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TRABAJO CIENTÍFICO ORIGINAL
Epstein Barr virus y Enfermedad de Hodgkin en niños de
Honduras y Estados Unidos de América
Ambinder R., Brownig P., Lorenzana I, Levenihal B., Medina R., Cosenza H., Cardona V., Mann R., MacMahon £., Grufferman,
Olshan A., Levin A,, Petersen E., Biattner W-, Levine P.
RESUMEN
En poblaciones industrializadas la enfermedad de
Hodgkin tiene un pico inicial en adultos jóvenes mientras
en poblaciones económicamente en desarrollo el pico
inicial ocurre en la infancia. Este patrón se parece al de la
infección por Poliovirus y sugiere un co-factor infeccioso
en su etiología.
Estudios seroepidemiológicos han asociado al Epstein
Barr Virus (EBV) con la Enfermedad de Hodgkin (EH) en
adultos jóvenes. El ácido nucleico viral y antígenos virales
han sido detectados en muestras de pacientes con
Hodgkin.
Con el propósito de investigar la asociación entre la
enfermedad de Hodgkin en la infancia con el EBV, se
estudiaron muestras de tumores de 11 niños Hondureños
y 25 niños de Estados Unidos de América (E.U.A.),
utilizando la hibridización in situ y detección de antígeno
viral por medio de inmunoperoxidasa.
Todos los pacientes hondureños fueron positivos por
EBV. De los pacientes de E.U.A., 6 de 7 con celularidad
mixta, 2 de 15 con esclerosis nodular y ninguno de 2 con
predominio linfocitario resultaron positivos por EBV.
Estos hallazgos afianzan la hipótesis de que el EBV
contribuye a la patogénesis de la enfermedad de Hodgkin
en niños, particularmente en los casos de celularidad
De los Departamentos de Oncología, Patología y Medicina, John
Hopkins School Medicine, Baltimore,MD, The National Cáncer
Institute, Bethesda, MD; del Departamento de Microbiología,
Universidad Nacional Autónoma de Honduras, Tegucigalpa,
Honduras, del Departamento de Patología, Hospital Escuela,
Tegucigalpa, Honduras, del Departamento de Epidemiología
Clínica y Mediana preven ti va, Universidad dePittsburg, Escuela
de Medicina, Pittsburg, PA, The Research Triangie Institute Unít,
Harrow, Middlesex, UK; The University of Arizona, Tucson, AZ;
and the Pediatric Oncology Group, St. Louis, MO-Esta es una
traducción al español del artículo publicado en Blood, vol. 81,
Jan 15,1993 con la respectiva autorización de los autores y de la
Revista.
mixta, y sugiere la posibilidad de que factores geográficos,
raciales o étnicos son importantes en la asociación entre
EBV y la enfermedad de Hodgkin.
INTRODUCCIÓN
Epidemiológicamente la E.H. tiene peculiaridades tales
como que en países industrializados la enfermedad tiene
su pico de incidencia en adultos jóvenes mientras que en
países en desarrollo el pico inicial ocurre en la infancia.4
Desde el año de 19705"7 estudios serológicos han ligado al
EBV con la enfermedad de Hodgkin. En la mayoría de la
población la infección por EBV es asintomática, Sin
embargo en poblaciones económicamente desarrolladas
donde la exposición al virus se retrasa hasta la edad
adulta, la infección primaria es frecuentemente asociada
con la mononucleosis infecciosa.6'14 Se ha observado que
hay un riesgo incrementado entre las personas que han
padecido mononucleosis infecciosa y E.H. Aún más, en
pacientes con diagnóstico de E.H. se encuentran títulos
altos de anticuerpos contra EBV.(15)
Aunque la enfermedad de Hodgkin fue de los primeros
linfomas malignos en ser descritos todavía persisten
muchas incógnitas en relación a esta enfermedad como ser
el origen de la célula Reed-Stenberg. Los hallazgos de
Weiss y col. son consistentes con que el origen son los
linfocitos B.
Los linfocitos B son las células blanco del virus EBV, el
receptor viral es el mismo receptor para el componente del
complemento y este se encuentra en la mayoría de los
linfocitos B maduros. A pesar de que la mayoría de las
personas han sido infectadas con el virus y conllevan un
pequeño número de linfocitos inmortalizados por el virus.
