores de Km
eran idénticos pero sus valores de Vmax eran radicalmente diferentes. Uno de los estudiantes argumentaba
que los diferentes valores de Vmax confirmaban que habían aislado diferentes formas de la enzima. El otro
estudiante razonaba que a pesar de la diferencia de los valores de Vmax habían aislado la misma forma de la
enzima. ¿Cuál de los estudiantes formulaba la afirmación correcta?, explicar. ¿Cómo podrían resolver la
discrepancia? Explicar.
7.13.- De acuerdo a la relación de la velocidad de reacción y la concentración de sustrato, según la ecuación
de Michaelis-Menten, determinar:
a) ¿A qué concentración de sustrato mostrará una enzima la cuarta parte de su velocidad máxima, si el
máximo de velocidad en la transformación del sustrato es de 30 µmol/min mg y Km = 0.005 M?
b) Determinar la fracción de Vmax que se encontraría a una concentración de sustrato de ½ Km, 2Km y 10Km
Departamento de Ingeniería Química
Noviembre, 2005
3
IIQ-461
Diseño de Bioreactores
Diseño de Bioreactores
7.14.- Una enzima fue analizada a una concentración de sustrato inicial de 10-5 M, el valor de Km del sustrato
es de 2x10-3. Al cabo de 1 min el 2% del sustrato ha sido convertido en producto.
a) ¿Qué concentración de sustrato ha sido convertido en producto al cabo de 3 min y cuál es la
concentración de producto?
b) ¿Cuál es la velocidad máxima posible?
c) Alrededor de qué concentración de sustrato se obtiene Vm?
d) A esta concentración, ¿Qué porcentaje de sustrato es convertido en producto al cabo de 3 minutos?
7.15.- Determinar en forma directa y de acuerdo a los datos que se entregan a continuación si la reacción
(SÆ P) presenta inhibición competitiva o no competitiva (la concentración del inhibidor de la reacción inhibida
es de 0.01 mM). Argumente su respuesta. Determine las constantes cinéticas para ambos casos.
S (mM)
v (mM/min) s/I
v (mM/min) c/I
0.04
5.97
4.73
0.05
6.47
5.27
0.06
6.85
5.71
0.07
7.15
6.06
0.10
7.76
6.83
0.15
8.31
7.58
0.50
9.24
8.95
0.80
9.41
9.22
5.00
9.65
9.62
10
9.67
9.66
40
9.69
9.69
80
9.7
9.7
100
9.7
9.7
200
9.7
9.7
7.16.- Un microorganismo tiene una enzima que hidroliza glucosa 6 fosfato (G6P). El seguimiento de la
reacción está basada en el seguimiento de la formación de glucosa. La enzima libre de entrada se caracteriza
por tener un Km= 6.7x10-4 M y una Vm= 300 mmoles/L min. Se produce una inhibición de tipo competitiva
debido a la adición de galactosa 6 fosfato. Para una concentración de 10-5 de galactosa 6 fosfato y de 2x10-5
M de G6P, la velocidad de reacción es 1.5 mmoles/L min. Calcular KI para la G6P.
7.17.- Una enzima tiene una constante de saturación Km = 4.7x18-5 M, la velocidad máxima de la preparación
es 22 µmol/L min. ¿Qué velocidad observará en presencia de una concentración de sustrato de 2x10-4 M y de
un inhibidor a concentración de 5x10-4 M en los casos de:
a) Inhibición competitiva
b) Inhibición no competitiva
c) Grado de inhibición en cada uno de los casos
7.18.- Un extracto de levadura conteniendo lactasa ( lactosa
glucosa + galactosa ) tiene condiciones
óptimas de actividad de 45°C y pH 6.4. Una forma de determinar la actividad del extracto es por medio del
método del ortonitrofenolgalactósido (ONPG), el cual consiste en agregar 1.5 mL de extracto diluido, 2.7 mL
de tampón fosfato y 0.1 mL de solución de mercaptoetanol. Se incuba por 3 minutos a 40°C, luego de lo cual
se le adiciona 0.1 mL de solución sustrato ONPG 0.068M incubando a diferentes tiempos. La reacción se
detiene sumergiendo los tubos en un baño de agua a ebullición por 5 minutos. Luego, se lee la densidad
óptica a 410 nm . El coeficiente de extinción ∈ es de 0.2 , y l=1 dm.
