Download Detección y limpieza de virus en orquídeas cultivadas

CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYTSECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYTFONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYTUNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA – UVG -
INFORME FINAL
EVALUACIÓN DE MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN Y
LIMPIEZA DE VIRUS EN ORQUÍDEAS CULTIVADAS
PROYECTO FODECYT No. 067-2007
MARGARITA PALMIERI
Investigador Principal
GUATEMALA, JULIO DE 2012.
ii
EQUIPO DE INVESTIGACIÓN:
Licda. Margarita Palmieri Santisteban – Investigadora Principal
Licda. María Renée Álvarez – Investigadora Asociada
iii
AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro
del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría
Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología -CONCYT-.
iv
OTROS AGRADECIMIENTOS
Este trabajo no habría sido posible sin la colaboración de los dueños de los
cultivos comerciales y no comerciales de orquídeas que accedieron a colaborar con el
proyecto prestando sus orquídeas para su análisis. También se agradece a la Asociación
Guatemalteca de Orquideología (AGO) por permitirnos el acceso a sus reuniones y
contactos para poder realizar el proyecto.
v
INDICE
CONTENIDO
PÁGINA
RESUMEN
xi
ABSTRACT
xii
PARTE I
I.1. Introducción
1
I.2. Planteamiento del problema
2
I.2.1.
Antecedentes en Guatemala
3
I.2.2.
Justificación
3
I.3. Objetivos e hipótesis
I.3.1.
Objetivos
5
I.3.1.1.General
5
I.3.1.2.Específicos
5
I.3.2.
Hipótesis
5
I.4. Metodología
I.4.1.
Localización
6
I.4.2.
Las variables
6
I.4.2.1.Las variables dependientes
6
I.4.2.2.Las variables independientes
6
I.4.3.
Indicadores
6
I.4.4.
Estrategia metodológica
7
I.4.5.
El método
7
I.4.6.
La técnica estadística
9
PARTE II
II.1 Marco teórico
II.1.A)
La familia Orchidaceae
10
II.1.B)
Las Orchidaceae en Guatemala
13
II.1.C)
Cultivo de orquídeas
14
II.1.D)
Híbridos de orquídeas
14
II.1.E)
Enfermedades y plagas de orquídeas
15
II.1.F)
Enfermedades virales en orquídeas
16
vi
II.1.G)
Detección de virus en orquídeas
22
II.1.H)
Terapias de tratamiento de virus
24
II.1.I)
Limpieza de virus en orquídeas
26
PARTE III
III.1. Resultados
27
III.1.A)
Diagnóstico de enfermedades virales
27
III.1.B)
Terapias de limpieza de virus
31
III.2. Discusión de resultados
III.2.A)
Diagnóstico de enfermedades virales
34
III.2.B)
Terapias de limpieza de virus
36
PARTE IV
IV.1. Conclusiones
40
IV.2. Recomendaciones
41
IV.3. Referencias bibliográficas
42
IV.4. Anexos
IV.4.1.
Metodología de ELISA directo
47
IV.4.2.
Metodología de ELISA indirecto
49
IV.4.3.
Resultados de presencia de 6 virus en la 180 Orquídeas
Analizadas
IV.4.4.
51
Fotografías de los síntomas más comunes presentados
Por las orquídeas infectadas por virus
54
PARTE V
V.
1. Informe Financiero
56
vii
LISTADO DE FIGURAS
CONTENIDO
PÁGINA
Figura 1. Esquema de una flor de orquídea
11
Figura 2. Flor de Cattleya vista frontal y sección lateral
11
Figura 3. Cápsulas de tres especies de orquídeas
12
Figura 4. Semilla de orquídea, compuesta por el embrión y la testa
17
Figura 5. Daño provocado en hojas por Cymbidium mosaic virus (CyMV)
17
Figura 6. Daño provocado por Odontoglossum ringspot Tobamovirus
(ORSV) en a) una hoja de Cymbidium y b) una hoja de Phalaenopsis.
18
Figura 7. Daño provocado por a) Virus de la mancha anillada del
Odontoglosum (ORSV o TMV-O) en una flor de Cymbidium b) la
combinación de ORSV y el virus del mosaico del Cymbidium (CymMV)
en una flor de Cymbidium y c) ORSV en una flor de Cattleya.
19
Figura 8. a) Cattleya percivaliana con síntomas de CMV, b) hoja de
Coelogyne rochussenii con síntoma de CMV, c) hojas de Laelia lobata
con ORSV y CMV, d) hojas de Epidendrum con síntomas de ORSV y
CMV y e) CMV en Pescatoria wallisii
20
Figura 9. Hoja de Dactylorhiza foliosa con síntomas del virus del mosaico
amarillo de la judía (BYMV) (Skelton et al. 2006)
20
Figura 10. Síntomas de infección con Tospovirus en una hoja de
Phalaenopsis, b) síntomas de TSWV en una hoja de Phalaenopsis
21
Figura 11. a) síntomas de OFV en hojas, b) síntomas de OFV en bulbos,
c) síntomas de OFV en hojas de Dendrobium, d) síntomas de OFV
en hoja de Cymbidium y e) sintomatología de OFV en hojas de Laelia
22
Figura 12. Micrografía electrónica de viriones de OFV purificado. Un
Aumento del virus se encuentra en el área dentro del rectángulo.