En el Linfoma d e Burkitt el EBV puede ser un co-factor que
puede condicionar a una hiperplasia policlonal de células
B y a un riesgo aumentado de un segundo evento tal como
ser la traslocación de gcnes que lleven a una
transformación a células malignas.
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HOND. PED. - VOL. XVI - No. 1 - AÑO 1993
Los esfuerzos inicíales se hicieron para detectar el EBV en
la E.H. por medio de reasociación DNA-DNA, pero estos
fracasaron por lo que muchos investigadores intentaron
una asociación indirecta.16
Sin embargo con el advenimiento de sondas para virus y
técnicas de hibridización, el DNA del EBV se detectó en
un 15-25% de la mayoría de adultos en los tumores de
pacientes de E.U.A., Europa y Japón.(17Z0) Estudios de
hibridización in situ han proveido evidencia del virus en
células malignas, en las células tumorales de la E.H. En
todos los estudios que se han realizado el EBV ha sido
detectado más frecuentemente en los casos de celularidad
mixta.
El siguiente estudio se realizó con el propósito de investigar
la potencial asociación con el EBV usando técnicas
moleculares desarrolladas recientemente aplicables a
muestras de tejido fijas. Se estudiaron 11 muestras de
pacientes hondureños y 25 de pacientes de E.U.A.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizaron biopsias en formalina y/o de bloques de
parafina y también muestras de laparatomía con o sin
involucramiento maligno de 36 niños menores de 15 años
conE.H. Los niños fueronatendidosen el Hospital Escuela,
Tegudgalpa, Honduras o en una Institución afiliada al
grupo de Oncología Pediátrica Norteamericana. El
diagnóstico confirmatorio fue hecho por un hematopatólogo de los frotis coloreados con hematoxilina-eosina
siguiendo criterios estandarizados.
Se utilizó la técnica de hibridización in situ, para esto se
usaron sondas marcadas con Digoxigenina (plasmido
RA-386) que contiene la secuencia completa del RNA-m
temprano del EBV. Se utilizó además una sonda del CMV,
la cual se usó porque siendo este virus ampliamente
diseminado en la población no ha sido asociado con E.H.
Como control positivo se utilizó la línea celular B95-8 que
son células transformadas por el EBV y como control
negativo células BJAB que son células de un linfoma de
células B-EBV negativo.
Para la detección de antígeno viral se digirieron las
secciones de parafina con 0.1 % de tripsina por 10 minutos
a temperatura ambiente. Se utilizó el anticuerpo
Monoclonal S-12 con la técnica de Inmunoperoxidasa, la
cual utiliza como anticuerpo detector un anti-IgG de
ratón biotina y luego Peroxidasa Avidina y 4-cloro-l
naftol como sustrato, una coloración café es indicativo de
la presencia del antígeno viral.
RESULTADOS
En las muestras de los niños hondureños se detecta intensa
hibridización con la sonda del EBV (EBER1) (fig. No. 1).
Fig. 1. Una sección de tejido de biopsia de enfermedad de Hodgkin Celularidad Mixta hibridizando con una sonda de EBV y con colorante
de contraste eosina. A la izquierda se observa hibridización intensa en
las células neoplásicas. Derecha se observa la hibridización en forma de
grumos y marginada hacia la membrana nuclear de la célula ReedSternberg. Los nucléolos y nudeoplasma no muestran señal de
hibridización.
Estos tumores incluían 6 con celaridad mixta (C.M.), 32
con esclerosis nodular, 1 con predominio Iinfocitario y
uno interfolicular por lo tanto no fue subclasificado (fig.
No. 2).
De los pacientes de E.U.A.: 9 de 25 (36%) fueron positivos,
de estos 6/7 era CM. y 2/15 con esclerosis nodular, 0/2
con predominio Iinfocitario y 1 era interfolicular. La señal
de hibridización fue predominantemente asociado con
las células Reed-Stenberg y sus variantes.
LostiposdeCM. y Esclerosis nodular fueronlos subtipos
más comúnmente encontrados en Honduras y E.U.A.
respectivamente.
La detección del EBV por la técnica de Hibridización in
situ fue confirmada en cada caso por la detección del
antígeno viral la proteína transformadora del EBV LMP1 por medio de la técnica de inmunoperoxidasa, esta
proteína es citoplásmica y de membrana y esta asociada
con las células Reed-Stenberg y sus variantes (fig. No. 3).
