Download Trabajo práctico n°5 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales
Universidad Nacional de Misiones
Trabajo práctico n°5
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Cátedra de Genética Molecular
GRUPO 2
Alumnos
o Briñoccoli Yanina
o Cortese Julieta
o Olexen Cinthia
o Rodríguez Ana Laura
o Soria Florencia
o Zerda Moreira Andrea
2015
1
TRABAJO PRÁCTICO Nº5
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (ER)
PARTE PRÁCTICA
A) Antes de efectuar una digestión de ADN genómico total es necesario conocer algunas
características de la enzima de restricción a utilizar. Con la ayuda de catálogos identificar los
siguientes aspectos de HaeIII:
-Fuente de donde es extraída la enzima: Haemophilus aegyptius
-Sitio diana (apunte la secuencia):
GG▼CC
CC▲GG
-Temperatura a la que opera la enzima: 37°C
-Buffer en el que actúa: Buffer C (ver Tabla 1 para especificación)
-Costo de la enzima: 2500 USD + IVA: 128.70 (Promega)
-Detalle:
¿Qué resultados espera obtener luego de la digestión con la ER? ¿Cómo se observaría a luz UV el
ADN digerido luego de una electroforesis en gel de agarosa?
Luego de la digestión con la enzima se espera obtener fragmentos de diferente peso molecular,
dependiendo de la cantidad de sitios diana que la secuencia en análisis presenta. Los fragmentos
obtenidos de la digestión luego se someten a electroforesis en gel y al revelar con la luz UV se
observarán los distintos fragmentos brillantes, en la distancia corrida según su peso molecular. Se
debe considerar que si se utiliza ADN genómico total es posible observar smear en la corrida
electroforética dada la cantidad de fragmentos que se generarían, muy por encima de la resolución
del gel de agarosa.
B) A continuación se le presentarán una serie de fotografías que corresponden a fragmentos de
ADN digeridos con: TaqI, HinfI, AluI, MboI, HaeIII y DdeI, con el objeto de determinar diferencias
intra (entre sexos) e interespecíficas. Las corridas fueron realizadas en geles de agarosa al 2%.
Determinar:
1. Buscar en catálogos las características de las diferentes enzimas a utilizar de igual forma
que en el punto A.
TaqI
2
-Fuente de donde es extraída la enzima: Thermus aquaticus YTI.
-Sitio diana (apunte la secuencia):
T ▼ CG
A
GC ▲ T
A
-Temperatura a la que opera la enzima: 65°C (exhibe una actividad <10% a 37°C)
-Buffer en el que actúa: Buffer E (ver Tabla 1 para especificación)
-Costo de la enzima: 1000u
 USD:102.31 (Promega)
Tabla 1: Proporciona composiciones de Buffers para la reacción de enzimas de restricción, que
figuran como concentraciones 1X.
Buffer
pH
(a 37 ° C)
Tris-HCl
(mM)
De MgCl 2
(mM)
NaCl
(mM)
KCl
(mM)
TDT
(mM)
B
7.5
6
6
50
-
1
C
7.9
10
10
50
-
1
D
7.9
6
6
150
-
1
E
7.5
6
6
100
-
1
HinfI
-Fuente de donde es extraída la enzima: Haemophilus influenzae Rf.
-Sitio diana (apunte la secuencia):
G▼ANT
C
C
TNA▲G
-Temperatura a la que opera la enzima: 37°C
-Buffer en el que actúa: Buffer B (ver Tabla 1 para especificación)
-Costo de la enzima: 1000u
 USD + IVA:85,80 (Promega)
AluI
3
-Fuente de donde es extraída la enzima: Arthrobacter luteus.
-Sitio diana (apunte la secuencia):
AG▼CT
TC▲GA
-Temperatura a la que opera la enzima: 37°C
-Buffer en el que actúa: Buffer B (ver Tabla 1 para especificación)
-Costo de la enzima: 500u
USD + IVA:143.55 (Promega)
MboI
-Fuente de donde es extraída la enzima: Cepa E. coli que lleva el gen MboI de Moraxella bovis (ATCC
10900).