22
Figura 13. Pasos del procedimiento de ELISA directo. I = savia de planta
infectada con virus y S = savia de planta sana
23
Figura 14. Brote lateral de Cattleya que puede ser utilizado como explante
para el cultivo de meristemos
25
Figura 15. Frecuencia de los diferentes virus encontrados en las muestras de
Orquídeas colectadas.
28
viii
Figura 16. Número de plantas de orquídeas con infecciones mixtas por
2 y 3 virus simultáneamente.
28
Figura 17. Gráfica de la distribución de la presencia de virus en
Orquídeas infectadas.
29
Figura 18. Movimiento del virus del Mosaico del Cymbidium (CyMV)
En híbridos de Dendrobium infectadas.
37
Figura 19. Efecto de la termoterapia para la eliminación de PVY
39
ix
LISTADO DE CUADROS
CONTENIDO
PÁGINA
Cuadro 1: Número de plantas positivas para los virus analizados.
27
Cuadro 2. Orquídeas infectadas trasladadas al invernadero de la UVG
30
Cuadro 3. Orquídeas tratadas con hidroterapia, termoterapia y cultivo
de meristemos
30
Cuadro 4. Resultados de la prueba de ELISA en las orquídeas tratadas
con hidroterapia.
31
Cuadro 5. Resultados de la prueba de ELISA en las orquídeas tratadas
con termoterapia.
32
Cuadro 6. Resultados de la prueba de ELISA en las orquídeas tratadas
con cultivo de meristemos.
32
Cuadro 7. Resultados de la prueba de ELISA en las orquídeas tratadas
con termoterapia a 42°C luego del cultivo de meristemos.
x
33
RESUMEN
La familia Orchidaceae es una de las más grandes del reino vegetal, en Guatemala
representa aproximadamente el 10% de la flora. La belleza de sus flores ha hecho que sean muy
apreciadas ornamentalmente, por lo cual su cultivo ha aumentado en los últimos años. Las
condiciones ambientales en que se cultivan las hacen susceptibles a la infecciones por virus;
siendo los más comunes: virus de la mancha anillada del Odontoglossum (ORSV), virus del
mosaico del Cymbidium (CyMV), mosaico del pepino (CMV), virus del bronceado del tomate
(TSWV), virus del mosaico del tabaco (TMV) y potyvirus. En este trabajo se realizó un
diagnóstico de la presencia de los 6 virus por medio de pruebas ELISA en 6 cultivares. Además
se implementaron terapias para la eliminación de virus en las orquídeas infectadas. Éstas fueron:
hidroterapia a 45°C durante 1 hora, termoterapia a 42°C durante 24 horas, cultivo de
meristemos y cultivo de meristemos seguido de termoterapia a 42°C y 8, 16, 24 y 48 horas. Se
encontró que el 19.89% (36 plantas infectadas) de todas las plantas analizadas estaban
infectadas con uno o más virus. Se observó la presencia de 3 virus: ORSV, CyMV y
TMV. La sintomatología observada fue: líneas cloróticas en presencia de CyMV y manchas
cloróticas en presencia del virus de ORSV. Ninguna de las terapias realizadas fue efectiva
para la limpieza de virus en orquídeas. Únicamente una planta mostró eliminación de
los virus por medio de hidroterapia.
Palabras clave: Orquídeas, virus, pruebas ELISA, terapias de eliminación, cultivo de
meristemos
xi
ABSTRACT
The Orchidaceae family is one of the largest in the plant kingdom, in Guatemala,
representing approximately 10% of the flora. The beauty of their flowers has made
them highly prized ornamentals, for which cultivation has increased in recent years.
The environmental conditions in which they are grown make them susceptible to virus
infections, the most common being: Odontoglossum ringspot virus (ORSV), Cymbidium
mosaic virus (CyMV), cucumber mosaic virus (CMV), tomato spotted wilt virus
(TSWV), tobacco mosaic virus (TMV) and potyvirus. In this work we carried out an
assessment of the presence of the 6 viruses using ELISA in 6 cultivars. In addition,
therapies were implemented to eliminate virus from infected orchids. Those were:
hydrotherapy at 45 ° C for 1 hour, thermotherapy at 42 ° C for 24 hours, meristem
culture and meristem culture followed by thermotherapy at 42 ° C for 8, 16, 24 and 48
hours. We found that 19.89% of all plants tested were infected with one or more
viruses. We observed the presence of 3 viruses: ORSV, CyMV and TMV. The
symptoms observed were: chlorotic lines in the presence of CyMV and chlorotic spots
in the presence of ORSV. None of the therapies performed were effective in cleaning
viruses in orchids. Only one plant was cleaned by hydrotherapy.