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DISCUSIÓN
Fig. 3. Coloración de Inmunoperoxidasa. Una sección de Tejido de
biopsia de celularidad mixta muestra coloración en el citoplasma y en
la membrana de las células Reed-Sternberg. Inserto se observa la
combinación de hibridización in situ y detección de antígeno. La señal
de la hibridización es nuclear y la inmunoperoxidasa es dtoplásmica.
Tejido linfático de estos pacientes EBV positivos fue
obtenido de Laparatomía exploratoria y fue también
estudiado. Por lo menos una muestra de tumor estaba
disponible de 5 pacientes hondureños (5/11) y todas
resultaron también positivas por EBV. Además 10
muestras de tejido Hnfoide de estos pacientes sin
involucramiento maligno fueron también estudiadas y
eran EBV negativas. Ninguna muestra indicó
hibridización con la sonda del CMV.
Aunque la relación entre EBV y E.H. en la infancia en
países en desarrollo ha sido ya hipotetizado,41 estudios
de detección directa no se han realizado en niños. La falta
de estudios se ha reflejado en parte por la falta de tejido
tumoral. Los estudios iniciales en que se detecta el EBV en
E.H. en adultos, se basaban en técnicas como el Southern
Blot, hibridización del DNA extraído de los tejidos de
tumores congelados o tejidos frescos, un método de
detección que no es fácilmente aplicable a tan rara
enfermedad. Las técnicas aplicadas en este estudio son
técnicas que han sido optimizadas para la aplicación en
tejidos rutinariamente empleados que son tejidos fijos.35
La intensidad de la señal de hibridización obtenida y la
ausencia de fondo son atribuibles al alto número de
copias de EBER-1 en las células infectadas.1922'26
Mientras la mayoría del genoma EBV es expresado en un
pequeño número de copias (10-1000 copias por célula)42-43 o
del todo no es expresado en infecciones latentes, el
EBER-1 y los RNA'ssonexpresadosenabundancia (hasta
107 copias por célula). Entonces esta técnica es
suficientemente sensible para detectar en forma
consistente el EBV en tejidos formalinizados o en de
bloques de parafina. Los EBER's no dan reacción cruzada
con otros virus incluyendo el HTV, CMV o HSV35 o con
tejidos normales en las condiciones utilizadas en el ensayo
aquí descrito. El hallazgo de que varias muestras de
tumores del mismo paciente fueron consistentes en
términos de la detección del EBV y apoya la hipótesis de
que el EBV juega un papel importante en la patogénesis
de esta enfermedad. Aun más la ausencia de transcritos
virales de las muestras linfoides no involucradas sugiere
que el virus está altamente confinado a células tumorales
en los tejidos linfoides.
La proteína LMP-1 es codificada por uno de los genes
latentes del EBV que ha sido asociado con la regulación
del crecimiento celular.46 La expresión de la LMP-1
también ha sido previamente reportada en Hodgkin en
adultos.28'29'31 Su detección acá en niños provee una
confirmación de los resultados de la hibridización in
situ y apoya la hipótesis de que cuando el EBV está
presente no es meramente un pasajero silencioso en la
EH pero está contribuyendo directamente a su
patogénesis. Algo interesante es que esta proteína no es
expresada en linfoma de Burkitt.49 Entonces es razonable
pensar que el role del EBV es probablemente diferente
en E.H. y el Hnfoma de Burkitt.
El tipo de celularidad mixta fue bastante (92%) asociada
en E.H. en los niños de Honduras y E.U.A. Ha sido
reportado por otros investigadores la asociación fuerte
con este tipo histológico y E.H. en una serie compuesta
principalmente de adultos.
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LMP-1 fue detectado en 23 de 24 (96%) casos de
celularidad mixta en E.H. en pacientes Daneses.28 Otro
tipo de histologías de E.H. en niños hondureños fueron
altamente asociados con EBV. En contraste solamente
una minoría de otras histologías fueron asociadas con
EBV en los niños de E.U.A. Es interesante que uno de
los casos de esclerosis nodular de los niños de E.U.A.
era de un niño hispano y que otras muestras de tumores
de niños hispanos en E.U.A. 3 de 4 de ellos fueron
positivos por EBV.
1.
Newell G: Etiology of múltiple sclerosis and
Hodgkin's disease. Am J Epidemiol 91:119,1970.