-Sitio diana (apunte la secuencia):
▼GATC
CTAG▲
-Temperatura a la que opera la enzima: 37°C
-Buffer en el que actúa: 1X CutSmart® Buffer: 50 mM acetato de potasio,20 mM Tris-acetato ,10
mM Acetato de magnesio,100 mg / ml de BSA
-Costo de la enzima: 500u --> USD: 69 (NEB)
DdeI
-Fuente de donde es extraída la enzima: Desulfovibrio desulfuricans.
-Sitio diana (apunte la secuencia):
C▼TNA
G
G
ANT▲C
-Temperatura a la que opera la enzima: 37°C
-Buffer en el que actúa: Buffer D (ver Tabla 1 para especificación)
4
-Costo de la enzima: 200u
 USD + IVA:59.40 (Promega)
2. Reconocer, con la ayuda de catálogos, qué marcador de PM se utilizó en las diferentes
corridas electroforéticas. Detallar el tamaño de las diferentes bandas del mismo.
Con la ayuda del catálogo de Genbiotech, el marcador de PM que se utilizó en las diferentes corridas
electroforéticas fue una escalera de ADN de 100bp (Fig.1), de 11 fragmentos que varían en tamaño
desde 100 pb a 1000 pb en incrementos de 100 con una banda adicional en 1,500bp. El fragmento
de 500 pb está presente en mayor intensidad para facilitar su identificación.
En el presente trabajo se consideró de 600pb a la banda de mayor intensidad.
Fig 1. Marcador de peso molecular. Escalera de ADN de 100pb
3. Estimar el tamaño de las diferentes bandas producto de la digestión de una enzima
cualquiera.
En la tabla siguiente se presentan el tamaño, en pares de bases, de las diferentes bandas producto
de la digestión de cada una de las enzimas propuestas, en cada especie y discriminada por sexo:
5
Enzima
AluI
sexo
Machos
∑
Hembras
DdeI
∑
Machos
∑
Hembras
HaeIII
∑
Machos
∑
Hembras
Himfl
Mbol
Especies
1
2
3
4
5
6
7
8
510
510
510
510
510
510
510
510
200
200
200
200
200
200
200
200
170
170
170
170
170
170
170
170
150
150
150
150
150
150
150
150
100
100
100
100
100
100
100
100
1130 1130 1130 1130
1130 1130 1130 1130
520
520
520
520
520
520
520
520
200
200
200
200
200
200
200
200
170
170
170
170
170
170
170
170
150
150
150
150
150
150
150
150
100
100
100
100
100
100
100
100
1140
1140 1140
1140
1140 1140 1140 1140
550
550
550
550
550
550
550
550
460
280
280
280
280
280
280
280
280
170
170
170
170
170
170
170
130
130
1000 1590 1130 1000
1000 1000 1000
830
540
540
540
540
540
540
540
540
270
270
270
270
270
270
270
100
100
810
810
910
810
810
910
810
540
480
650
460
640
430
640
430
620
620
9
510
200
170
150
100
1130
520
200
170
150
100
1140
550
10
510
200
170
150
100
1130
520
200
170
150
100
1140
550
280
280
830
540
830
540
650 650
480
640
650
650
460
650
640
420
430
650
640
470
1050
650
620
470
650
650
600
330
600
330
600
330
100
600
330
100
600
330
600
330
100
600
330
100
600
330
100
600
330
600
330
∑
Hembras
930
600
330
930
600
330
1030
600
330
100
1030
600
330
100
930
600
330
1030
600
330
100
1030
600
330
100
1030
600
330
100
930
600
330
100
930
∑
Machos
930
850
930
850
∑
Hembras
300
1150
860
300
1150
860
300
1150
860
300
1150
860
860
1160
620
260
210
2250
620
200
360
860
1160
620
260
210
2250
620
200
360
320
1180
1160
660
260
210
2290
630
200
360
320
1180
630
260
210
∑
Machos
∑
Machos
TaqI
∑
Hembras
1030
850
1030
850
1100
620
200
360
930 1030
850
850
300
1150
860
300
1150
860
860
1160
620
260
210
2250
620
200
360
860
1160
620
260
210
2250
620
200
360
6
1030 1030
850
850
360
300
300
1510 1150
860
860
380
320
1560
860
630
660
260
620
210
260
210
1100 1750
620
660
200
200
360
360
1030
850 850
300 300
1150 1150
860
860
860
620
210
620
260
210
1690 1090
830
360
El cálculo del tamaño de las bandas obtenidas por las diferentes enzimas de restricción se realizó a
partir de la medición de las imágenes de las corridas electroforéticas y mediante una curva estándar,
la cual consiste en: la distancia de corrida de las bandas del marcador de peso molecular en el gel
en milímetros, versus el tamaño en pares de bases. Tal curva se realizó para cada gel presentado,
para así, luego de medir la distancia de la/las banda/s de cada especie en dicho gel, ubicar tal
distancia en la curva y poder determinar el peso molecular correspondiente:
Tamaño en pares de bases
Distancia de migración en mm
4. Elaborar un mapa de restricción tentativo para las diferentes enzimas utilizadas.
7
En el mapa tentativo presentado se debe considerar que los puntos de corte han sido estimados de
mediciones de corridas electroforéticas que, en algunos casos, pueden haberse perdido algunas
bandas, por lo que el tamaño del fragmento total y el número de sitios podría no reflejar la
verdadera acción enzimática. Asimismo, el orden de los fragmentos es arbitrario.
5. Determinar si con alguna de las enzimas se detectaron diferencias intra o interespecíficas.
•
La enzima Alu I no presentó diferencias intra e interespecíficas.
•
DdeI presentó diferencias intra e interespecíficas. En el macho 2 se observan 5 fragmentos,
obtenidos por 4 cortes realizados por la enzima. Por otra parte los machos de las especies 1
2 3 5 y 7 presentan una banda adicional. Los machos 2 y 3 también tiene una banda de 130
pb ausente en las demás especies.
En cuanto a las hembras en la especies 8 y 9 está ausente la banda de 270 pb. Mientras que
las especie 3 y 6 presentan una banda extra de 100 pb.
•
La enzima TaqI, evidenció en la corrida electroforética, diferencias intra e interespecificas
en los sitios de corte para esta enzima. Los machos de la especie 1 presentaron 4 bandas (3
sitios de corte) en comparación con las hembras de la especie 1 que presentaron 3 bandas
(2 sitios de corte). La misma situación puede observarse para los machos y hembras de las
especies 2, 3, 5,6.
Los machos y hembras de las especies 4 y 7, presentaron 3 bandas (2 sitios de corte). Con
respecto a la especie 9, para los machos se observaron 3 bandas ( 2 sitios de corte) mientras
que para las hembras se observaron solo 2(un sitio de corte).
En todos los casos la longitud de las bandas entre machos y hembras fue diferente con
excepción de los machos de las especies 1,2 ,5 y 6 que comparten una banda de igual
longitud con las hembras de las especies 1,2, 4,5, 6 y 7. Algunas bandas fueron de tamaño
muy similar entre machos y hembras de la misma especie.
8
Por otro lado, se observan diferentes patrones de bandas de distintas longitudes entre las
especies, pudiendo decir que la enzima TaqI presenta 1, 2 y 3 sitios de corte, dependiendo
de la especie observada.
•
HaeIII presentó diferencias intra e interespecíficas. Los machos y las hembras de las especies
1, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9 presentan patrones de bandas distintivos, en cuanto al tamaño y, en
algunos casos al número, presentando ninguno, 1 a 2 sitios de corte (quizás más). La especie
2 parecería no tener diferencias intraespecíficas.
Asimismo, son evidentes las diferencias entre las especies, mostrando diferentes o igual
número de bandas, y en el último caso, con diferente tamaño.
La enzima HaeIII parecería presentar diferentes sitios de corte en las diferentes especies y
entre los distintos sexos.