Keywords: Orchids, virus, ELISA, elimination therapies, meristem culture
xii
PARTE I
I.1. INTRODUCCIÓN
Las orquídeas son plantas monocotiledóneas que se caracterizan por la belleza
de sus flores. Muchas de éstas han sido cultivadas e hibridizadas para su
comercialización. Su cultivo ha ido creciendo en todas partes del mundo, incluyendo
Guatemala. El cultivo de orquídeas es una producción intensiva en el que se posee un
importante capital en muy poco espacio. Un vivero mediano cuenta con alrededor de
quince mil plantas, las cuales necesitan muy buena calefacción y alto porcentaje de
humedad. Estas condiciones son propicias para el desarrollo de diversas plagas y
enfermedades. Es por ello que es necesario tener un exhaustivo control en las
colecciones.
Las plagas y enfermedades en orquídeas son consecuencia de un riego
incorrecto, mala ventilación, hábitos de fertilización incorrectos y otros errores de
cultivo. En función de su origen hay cinco tipos de enfermedades: las provocadas por
animales, hongos, bacterias o virus y las de origen fisiológico (Jezek 2005). Las
enfermedades provocadas por hongos, animales y bacterias pueden ser controladas con
productos químicos y las de origen fisiológico deben eliminarse con el control de las
condiciones climáticas. Las enfermedades virales no tienen aún una cura, la única
manera de combatirlas es realizando un examen para detectar la presencia de virus y
evitar la extensión de la enfermedad. Se pueden tomar medidas preventivas como
desinfectar los utensilios utilizados para el corte de flores y hojas.
En los últimos años los virus han tomado gran relevancia dentro del cultivo de
orquídeas. La alta incidencia de estos patógenos puede ser atribuida a la facilidad de
transmisión por herramientas usadas en las prácticas culturales. Más de veinticinco
virus han sido reportados en orquídeas (Moreira et al. 1999, Cárdenas 2000).
Frecuentemente las plantas infectadas por virus suelen florecer con menos eficiencia,
pierden vigor y producen flores de menor calidad que las plantas sana, afectando el
valor de exhibición o comercial de las plantas (Report on plant disease 1990; Hu et al.
1993). Además los virus causan una gran cantidad de anormalidades en la planta, como
cambios en su forma, color y apariencia. Dos de los efectos más notables son el
amarillamiento (clorosis) por inhibición de la formación de cloroplastos y muerte de los
tejidos (necrosis). Estos síntomas pueden ocurrir separadamente o en combinación.
También producen debilitamiento y reducción de la capacidad productiva, enanismo y,
lo más importante en el caso de las orquídeas, manchas y/o deformación de la flor. En
algunas especies, los virus manifiestan síntomas solo en los puntos de inoculación; sin
embargo, sus efectos pueden ocurrir tiempo después en cualquier parte de la planta y
causar mucho daño (Cárdenas 2000). Sin embargo, a veces, la infección por virus
puede ser asintomática. En estos casos los síntomas pueden aparecer mucho después de
la infección, manifestarse únicamente en las flores o no presentar nunca síntomas (Jezek
2005; Labrín et al. 2005). En éste último caso, el riesgo es de propagar la infección
viral a otras plantas por medio de los utensilios de corte usados en invernaderos, por
contacto entre plantas o por medio de vectores como áfidos o trips.
1
Los síntomas de virus en la familia Orchidaceae son tan diversos como la familia
misma y pueden expresarse levemente o provocar severas distorsiones en flores y hojas.
Sumado a esto, los síntomas virales pueden ser confundidos con síntomas provocados
por otros patógenos o por deficiencias nutricionales (Wisler 1989; Report on plant
disease 1990); por ejemplo, síntomas típicos de virus son manchas o líneas cloróticas o
necróticas; sin embargo, enfermedades causadas por hongos y bacterias, así como
deficiencias de luz o déficit hídrico pueden causar síntomas similares (Wisler 1989). Es
por estas razones que se han desarrollado diversas técnicas de detección de virus en
plantas. Entre éstas se encuentran el uso de plantas indicadoras, microscopía electrónica
y de luz y técnicas serológicas como inmunodifusión y pruebas ELISA (Wisler 1989),
así como técnicas moleculares. Los métodos serológicos que emplean enzimas como
marcadores se conocen como ensayos inmunoenzimáticos. La prueba de ELISA
(Enzyme-linked immunosorbent assay) forma parte de estos ensayos (Batista et al.
2008).
El diagnóstico de plantas enfermas puede indicar la presencia de uno o más virus
en una planta. Cuando no se cuenta con plantas madre libres de patógenos, o cuando se
trata de especies o variedades difíciles de reproducir, es posible aplicar técnicas para la
eliminación de los virus, obteniendo de esta manera material sano que pueda ser
reproducido asexualmente. En la actualidad se cuenta con varios procedimientos para la
eliminación de virus en plantas enfermas, entre estos se encuentran: la quimioterapia, el
cultivo de meristemos, la termoterapia y la hidroterapia. Sin embargo, en orquídeas
únicamente se ha probado la combinación de cultivo de meristemos con quimioterapia y
ha resultado poco efectiva.
