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Corporación Centro de Investigación en Palma de Aceite· Cenipalma ISSN -0123-8353
Notas d8llil'8t:lor
•
•
Con mucha frecuencia, en el pro·
ceso de investigación se reqUiere
hacer trabajos previos a los expe·
rimentos formales. Estos permiten
la estandarización de metodo·
logias para asegurar la validez de
los resultados obtenidos y garan·
tizar la rigurosidad científica.
Precisamente este es el caso de
la investigación que realiza
Cenipalma en la identificación del
agente causal de la marchitez le·
tal. En este estudio se están pro·
bando metodologías poco conven·
cionales que consisten en la apli·
cación de antibiótícos con el obje·
tivo de observar remisión de sín·
tomas. Sin embargo, no se canta·
ba con un sistema que permitiera
evaluar la efectividad de las apli·
caciones.
En este Ceniavances se presenta
un desarrollo metodológico que
permitirá seguir el comportamien·
to de los productos aplicados den·
tro de las palmas, De esta mane,
ra se podrán certificar los resul·
tados obtenidos en los experimen·
tos que buscan determinar la etio,
logía de esta enfermedad,
•
PEDRD LEÓN GÓMEZ CUERVD
Director Ejecutivo
Estandarización de una técnica de antibiograma
para la detección de
antibióticos en tejidos de palma de aceite"
En cuanto al agente causal de la enfermedad, actualmente se trabaja en las hipótesis
de hongos. bacterias y fitoplasmas (Aire de,
2002; Lozano, 2003; Green, 2003), En este
trabajo se presenta un proceso metodológico
que permite sustentar los experimentos que
se realizan para probar la hipótesis de los
fitoplasmas_
Los fitoplasmas son bacterias sin pared celular, que viven exclusivamente en los teji·
dos floemáticos de las plantas y el sistema
digestivo de algunos insectos; razón por la
cual no pueden ser aislados en medios de
cultivo mediante técnicas convencionales, Su
diagnóstico entonces se realiza mediante métodos moleculares, serológicos o aplicacio·
nes de antibióticos a las plantas
presumiblemente afectadas_
Inlroducciór¡
La aplicación de antibióticos como técnica de
diagnóstico indirecto de fitoplasmas es mundialmente aceptada por los especialistas de
La marchitez letal de la palma de enfermedades en plantas y ha sido usada desaceite (MU es una enfermedad pre- de que estos microorganismos fueron recosente en plantaciones de la Zona nocidos como fitopatógenos, Se fundamenOriental. Los síntomas hasta aho· ta en que las plantas enfermas que reciben
ra conocidos son: clorosis de ho- la aplicación muestran una recuperación tranjas superiores, secamiento progre- sitoria y los síntomas tienden a desaparecer,
sivo de hojas bajeras eintermedias, fenómeno conocido como "remisión de sínpudrición de frutos y raíces y, finatmente, la tomas"_ Cabe anotar que la remisión de sín·
muerte de la planta en un período entre tres y tomas es temporal y en el momento que se
cinco meses después de la aparición de los pri- deja de aplicar el antibiótico la planta afecmeros síntomas visibles ¡Acosta el al., 2001; tada recae, por lo que no se considera un
Calvache el al., 2004), Estudios epidemiológicos método de control sino simplemente de diagmostraron que se trata de una enfermedad de nóstico,
carácter infeccioso causada probablemente por
un microorganismo del suelo o un patógeno de Al reconocer la naturaleza biótica de este
diseminación aérea a corta distancia (Torres y trastorno, Cenipalma ha desarrollado varios
Tovar, 2004).
experimentos para determinar el agente cau
" Diego Fernando GutilÍrrez Galeana, Investigador auxiliar, Cenipalma. Programa de Sanidad Vegetal.