•
En la enzima MboI se observó tanto diferencias intra como interespecificas. Dentro de las
primeras observamos que las hembras presentaban mayor longitud (PM) de los fragmentos
obtenidos y que podían diferir en el número de bandas con respecto a los machos de una
misma especie. En cuanto a las diferencias interespecificas se puede mencionar 3 patrones
de bandas diferentes 1, 2 o 3 bandas donde algunas especies comparten el mismo patrón
como en el caso de los machos de las especies 2, 3, 4, 5, 9 y 10, que a su vez difieren de la
especie 7.
•
Al digerir con la enzima Hinf I, y luego del análisis de las fotografías de las corridas
electroforéticas, se pone de manifiesto que existen diferencias tanto intraespecificas como
interespecificas. Siendo más acentuadas las diferencias interespecificas.
Respecto a las diferencias intraespecificas: solo en la especie 9 se observa que los machos
presentan dos bandas (1 sitio de corte), mientras que en las hembras presentan 3 bandas
(2 sitios de corte).
Los individuos, tanto machos como hembras, de las especies 1, 2, y 5 presentan el mismo
patrón de bandas, dos fragmentos (1 sitio de corte). Los representantes de las especies 3,
4, 6, 7, y 8 presentan a su vez el mismo patrón de bandas, 3 fragmentos (2 sitios de corte).
Pero en las hembras de las especies 6 y 7 aparte existen otros tres fragmentos en los que
no se puede determinar el peso molecular de los mismos, debido a que se encuentran por
fuera del rango del marcador de peso molecular. No sucede lo mismo en los machos de las
mismas especies en donde solo existen los tres fragmentos mencionados anteriormente.
6. Discutir los resultados.
En los resultados obtenidos resaltamos que, al no poder determinar el tamaño del fragmento total
tratado con diferentes enzimas, los puntos de cortes propuestos son sólo sugerentes y representan
los sitios tentativos de acción de las enzimas. Esto se debe a que el número de bandas presentadas
9
en las corridas no implica, necesariamente, un número de sitios de cortes determinado. Por otro
lado, existe la dificultad de la determinación del tamaño de los fragmentos más pequeños que caen
fuera de la escala del marcador.
C) Utilizando el siguiente número de acceso M24401.1 del NCBI rescate la secuencia del genZfy2 de Mardon and Page (1994). Ubique los primers (AK1 y AK2) con la herramienta del NCBI.
Verifique el tamaño del amplicón. Levante la secuencia delimitada por los primers y traslade al
programa NEB CUTTER (www.tools.neb.com). Proceda a efectuar la digestión con las ER
detalladas en el punto B. Determine: (a) cuántos sitios de reconocimiento para cada ER posee el
fragmento amplificado? (b) la posición de los diferente sitio diana para las diferentes ER. (c)
Genere una corrida electroforética electrónica que le permita discriminar los fragmentos discretos
producto de la digestión con las diferentes enzimas. (d) Compare con los datos de las digestiones
realizadas en las fotografías entregadas.
Utilizando el número de acceso M24401.1 del NCBI identificamos la secuencia del gen Zfy-2 de
Mardon and Page (1994) y ubicamos los primers (AK1 y AK2):
LOCUS MUSZFY2A 2794 bp mRNA linear
Mus musculus, proteína de dedos de zinc (Zfy-2) mRNA.
Mus musculus (ratón doméstico)
Clasificación (NCBI) Mus musculus
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria;
Euarchontoglires; Glires; Rodentia; Sciurognathi; Muroidea; Muridae; Murinae; Mus; Mus.