Debido a que a la fecha no se tiene aún ningún procedimiento de limpieza de
virus en orquídeas, la única alternativa que los cultivadores poseen es la de aislar los
individuos enfermos para evitar la propagación de la enfermedad viral. La eliminación
de las plantas enfermas de la colección puede representar altos costos, tanto económicos
(al tratarse de híbridos de alta producción), como genéticos, si la planta infectada
pertenece a una especie con solo uno o dos ejemplares en colección. Es por esto que se
hace importante encontrar una opción efectiva y de bajo costo para obtener plántulas
libres de virus a partir de especímenes enfermos.
Pretendemos diagnosticar con pruebas ELISA enfermedades virales en
orquídeas cultivadas e implementar procedimientos de terapia de eliminación de virus
(principalmente termoterapia e hidroterapia) y extracción y cultivo de meristemos in
vitro. Esperamos lograr la recuperación de plantas de orquídeas con infección viral que
forman parte de colecciones tanto con fines comerciales como de conservación.
2
I.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
I.2.1. Antecedentes en Guatemala
Estudios de virus en orquídeas en Guatemala han sido muy escasos pero sobre
todo eventuales. No ha habido sistematización en los estudios. Solamente se ha hecho
un poco de investigación según los problemas que van surgiendo. Solamente existe una
publicación sobre este tema. El estudio titulado: “Determinación de enfermedades
virales en orquídeas de invernaderos y silvestres de Guatemala” fue publicado por R.
Calzia de Molina y M. Palmieri en 1997, en las Memorias del VIII Congreso Nacional
de Manejo integrado de plagas. En ese estudio se comprobó la presencia de virus en
orquídeas tanto cultivadas como en estado silvestre, pero siendo el porcentaje mayor en
invernaderos. Los virus reportados son el virus del mosaico amarillo del frijol
(BYMV), el virus del mosaico del Cymbidium (CymMV), virus de los puntos anillados
del Odontoglossum (ORSV) y el virus del mosaico del pepino (CMV). Reporta también
que el virus de mayor incidencia es el CymMV (21%), seguido por el ORSV (14%).
También, hace mención de que el CMV fue el único virus en esa oportunidad,
encontrado tanto en orquídeas de invernadero como en orquídeas de la naturaleza.
Dicho estudio es el único publicado en nuestro país sobre enfermedades virales en
orquídeas; sin embargo, el estudio no incluye métodos de limpieza de virus.
I.2.2. Justificación del trabajo de investigación
El cultivo y comercio de orquídeas nativas e introducidas, como plantas de
colección, flores de corte o plantas ornamentales, ha tomado auge en los últimos años;
sin embargo, en Guatemala aún no se han hecho estudios de la identificación y
prevalencia de virus en colecciones y plantaciones comerciales, mucho menos de
limpieza de virus en estos sitios. Según Wisler (1989) no hay colección en el mundo
que se encuentre totalmente libre de infecciones virales. Esto, además de las pérdidas
económicas que causa a comerciantes, puede reducir la variabilidad genética de las
colecciones al infectar especies nativas raras o difíciles de reproducir.
A la fecha no se conoce ningún tratamiento efectivo para la eliminación de
virus en orquídeas. A pesar de que se ha tomado al cultivo de meristemos como la
técnica a elegir, esta tecnología por sí sola no es suficiente, sobre todo por las
dificultades que representa el hacer cortes muy pequeños y el riesgo que se corre al
hacerlos muy grandes (Wisler 1989; Vásquez 2000). También se han realizado estudios
(Lim,Wong & Goh 1993; Toussaint et al. 1993) para la utilización de quimioterapia con
este fin; sin embargo, sus altos costos y poca efectividad la hace inadecuada para ser
utilizada en países en desarrollo, por lo que el único método recomendado para evitar
que una infección viral se disperse en una colección o cultivo comercial es eliminar las
plantas enfermas.
La eliminación de las plantas enfermas de la colección puede representar altos
costos, tanto económicos (al tratarse de híbridos de alta producción), como genéticos, si
la planta infectada es una especie endémica que se encuentra en una colección científica
o con fines de rescate. Esta opción es especialmente dañina si el ejemplar infectado se
trata de un híbrido (natural o producido) valioso con bajos niveles de reproducción o de
3
una especie nativa de la cual sólo se tiene uno o dos ejemplares en colección. Es por
esto que se hace importante encontrar una opción efectiva y de bajo costo para obtener
plántulas libres de virus a partir de especímenes enfermos.
En este estudio se pretende implementar procedimientos de terapia de
eliminación de virus (principalmente termoterapia e hidroterapia), y la extracción y
cultivo de meristemos in vitro para lograr la recuperación de plantas de orquídeas con
infección viral que forman parte de colecciones tanto con fines comerciales como de
conservación.
Es importante determinar si las plantas tratadas con las tecnologías propuestas
estarán libres de virus, por lo que es necesario diagnosticar los virus presentes en las
colecciones trabajadas. Esto puede hacerse mediante ELISA, las cuales son
ampliamente utilizadas en estudios científicos debido a su confiabilidad, bajo costo y
facilidad, ya que permiten correr un gran número de muestras simultáneamente.
El objetivo de este estudio es lograr una metodología que permita obtener
plantas libres de virus a partir de plantas infectadas y de esta manera ayudar a disminuir
las pérdidas provocadas por infecciones virales en colecciones y cultivos comerciales.