Juan Pablo TO'o'ar Molano, Investigador Asistente, Cempalma Programa de Sanidad Vegetal [email protected]
Marta Lya Hernández, Ingelliera Agrónoma, Palmas del Casanare [email protected]
José Ramírez, Ingeniero Agrónomo, Palmar de Oriente
teniaV31ces
sal de la ML, uno de los cuales consiste en la aplicación del antibiótico Oxitetraciclina IOTC) a palmas enfermas con el objetivo
de observar si se presenta remisión de síntomas. En caso de que
los resultadas sean positivos se tendría una prueba contundente
de que un fitoplasma es el agente causal del disturbio. Sin embar·
go, la aplicación de un producto por sí sola na implica que éste
sea tomado y traslocado, por lo que se requería una técnica que
permitiera comprobar la efectividad de las aplicaciones evidenciando la presencia y permanencia de los antibióticas en diferentes órganos de la palma. En consecuencia se desarrolló una meto·
dología para detección de antibióticas, que consiste en una modificación del método de Antibiograma de Kirby-Bauer recomendado para la determinación de la sensibilidad bacteriana ante los
antimicrobianos. Esta metodología es ampliamente utilizada en el
área clínica humana en la selección adecuada de antibióticos para
el tratamiento de enfermedades infecciosas (Bauer et al., 1966).
3) Selección de bacteria sensible
Para el desarrollo de la técnica fue necesario seleccionar una bacteria sensible a los antibióticos que se evaluarían, de crecimiento
profuso y uniforme a las 24 horas de incubación en Agar Mueller·
Hinton, med io de cultivo indicado por la NCClS que permite la
libre difusión de los antibióticos.
•
Se evaluaron seis aislamientos bacterianos, tres de ellos identificados como Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y
Staphylococcus aureus y otras tres bacterias sin identificar aisladas a partir de suelo. Estas bacterias fueron colocadas a crecer
en una caja de Pe tri, en la que se colocaron discos de papel filtro
impregnado con cada uno de los antibióticos IFig. 1).
•
Metodología
El trabajo se desarrolló en las plantaciones Palmas del Casanare
VPalmar del Oriente ubicadas en el municipio de Villanueva
(Casanare)_
Fases de desarrollo de la técnica:
1) Antibiograma Tejido·placa
El antibiograma es uno de los métodos que el "National Committe
for Clinicallaboratory Standars" (NCClS) recomienda para deter·
minar la sensibilidad de un microorganismo a diferentes antibióticas,
Vconsiste en depositar en la superficie de agar de una caja de Petri
previamente inoculada con el microorganismo a evaluar, discos de
papel filtro impregnados con los diferentes antibióticos. El filtro
absorbe agua del agar Vel antibiótico difunde radialmente forman·
do una zona de inhibición que se relaciona con la actividad
antimicrobiana IFig. 1). La técnica aquí desarrollada es una modifica·
ción de la técnica empleada en microbiología clínica y consiste básicamente en reemplazar los discos de antibiótico por tejido vegetal.
2) Antibióticos empleados
Se realizaron aplicaciones de los siguientes antibióticos:
• Oxitetraciclina (OTe): antibiótico bacteriostático can acción
sobre fitoplasmas y algunas bacterias de pared celular. Es utiliza·
do ampliamente en la prevención de la enfermedad amarillamiento
letal del cocotero, causada por fitoplasmas.
• Oxitetraciclina+Gentamicina (OTC+GEN): La Gentamicina
es un antibiótico de mediana espectro y actúa en forma sinérgica
con la Oxitetraciclina.
2
Figura 1. AlltihlO1jrama em~leado. en Microlliologla clínica
Una vez seleccionada la bacteria sensible a los antibióticos, ésta
se utilizó para evaluar la presencia de halos de inhibición cuando
se colocaban trolOS de tejidos de palma dentro de las cajas de
Petr;,
4) Oetección de antibióticos en plantas de villero
Plantas de vivero de diez meses de edad fueron aplicadas con
Oxitetraciclina con el fin de determinar la funcionalidad de la técnica. Se realizaron tres repeticiones por tratamiento nabla 1).