La secuencia delimitada por los primer es:
10
GTCTATCCTTGCATGTTTTGTGGGAAAAAATTTAAGACCAAAAGGTTTTTGAAAAGACACATAAAAAACCAT
CCTGAATACCTTGCTAATAAAAAATATCACTGTACTGAGTGTGATTACAGTACCAACAAGAAGATAAGCTTA
CATAATCACATGGAGAGCCACAAGCTAACCATTAAGACAGAAAAGACCACCGAATGTGATGACTGTAGGAA
GAATCTTTCTCATGCTGGGACTTTGTGTACTCACAAAACAATGCATACAGAAAAAGGAGTCAACAAAACATG
TAAGTGTAAGTTCTGTGACTATGAAACAGCTGAACAGACATTATTGAATCACCACCTTTTGGTGGTCCACAG
GAAGAAATTTCCTCACATTTGTGGAGAATGTGGTAAAGGTTTCCGTCACCCATCAGCACTCAAAAAGCACAT
ACGAGTTCACACAGGAGAGAAGCCCTATGAATGTCAGTATTGTGAGTACAAGTCTGCAGACTCTTCCAACTT
GAAAACTCATATAAAATCTAAGCATAGTAAAGAGATACCACTGAAGTGTGACATCTGTCTCCTGACTTTCTC
AGATACCAAAGAGGCTCAGCAACATGCCGTTCTGCACCAAGAAAGCAGAACACATCAATGTTCACATTGCA
ACCATAAGAGTTCAAACTCAAGTGATTTAAAGCGACACATAATTTCCGTTCACACAAAGGCGTATCCTCATA
AATGTGACATGTGCAGCAAAGGATTTCATAGGCCTTCAGAACTCAAGAAGCATGTGGCTACCCATAAAAGT
AAAAAAATGCACCAATGTAGACACTGTGACTTTAATAGTCCAGATCCATTTCTGCTTAGTCACCATATTCTCT
CAGCTCACACAAAGAATGTTCCATTCAAGTGTAAGAGATGTAAAAAGGAATTTCAACAACAGTGTGAGCTT
CAAACGCATATGAAGACCCACAGTAGCCGAAAAGTCTATCAGTGTGAGTACTGTGAATATAGCACCAAAGA
TGCCTCAGGTTTTAAGCGTCACGTTATCTCCATTCATACGAAAGACTATCCTCACCGCTGTGACTTCTGCAAG
AAAGGATTCCGGAGACCCTCGGAAAAGAATCAACACATAATGCGACAT
Luego, levantamos la secuencia delimitada por los primers al programa NEB CUTTER
(www.tools.neb.com) y continuamos con la digestión con las ER detalladas en el punto anterior. Así
determinamos que:
a)
Los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción que posee el fragmento
amplificado son:
En la Tabla 1, se observa en la fila Cuts, los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción.
Para la enzima TaqI, no se detectaron sitios de reconocimiento en la secuencia amplificada:
11
b) La posición de los diferentes sitio diana para las diferentes ER son:
Sequence digested with: AluI, DdeI, HaeIII, HinfI, MboI
Sequence digested with: AluI, DdeI, HaeIII, HinfI, MboI
•
•
ALu I
Ddel
12
•
HaeIII
•
HinfI
•
Mbol
e) Corridas electroforéticas electrónicas para cada ER:
•
Alu I
13
•
Ddel
14
•
Hae III
15
•
HinfI
16
•
Mbol I
17
d) Compare con los datos de las digestiones realizadas en las fotografías entregadas.
Al comparar las corridas electroforéticas electrónicas con las fotografías entregadas observamos
que:
•
La enzima HaeIII presenta un patrón de bandas muy similar, en la especie 7, al
presentado en la electroforesis electrónica para ésta. Asimismo, la enzima MboI presenta un
patrón equivalente al de la electrónica en aquellas especies con dos bandas.
•
La enzima AluI exhibe un patrón de bandas análogo al de su electroforesis electrónica pero,
sin embargo, los tamaños de las bandas difieren.
•
HinfI y DdeI no son parecidas a sus equivalentes electrónicos.
•
La enzima TaqI no exhibe sitio de corte en la corrida electrónica.
18
Bibliografía
Sitios de internet consultados:
http://worldwide.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/restrictionenzymes/haeiii/?activeTab=0
http://www.biodynamics.com.ar/enzimas.html (Página de biodynamics donde se encuentran las
enzimas de restricción especificando cantidad (u) y precio en dólares más IVA)
http://worldwide.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/restriction-enzymeresource/
http://worldwide.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/restriction-enzymeresource/restriction-enzyme-reference-information/ (página donde se encuentra la composición
de los buffers de reacción que se especifican para cada enzima)
19