4
I.3. OBJETIVOS E HIPÓTESIS
I.3.1. Objetivos
I.3.1.1. General
 Implementar una metodología que permita la eliminación de infecciones
virales en orquídeas.
I.3.1.2. Específicos
 Realizar el diagnóstico de enfermedades virales en orquídeas cultivadas por
medio de pruebas ELISA
 Determinar la terapia para limpieza de virus más efectiva para la eliminación
de los mismos en orquídeas
 Extracción de meristemos de orquídeas
 Obtención de plántulas libres de virus por medio del cultivo in vitro.
I.3.2. Hipótesis
Ha1:
La hidroterapia es el método más eficaz en la limpieza de virus en orquídeas
cultivadas, comparado con el método de termoterapia.
Ha2:
La termoterapia es el método más eficaz en la limpieza de virus en orquídeas
cultivadas, comparado con el método de hidroterapia.
Ho:
Ninguno de los dos métodos (hidroterapia o termoterapia) son eficaces en la
limpieza de virus en orquídeas cultivadas.
5
I.4. METODOLOGÍA
I.4.1. Localización
Se realizaron los contactos con algunos cultivadores de orquídeas y se nos
autorizó visitar y analizar sus cultivos. Se visitaron cultivos comerciales y colecciones
de orquídeas en la Ciudad de Guatemala, Guatemala y sus cercanías.
Coordenadas: 14o 36’20” N; 90o 29’23” W
Altitud: 1510 msnm
Temperatura: máx. 24.5o C; min. 14o C; promedio: 14.3o C.
I.4.2. Las variables
I.4.2.1. Las variables dependientes
La presencia/ausencia de los virus: (el virus del mosaico del Cymbidium
(CymMV), el virus de la mancha anillada de Odontoglossum (ORSV), el virus del
bronceado del tomate (TSWV), el virus del mosaico del pepino (CMV) y el virus del
mosaico del tabaco (TMV) y Potyvirus) después de los tratamientos de limpieza.
I.4.2.2. Las variables independientes
Las variables independientes son: la temperatura ambiental (termoterapia) y la
temperatura del agua (hidroterapia).
I.4.3. Indicadores
 Obtención de porcentajes de contaminación viral en cultivares de orquídeas de
Guatemala.
 Determinación de virus mayormente presentes en cultivares de orquídeas en
Guatemala.
 Obtención de plantas libres de virus por medio de los métodos de hidroterapia,
termoterapia y/o cultivo de meristemos.
6
I.4.4. Estrategia metodológica: Población y muestra
Se analizaron un total de 180 orquídeas provenientes de 6 cultivares. De éstas,
se colectaron un total de 24 plantas infectadas con uno o más virus. Las plantas
infectadas se sometieron a uno o más tratamientos dependiendo de la disponibilidad de
réplicas. Se sometieron 10 plantas infectadas a hidroterapia, 8 a termoterapia y una a
cultivo de meristemos. Por medio del cultivo de meristemos se obtuvieron 30 plantas in
vitro a las que se les sometió a termoterapia. Las 30 plantas in vitro se dividieron en 5
grupos de 6 plantas que fueron sometidas a los siguientes tratamientos de termoterapia:
control, 42°C por 8 horas, 42°C por 16 horas, 42°C por 24 horas y 42°C por 48 horas.
En todos los casos el número de la muestra dependió de la disponibilidad de plantas.
I.4.5. El Método
A. Diagnóstico de enfermedades virales
Se buscaron plantas que presentaban síntomas indicativos de infección viral.
Los síntomas observados fueron: manchas anilladas, manchas cloróticas, manchas
necróticas y deformaciones. Se tomó muestras de hoja de las plantas sospechosas y se
trasladaron las muestras a las instalaciones de la Universidad del Valle de Guatemala,
para ser diagnosticadas para virus.
Se corrió pruebas ELISA (ensayo de
inmunoadsorción ligado a enzimas) para 6 diferentes virus: el virus del mosaico del
Cymbidium (CymMV), el virus de la mancha anillada de Odontoglossum (ORSV), el
virus del bronceado del tomate (TSWV), el virus del mosaico del pepino (CMV) y el
virus del mosaico del tabaco (TMV) y Potyvirus; cuya presencia ha sido reportada en
orquídeas cultivadas alrededor del mundo. Se corrieron dos tipos o variantes de pruebas
de ELISA: a- el ensayo de ELISA directo en forma de sándwich para los virus CymMV,
ORSV, TSWV, CMV y TMV. En este tipo de inmuno ensayos se utiliza una placa de
plástico tratada para aumentar la capacidad de adsorción de las proteínas que participan
en la prueba. La placa posee 96 pozos y la prueba se hace en duplicado (dos pozos por
muestra). En el ensayo, el anticuerpo contra el virus viene adsorbido en las placas o
bien se coloca como primer paso, éste atrapa al antígeno que es inmovilizado para
poder ser detectado y luego se añade otro anticuerpo, pero esta vez marcado con una
enzima que, al agregarle su sustrato, cambia o produce un color que es visible y medible
mediante un espectrofotómetro a determinada densidad óptica. En este caso la enzima
utilizada fue la fosfatasa alcalina, el color producido fue amarillo y se leyó a una
densidad óptica de 405.