La reacción catalizada es la siguiente :
ONPG
lactasa
ONP + Galactósido
amarillo, se mide a 420 nm
Los resultados de D.O. [g/L*min] son los siguientes :
(b) blanco realizado sólo con sustrato y 4.2 mL de tampón
t (min)
4
8
12
16 (b)
1:10
0.235
0.348
0.399
0.005
1:15
0.120
0.1314
0.143
0.005
Determinar la actividad del extracto, si se tiene que 1 UI = cantidad de enzima que libera 1 µmol de ONP en
1 minuto.
4
IIQ-461
Departamento de Ingeniería Química
Noviembre, 2005
Diseño de Bioreactores
Diseño de Bioreactores
7.19.- Se diseña un método para determinar la actividad de una enzima. Para ésto se incuban 0.6 mL de
muestra con 0.6 mL de celobiosa, deteniendo la reacción con 0.2 mL de Na2CO3.
Se sabe que la rección es
E3
celobiosa
2 glucosa
La muestra se obtiene al diluir 1 mL de caldo en 13 mL de H2O.
En mediciones de absorbancia :
ε = 0.22
l = 1 cm de celda
t
1:5
1:10
1:15
A=L*ε*C
0
5 0.2655 0.165 0.1163 C [g/L]
10
0.57
0.3375 0.2325 t [min]
15
0.69
0.48
0.345 [UI] = µmoles de S / seg
20
0.78
0.585 0.4695
25 0.825
0.675
0.57
7.20.- Para determinar la actividad de β-glucosidasa producida por fermentación de Kluyveromyces fragilis la
célula se homogeniza extrayendo con esto la enzima. Las mediciones se realizan con 50 mg de células
homogenizadas, las cuales son diluidas, a pH y T° óptimos, según: a) 150 mL de tampón, b) 70 mL de
tampón, c) 250 mL de tampón.
Se mezclan 5 mL de solución de lactosa 50 g/L en tampón pH 6.5 y 1 mL de solución de levadura
permeabilizada según (a), (b) y (c). Los resultados, luego de 5 y 10 minutos, son los siguientes:
t (min)
a
b
c
5 (b1)
0.002 0.005 0.001
5
1.2245 1.781 0.441
10
1.85
3.061 0.781
10 (b2) 0.0225 0.036 0.01
Determinar el rango lineal y la actividad del homogenizado
7.21.- La enzima fructofuranosidasa (invertasa) seca de Sigma Chemical Company, extraída de levadura de
panificación, tiene condiciones óptimas analíticas de 55°C y pH 4.5. Para la determinación de la actividad
enzimática, se preparó una solución de 500 ppm del preparado enzimático comercial, el cual se utilizó como
solución stock.
Las muestras enzimáticas (diluidas convenientemente con tampón acetato 0.05M) fueron analizadas
incubando 1 mL de muestra enzimática diluida por un lapso de tiempo en 4 mL de solución de sacarosa 50
g/L. Luego de ese tiempo, la enzima es inactivada con 0.1 mL de NaOH 10N, con lo cual la solución
enzimática alcanza un valor de pH cercano a 11. La concentración de glucosa es determinada mediante el
método de Folin-Wu, leyendo absorbancia a 420 nm.
La curva de calibrado para glucosa indica que: D.O. = 1.38 *C
donde D.O. = Absorbancia a 420 nm
C = [g/L] de glucosa
La sacarosa, que viene en polvo, tiene una pureza de un 98% y contiene un 1 % de glucosa.
De acuerdo al procedimiento descrito, los resultados fueron los siguientes:
Muestra enzimática (D.O.)
tiempo de incubación (min) 1 : 62.5
5
2.6220
10
3.4776
15
3.7260
15 *
0.3864
* Para t = 15 min, es 1 mL de enzima diluída en 4 mL de tampón.
1 : 125
1.6560
2.4288
2.7876
0.1932
Determinar las UI del extracto enzimático seco. Indicar cualquier suposición hecha.
Departamento de Ingeniería Química
Noviembre, 2005
5
IIQ-461
Diseño de Bioreactores
Diseño de Bioreactores
7.22.- La enzima glutamato deshidrogenasa cataliza la siguiente reacción:
glutamato
+
NAD +
←→ P
+
NADH
+
H+
Los siguientes valores experimentales fueron obtenidos en presencia y ausencia del inhibidor salicilato de
sodio:
S (mM)
1.5
2.0
3.0
4.0
8.0
16
I=0
0.21
0.25
0.3
0.33
0.43
0.4
I = 40 mM
0.08
0.09
0.12
0.13
0.16
0.18
Calcular los valores de Km y KI e interpretar los resultados.