•
Tabla 1. ApficitCión de antibióticos en plantas de vj~ero
• g La gramos de ingrediente activa
01
Absorción radical
2
02
Absorción radical
3
0 .4
Absorción radical
4
06
Absorción radical
5
08
Absorción radcal
Absorción radical
6
7
Testigo
0.03
Inyección <11 bulbO
O
Absorción radical
•
110. 1111
•
ll~ullrD
211114
Se evaluó la presencia de antibiótico por la técnica del
antibiograma cinco días después de la aplicación; los tejidos ana·
liza dos fueron trozos de lámina foliar y nervadura de follolos de
las hojas 2 y 5.
5) Detección de antibióticos en palmas adultas
Se seleccionaron palmas enfermas con síntomas iniciales de mar·
chitez letal a las cuales se les realizó aplicación de antibióticos por
inyección al estípite. Se realizó una primera aplicación de 3 g La. de
Oxitetraciclina y Oxitetraciclina + Gentamicina. Dos meses después
se realizó una segunda aplicación a las mismas plantas con 9 g La.
de Oxitetraciclina y 6 g i.a. de Oxitetraciclina+ Gentamicina (Tabla
2) Detección de los antibióticos en plantas de vivero
Todos los tratamientos aplicados por absorciÓn radical presentaron
antibióticos en los tejidos evaluados. En el tratamiento siete no se
detectó antibiótico, probablemente por la baja dosis aplicada debido
a la limitada capacidad de absorción del antibiótico por el método de
inyección. En la Figura 2 se observan las zonas de inhibición alrede·
dar de los tejidos Que indican la presencia del antibiótico.
'1a105 de
inhibición
2).
Tratarriento la aplcaclón la apk:idin #de Pamas
•
OTe
OTCtGEN
3g I.a
3 g La
Agua
12 mi
9 9 La
6Qí.a
14
14
10
Tabla 2. Aplicación de anlibilÍticus en palmas con !rnlrchilez !et~J
Para determinar la presencia de antibióticos, se emplearon tro·
zas de tejidos de raíces primarias, lámina foliar y nervadura de
follolos de las hojas 9 y 17 de ocho palmas por cada tratamiento.
las evaluaciones se realizaron a los 7, 15, 22 Y49 días después
de las aplicaciones.
Figura 2. Resultado de antlbiograma en plantas de vivero
3) Detección de antibióticos en palmas adultas
los resultados obtenidos para la primera aplicación fueron negativos (Fig. 3 A). Sin embargo, la efectividad de la técnica en plan·
tas de vivero indicaba que estos resultados fueron consecuencia
de una baja dosis de ingrediente activo, razón por la cual se realizó una segunda aplicación inyectando 6 g La de OTe + GENT Y9
g i.a. de OTe a las mismas palmas.
los resultados de la segunda aplicación demuestran claramente
la presencia de los antibióticos en los diferentes tejidos evalua·
dos (Fig. 3 B).
Resultados y discusión
•
1i Selección de bacteria sensible
De las seis bacterias evaluadas, Staphylococcas aareas fue la
más sensible a los antibióticos Oxitetraciclina y Gentamicina, lo
cual se evidenció por la presencia de los mayores halos de inhibi·
ción para los dos antibióticos ¡Tabla 31.
B
Figura 3 Resultado de antibíograma efl Palmas adultas. Al primera aplicación BI segunda a~lica
Bacteraa
Olametro del halo
Inhlblclon (mm)
----'-
-OTe
Staphy/occus dureus
Escheri::hia coi
.~tJdo/rD'Pa5 .a1!'/U{I~"'O!t.J
BacterB A
Bacteria B
•
8ac~ria
e
rabia 3 In1erpretaciófl de los halas de mhiblción
c¡lm, las flechas indican la presencia de antibiótico
N\leJ
GEN
30
Sensible
20
H
14
23
16
20
Sensible
Sensble
Intermedia
Sensible
Sensble
Sensible
12
ReS$tente
SehSJbJe
14
Intermedia
Intetmedia
10
Resstente
22
16
En las figuras 4 y 5 se observa la dinámica de los antibióticos en
cada una de las evaluaciones (13, 22, 29 y 49 días después de la
segunda aplicación); cada linea corresponde a la presencia del
antibiótico en un tejido a través del tiempo.