El procedimiento llevado a cabo para el procesamiento y realización de esta
prueba se encuentra en el Anexo 1. b) La otra modalidad fue la llamada indirecta que se
utilizó en la detección de Potyvirus. En esta modalidad se utilizan placas similares sólo
que no se adsorbe el anticuerpo primero. En este caso se agrega la muestra en primer
lugar para que el antígeno se adsorba al plástico. Luego, se añade el primer anticuerpo
que es contra el virus directamente y luego se añade un anti anticuerpo marcado con una
enzima que reconocerá el anticuerpo añadido. Se añade el sustrato, se produce color y
se detecta con espectrofotómetro. En este caso también se utilizó la enzima fosfatasa
alcalina, se produjo color amarillo y se detectó a la misma densidad óptica de 405.
7
El procedimiento para la realización de la prueba se encuentra en el Anexo 2.
Todos los virus se detectaron con anticuerpos y conjugados de la casa Agdia.
Se utilizaron dos modalidades de ELISA no sólo porque la casa así los vende
sino porque el ELISA directo de sándwich tiene la característica de tener una gran
especificidad y una alta sensibilidad debido a la amplificación de la señal que se logra
mediante el segundo anticuerpo. En cambio, en el caso de Potyvirus, se utilizó la
modalidad indirecta que tiene una mayor sensibilidad debido a la amplificación de la
señal por la unión, en este caso, de dos anticuerpos secundarios, pero su especificidad es
reducida. En este caso, detecta varios virus diferentes pero todos pertenecientes al
género Potyvirus; no detecta uno específico como en el caso de ELISA directo de
sándwich, como por ejemplo, el virus del mosaico del tabaco o TMV.
Luego de obtener los resultados de presencia de virus, se comunicó a cada
cultivador el número e identificación de todas plantas infectadas con virus.
B. Terapias de limpieza de virus
Las plantas encontradas positivas en la etapa de diagnóstico de enfermedades
virales se trasladaron a la Universidad del Valle para ser tratadas por medio de
termoterapia, hidroterapia y cultivo de meristemos.
Se realizaron pruebas con el fin de establecer las condiciones de temperatura y
luz adecuadas para el tratamiento por medio de termoterapia, ya que este tratamiento no
se encuentra reportado en orquídeas. Se midió el tiempo en que las orquídeas
empezaban a mostrar amarillamiento de las hojas por quemadura a diferentes
temperaturas.
a) Termoterapia
 Se sometieron 10 plantas del lote de plantas infectadas a termoterapia.
 Se introdujeron las plantas completas en una incubadora a una temperatura
constante de 42°C durante 24 horas, y un fotoperiodo de 8 horas luz y 16 horas
obscuridad.
 Se monitoreó continuamente el estado de las plantas durante el lapso de
tratamiento.
 Al terminar el tratamiento, las plantas tratadas se colocaron en el invernadero de
temperatura controlada alejadas de las plantas sin tratamiento.
b) Hidroterapia:
 Se sometieron 10 plantas del lote de plantas infectadas a hidroterapia.
 Se sumergieron las plantas completas una a una en un baño de María a una
temperatura constante de 45°C durante una hora.
 Luego se extrajeron y se dejaron media hora en agua a temperatura ambiente.
 Por último se resembraron y se colocaron en un invernadero de temperatura
controlada alejadas de las plantas sin tratamiento.
8
c) Cultivo de meristemos
 Se sometieron las plantas del género Epidendrum a cultivo de meristemos.
 Se realizó la desinfección del material con el propósito de eliminar agentes
contaminantes y luego se hizo la extracción de los meristemos de cada muestra.
 La desinfección consistió en sumergir los tejidos durante una hora en una
solución de Physan (1.25 ml/l de agua), seguido de 1 minuto en etanol 70%,
luego 10 minutos en cloro comercial al 10% y tres lavados con agua estéril.
 Los meristemos extraídos se colocaron en condiciones asépticas en medios de
cultivo. El medio de cultivo utilizado fue ½ MS.
 Los explantes establecidos en el medio nutritivo se colocaron en un cuarto de
cultivo a una temperatura entre 22- 25º C con un fotoperiodo 16/8 (horas
luz/oscuridad).
d) Termoterapia luego de cultivo de meristemos
 Las plántulas obtenidas por medio de cultivo in vitro de meristemos se
propagaron y fueron luego sometidas a termoterapia.
 Se dividieron las plantas en 5 lotes de 6 plantas cada uno.
 El primer lote fue sometido a termoterapia de 8 horas a temperatura constante de
42°C.
 El segundo grupo a termoterapia de 16 horas a temperatura constante de 42°C.
 El tercero a termoterapia de 1 día a temperatura constante de 42°C.
 El cuarto a termoterapia de 2 días a temperatura constante de 42°C.
 Y el último sirvió de control. No fue sometido a terapia.