7.23.- Se tiene una mezcla de 2 enzimas: E1 y E2, que reaccionan con A para dar un producto B. Obtener la
expresión cinética para la reacción que da origen a B.
7.24.- Defina el concepto de actividad enzimática y refiérase a la unidad que se utiliza para estandarizar su
medición. Comente las razones por las cuales debe ser medida a tiempos iniciales de reacción y los factores
que afectan su cuantificación.
7.25.- Para el siguiente set de datos:
S (mM)
0.04
0.05
0.06
0.07
0.10
0.15
0.50
0.80
5.00
10
40
80
100
200
Sin inhibidor
V (mM/min)
5.97
6.47
6.85
7.15
7.76
8.31
9.24
9.41
9.65
9.67
9.69
9.7
9.7
9.7
Con inhibidor ([I] = 0.02 mM)
V (mM/min)
4.04
4.26
4.43
4.55
4.79
4.99
5.31
5.37
5.45
5.45
5.46
5.46
5.46
5.46
Identificar el mecanismo de inhibición que
presenta
la
reacción,
argumentando
adecuadamente su respuesta. Determine las
constantes cinéticas para ambos casos y la
constante de inhibición.
7.26.- El Viejo Pascuero ha descubierto una nueva enzima que, por razones propias, denominó “pascualasa”.
La pascualasa permite convertir la renosa (complejo azúcar de la leche de reno) en un azúcar fermentable.
Lamentablemente, esta curiosa enzima sufre de inhibición por sustrato (KSI =0,05 mM). Si la concentración
inicial de renosa es de 10 mM, con parámetros k2=0,6 mmol/(mg min) y KM=0,5 mM. Determine:
a. El tiempo de reacción en operación batch en un reactor perfectamente agitado si se necesita
convertir el 80% de la renosa presente, para una concentración de pascualasa de 30 mg/mL
b. El tiempo de residencia en un reactor continuo operando en estado estacionario para obtener el
mismo grado de conversión con las mismas concentraciones de enzima en el medio y lactosa en la
alimentación.
Departamento de Ingeniería Química
Noviembre, 2005
6
IIQ-461
Diseño de Bioreactores
Diseño de Bioreactores
7.27.- En una reacción enzimática con dos sustratos, deducir la ecuación cinética correspondiente a un
mecanismo aleatorio de formación de complejo ternario. Suponga además que el compuesto C, presente en
el medio, inhibe competitivamente (inhibidor competitivo total) a la enzima.
7.28.- Desarrolle la expresión cinética para la inhibición por sustrato (el sustrato forma un complejo reversible
inactivo con el complejo ES). Derive además una expresión que permita determinar el tiempo de residencia en
un reactor de tanque agitado para lograr una conversión de sustrato del 50%.
7.29.- El Viejo Pascuero descubrió otra enzima, que llamó “navidasa”. La navidasa permite convertir la renosa
(complejo azúcar de la leche de reno) en un azúcar fermentable, pero se inhibe competitivamente con un
compuesto presente (1mM, KI = 0,1 mM) en esta leche. Si la concentración inicial de renosa es de 10 mM,
con parámetros k2=0,6 mmol/(mg min) y KM=0,5 mM. Determine:
c.
El tiempo de reacción en operación batch en un reactor perfectamente agitado si se necesita una
conversión del 90% de la renosa, para una concentración de navidasa de 80 mg/mL
d. El tiempo de residencia en un reactor continuo operando en estado estacionario para obtener el
mismo grado de conversión con las mismas concentraciones de enzima y lactosa.
7.30.- La cinética de conversión de lactosa por β-galactosidasa se puede asumir sigue la cinética de
Michaelis-Menten, con parámetros k2=0.6 (mmol/mg enz x min) y KM=0.5 mM. La concentración de lactosa en
la alimentación es de 10 mM. El compuesto B, presente en el preparado en una concentración de 1 mM, es
un inhibidor no competitivo (total). KI = 0.05 mM
a. Determinar el tiempo de reacción en operación batch en un reactor perfectamente agitado si se necesita
una conversión del 85% de la lactosa para una concentración de enzima de 75 mg/ml.
b. Determinar el tiempo de residencia en un reactor continuo para igual grado de conversión con las
mismas concentraciones iniciales de enzima y lactosa.
Departamento de Ingeniería Química
Noviembre, 2005
7
IIQ-461
Diseño de Bioreactores