Trece días después de la aplicación, el 50% de las plantas inyecta·
das con Oxitetracidina lOTe) presentaron antibiótico en la nerva·
dura de la hoja 9, mientras Que el 20% en lámina foliar de la hoja 9
y nervadura de la hoja 17. Veintidós días después de la aplicación la
presencia del antibiótico se incrementó en todos los tejidos, siendo
máxima en las nervaduras de las hojas 9 y 17. Después de 29 días
la detección del antibiótico se redujo y luego de 49
3
Ceoiavanc8s
días no se detectó en ninguno de los tejidos (Fig. 41. La localiza·
ción del antimicrobiano en raíz fue muy bajo.
OxftetraclcUna
.
.
El uso adecuado de esta metodología permite estimar las dosis
correctas de antibiótico y el tiempo oportuno de las nuevas apli.
caciones para mantener las concentraciones deseadas y cons·
tantes en los tejidos de la palma.
•
11J{)'Vo
Bibliografía
80%
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..-.....
:: 60%
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40%
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NI ......- H17 ___ N17
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• d. dlu
H9: lamina iolillT de \a hoja 9
N9: Nervadura del foliolo de la hoia 9
H17: Lamina foliar de la hoja 17
Airede, C. 2002. Análisis del nuevo disturbio de la palma de acei·
te presente en la Zona Driental. Boletín divulgativo
Ceniavances lOO. Centro de investigación en Palma de Acei·
te, Cenipalma, Colombia. 4p.
N17', Nervadura del ioliDlo de la hoja 17
Figura 4 Dinámica de la Oxitelraclclina en los diferentes tejidos evaluados en palma adulta
Con la aplicación de Oxitetraciclina + Gentamicina lOTe + GEN) se
observó una dinámica similar. Sin embargo, la presencia de los
antibióticos en las dos primeras evaluaciones fue mayor Que en
las palmas inyectadas con sólo OTC, probablemente por la ac·
ción sinérgica Que ejercen los dos antibióticos IFig. 51.
Calvache, H., Castilla, C., Sánchez, J., Tovar, J., Gutiérrez, D.,
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•
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Documento sin publicar.
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Figura 5 Dinámka de la Oxitelraciclina+ Gentamióna en los diferentes tejidos evalu8dos en palma
adulta
Lozano, C. 2003. La pudrición bacterial de la raíz de la palma de
aceite: una nueva enfermedad de la especie en Colombia. In·
forme de asesoría. Cenipalma. Documento sin publicar.
Torres, f., Tovar, J. 2004. Estudio Epidemiológico de la enferme·
dad marchitez letal de la palma de aceite en plantaciones de
Villanueva ICasanarel. Palmas IColomhial 25 No. Especial
Tomo 11. 210 - 219.
•
Sánchez, J. 2004. La marchitez letal no es la marchitez vascular
africana causada por FlIsaríllm. Palmas IColombial.
Conclusiones
Los resultados obtenidos muestran Que la técnica del antibiograma
funciona para detectar antibióticos en palma de aceite y Que el
mejor tejido para evaluar su presencia es la nervadura del folíolo
de la hoja nueve, en la cual la sensibilidad de detección fue máxi·
Ola 22 días después de la aplicación.
El desarrollo de esta técnica es de gran importancia, pues permi·
te conocer con seguridad la efectividad de la aplicación de
antibióticos y su dinámica en el interior de la planta. De esta
manera se tendrá certeza de que los resultados obtenidos en los
experimentos de remisión de síntomas (positivos o negativos) son
consecuencia de los productos utilizados y no de fallas en la apli·
cación.
4
~~ceniPalma
Oi,oc1oJ: Pedro león Gómez Cuervo
Revisión de. textos: Comité de Publicaciones de Cenipalma
Coordinación editorial: Oficina de Prensa
Diseño y dialJramacmn: Briceño Gnifico
Impresiitn: Molher Ltda. Impresores
Esta publicación contó con el apoyo del Fondo de Fomenlo Palmero
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