Al final de cada uno de los cuatro tratamientos (hidroterapia, termoterapia, cultivo
de meristemos y cultivo de meristemos seguido de termoterapia), las plantas fueron
diagnosticadas nuevamente, por medio de pruebas ELISA, para los virus diagnosticados
como positivos en la prueba realizada antes de las terapias.
I.4.6
La técnica estadística
La estadística propuesta para este proyecto era un análisis no paramétrico de chi
cuadrado. Sin embargo, debido a que no se lograron limpiar orquídeas con ninguno de
los dos métodos, no se realizó ninguna prueba estadística.
9
PARTE II
II.1. MARCO TEÓRICO
A. La familia Orchidaceae
Las orquídeas han fascinado al mundo durante siglos y han sido consideradas
como flores místicas; aunque algunos pueblos primitivos también la han utilizado con
fines medicinales, por ejemplo, en la Grecia antigua se creía que eran un símbolo de
virilidad. Actualmente, desde el punto de vista de la conservación, las orquídeas
constituyen un grupo estratégico ya que su belleza despierta el interés de las personas, y
por lo tanto éstas se interesan por conservarlas, aún aquellas cuyas flores no son tan
atractivas. Sin embargo, es esta misma vistosidad la que ha puesto a varias especies de
orquídeas en peligro, sobre todo debido a su extracción selectiva.
El nombre “orquídea” deriva del latín “orchis” que significa testículo, sugiriendo
la similitud que existe entre estos órganos masculinos y los bulbos de algunas especies
de orquídeas. Actualmente el término Orchis se utiliza para un género de orquídeas
europeas y de éste se deriva el nombre de la familia, Orchidaceae (Jezek 2005).
La familia, una de las más diversas, con cerca de 1,000 géneros y 20,000
especies es probablemente la segunda familia con mayor número de especies, luego de
Asteraceae. Su distribución es mundial pero con la mayor diversidad de especies en la
región tropical entre los 1000 y 2000 m SNM. Pueden encontrarse en casi todos los
hábitats, exceptuando aguas saladas y desiertos extremos (Ames y Correl 1985; Dix y
Dix 2006; Infoagro 2003).
Las orquídeas son hierbas perennes, monocotiledóneas. Las especies de esta
familia pueden ser terrestres, epífitas o rupícolas. No se conoce ninguna orquídea
parásita o carnívora. Muchas de las especies encontradas en zonas templadas son
terrestres, mientras que en zonas tropicales y subtropicales la mayoría son epífitas o
rupícolas (Ames y Correl 1985; Romero 1991; Behar & Tinschert 1998). Las raíces de
las orquídeas son generalmente carnosas y poseen un recubrimiento llamado velamen
que les permite absorber agua. El tallo puede ser largo y delgado o corto y engrosado,
hasta casi ausente. Muchas epífitas tienen tallos engrosados en la base que reciben el
nombre de pseudobulbos y algunas terrestres poseen cormos subterráneos. Las hojas
presentan nerviación paralela, y pueden ser delgadas o suculentas y hasta ausentes (Dix
y Dix 2006).
Las inflorescencias son generalmente laterales y basales o terminales, pueden ser
solitarias, racemosas, paniculadas o cimosas. Las flores tienen 3 sépalos y 3 pétalos, de
los cuales uno de los pétalos se encuentra modificado formando un labio o labelo que
distingue la familia de las orquídeas del resto de familias con flores (Dix y Dix 2006).
El androceo y gineceo se encuentran fusionados formando una columna. La mayoría de
orquídeas poseen un sólo estambre fértil y el estigma está localizado cerca del ápice de
la columna, debajo de la antera, separada de ésta por un rostelo pegajoso. El polen se
encuentra agrupado en masas pegajosas llamadas polinia o polinios. La forma de los
polinios, del labio y de la columna son de gran importancia en la identificación
taxonómica (Dix y Dix 2006; Seaton y Ramsay 2009). Un esquema de una flor de
10
orquídea y de la vista frontal y lateral de Cattleya se presenta en las figuras 1 y 2 para
poder reconocer sus partes (Seaton y Ramsay 2009).
Figura 1. Esquema de una flor de orquídea.
Fuente: Tomado de: Seaton y Ramsay 2009.
Figura 2. Flor de Cattleya vista frontal y sección lateral.
Fuente: Seaton y Ramsay 2009
11
Los frutos son generalmente cápsulas secas, su forma es variable, comúnmente
ovoide, elipsoide o cilíndrica; dehiscentes, se abren por suturas longitudinales. En la
figura 3 se pueden apreciar.
Figura 3. Cápsulas de tres especies de orquídeas
Fuente: FODECYYT 067-2007.
Las semillas son diminutas, compuestas por células indiferenciadas; el embrión
está cubierto por una capa denominada “testa” y no cuentan con material nutritivo de
ninguna clase (Jezek 2005); son producidas en cantidades enormes (algunas especies
producen más de un millón de semillas por cápsula) y se encuentran muy bien
adaptadas a la dispersión por viento debido a su poco peso (Ames y Correl 1985; Seaton
y Ramsay 2009). En la figura 4 se puede apreciar un ejemplo de una semilla de
orquídea.