2.
Gutensohn N, Colé P: Epidemiology of Hodgkin's
disease in the young. Int J Cáncer 19:595,1977.
3.
Gutensohn N, Colé P: Childhood social environment
and Hodgkin's disease. N Engl J Med 304:135,1981.
Los números son muy pequeños para poder hacer
conclusiones firmes pero sugieren la posibilidad de que
la asociación entre EBV y E.H. puede variar en función
de la histología, geografía y grupo étnico. En relación a
la incidencia de enfermedades malignas y asociación
viral en las que EBV ha sido detectado no es un fenómeno
nuevo y se ha descrito anteriormente.50
4.
Correa P, O'Conor GT: Epidemiologic pattems of
Hodgkin's disease. Int J Cáncer 8:192,1971.
5.
Levine PH, Ablashi DV, Berard CW. Carbone PP.
Waggoner DE: Elevated antibody titers to herpestype virus in Hodgkin's disease. Proc Am Assoc
Cáncer Res 11:49,1970.
Aunque el EBV es un virus de distribución mundial
existe una variación geográfica en la incidencia de
Carcinoma de Nasofaringe y Linfoma de Burkitt. El Ca
de nasofaringe es más común en el Sur de China
incluyendo a los que emigran de esta zona, pero es raro
en el resto del mundo.
6.
Johansson B, Klein G, Henle W, Henle G: EpsteinBarr virus (EBV) associated antibody patterns in
malignant lymphoma and leukemia. I. Hodgkin's
disease. Int J Cáncer 6:450,1970.
7.
No hay aparentemente una variación geográfica en su
asociación con EBV, ya que es de ún lOO%.34-50-51 Pero si
existe variación geográfica en la incidencia de Linfoma
de Burkitt52 y entre la asociación del virus y el Linfoma.
Levine PH, Ablashi DV, Berard CW, Carbone PP,
Waggoner DE, Malan L: Elevated antibody titers to
Epstein-Barr virus in Hodgkin's disease. Cáncer
27:416,1971.
8.
En Norte América y Europa es un linfoma poco común y
se asocia sólo ocasionalmente con EBV, mientras que en
África Ecuatorial, el tumor es común y usualmente
asociado con el virus.52
Evans AS, Gutensohn NM: A population-based
case-control study of EBV and otherviralantibodies
among persons with Hodgkin's disease and their
siblings. Int J Cáncer 34:149,1984.
9.
Miller RW, Beebe GW: Infectious mononucleosis
and the empirical risk of cáncer. J. Nati Cáncer Inst
50:315,1973.
10.
Rosdahl N, Larsen SO, Clemmesen J: Hodgkin's
disease in patients with previous infectious
mononucleosis: 30years'experíence.BrMcdJ 2:253,
1974.
Estos hallazgos apoyan la hipótesis que el EBV contribuye
con la patogénesis de la E.H. en niños particularmente en
los casos de celularidad mixta. Si se confirmara con
hallazgos de otros países la variación geográfica, racial o
étnica esto pudiera servir como punto de partida para
estudios que involucren otros co-factores importantes en
su etiología.
11.
Kvale G, Hoiby EA, Pedersen E: Hodgkin's disease
in patients with previous infectious mononucleosis.
Int J Cáncer 23:593,1979.
12.
Cárter CD, Brown TM Jr, Herbert JT, Heath CW Jr:
Cáncer
incidents
following
infectious
mononucleosis. Am J Epidemiol 105:30,1977.
Las técnicas que acá se emplearon son aplicables a tejidos
fijos usados convencionalmente y esto puede facilitar
futuros estudios epidemiológicos que pretendan asociar
virus con la etiología de otros tumores.
13.
Muñoz N, Davidson RJL, Witthoff B, Ericsson JE,
de-The G: Infectious mononucleosis and Hodgkin's
disease. Int J Cáncer 22:1,1978.
La ausencia del EBV del tejido linfoide no involucrado en
los niños con E.H. y EBV positivo en Honduras sugiere
que la asociación no es consecuencia de que el paciente
esté globalmente inmunocomprometido, pero representa
que hay una interacción compleja entre el virus y el
huésped.
HOND. PED. - VOL. XVI - No. 1 - AÑO 1993
Analy sis of Epstein-Barr viral genomes in lymphoid
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chain reaction and in situ hybridization. Virchows
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