Figura 4. Semilla de orquídea, compuesta por el embrión y la testa.
Fuente: Seaton y Ramsay 2009
12
B. La familia Orchidaceae en Guatemala
La historia de las orquídeas en Guatemala se remonta al año 1834 cuando
George Ure Skinner recibe una carta de Jhon Bateman pidiéndole le envíe orquídeas a
Inglaterra. El resultado de esta asociación fue la descripción e ilustración de más de 100
nuevas especies de orquídeas, incluyendo la flor nacional de Guatemala, Lycaste
skinneri. Luego de esto Skinner continuó colectando orquídeas por cerca de 33 años.
Desde los años 1840 hasta ahora hubo además otros investigadores interesados en
orquídeas que realizaron algunas colectas en lugares específicos. En 1937, Cyrus
Lundell y su equipo realizaron estudios exhaustivos en Petén. En los años de 1940,
Paul Standley y Julian Steyermark culminaron sus exploraciones con la publicación de
“Flora of Guatemala”, en la cual se incluye “Orchids of Guatemala” de Oakes Ames y
Donovan Correl (1952, 1953). En esta última se incluyen 542 taxa, seguido de un
suplemento escrito por Correl, donde se incluye finalmente 567 taxa de la familia
Orchidaceae (Dix y Dix 2000).
Sin embargo, aun cuando la publicación de Ames y Correl sigue siendo el
referente principal para esta familia de la flora de Guatemala, las investigaciones han
seguido en todo el territorio nacional, así como en los países vecinos. Las colectas de
nacionales y extranjeros depositadas en los diferentes herbarios han permitido la
ampliación del número de orquídeas presentes en el país. En base a las nuevas colectas
en campo y especímenes depositados en herbarios, en 2000, Margaret A. Dix y Michael
W. Dix presentan “Orchids of Guatemala: A Revised Annotated Checklist”. En este
documento los autores incluyen 734 taxa, de las cuales 207 son reportes de especies
nuevas o recientemente descritas. Y, según los autores, se calcula que la lista aumenta
de 5 a 10 especies anualmente.
Esta familia presenta una gran variedad de formas, tamaños, colores de flor y
hoja, fragancias y es desde el punto de vista evolutivo la que ofrece las características
más avanzadas, por este motivo se dice que se encuentra en pleno proceso de
diversificación, lo cual se refleja en su abundancia y diversidad de especies (Romero
1991; Infoagro 2003).
Como otros datos importantes de la familia en nuestro país, es la fundación de la
Asociación Guatemalteca de Orquideología (AGO) en el año 1937, la Asociación de
Orquideología de Alta Verapaz en 1981 y la Asociación de Orquideología de Baja
Verapaz en 1982 (Dix y Dix 2000).
En Guatemala es considerada la familia de epífitas predominante ya que
comprende entre el 25 y 63% de la riqueza de epífitas en bosques naturales (Dix & Dix
2006). La mayor parte de especies encontradas en zonas templadas son terrestres,
mientras que en los trópicos y subtrópicos la mayoría son epífitas o litótfitas (Ames &
Correl 1981; Romero 1991).
Otro dato importante de la familia Orchidaceae en Guatemala es que se
encuentra en el Apéndice II de CITES para el país. Alrededor 28.000 especies de
plantas están amparadas por la CITES contra la explotación excesiva. Las especies se
agrupan en los Apéndices según su grado de amenaza debido al comercio internacional.
13
En el caso de las orquídeas la familia completa se encuentra bajo regulación de
explotación (CONAP 2005).
C. Cultivo de las orquídeas
Las orquídeas son un grupo en peligro de extinción. Esto se debe a diversos
factores, entre ellos: su complicado proceso de germinación (necesidad de una simbiosis
con un hongo) y a su alta sensibilidad a los cambios en el ambiente. Además, y
probablemente más alarmante, es la tala incontrolada y el avance de la frontera agrícola
en todo el mundo, principalmente en los trópicos donde se encuentra la mayor
diversidad de orquídeas. Otra amenaza importante son los “cazadores” de orquídeas,
que se dedican a extraer las orquídeas del bosque y venderlas a un precio menor que el
de orquídeas cultivadas (Jezek 2005).
Debido a su belleza y al elevado costo que alcanzan las orquídeas actualmente,
son motivo de cultivo por particulares e industriales como flor cortada y como planta
ornamental; por ello esta familia posee una creciente importancia económica a nivel
mundial. Sin embargo, en Guatemala aún son un recurso que no se maneja, explota y
que se encuentra en desaparición (Dix & Dix 2006).
El cultivo de las orquídeas es posible en todas partes y está especialmente
desarrollado desde la mitad del siglo pasado porque muchos híbridos interespecíficos e
intergenéricos fueron creados y comercializados con éxito por sus obtentores. La
explotación comercial para flor cortada y el cultivo en maceta afecta a unos cincuenta
géneros cuyo cultivo se practica en muchos países (Infoagro 2003). Entre los géneros
más cultivados se encuentran Cattleya, Cymbidium, y Phalaenopsis; esto se debe a la
facilidad de su cultivo y a la gran cantidad de híbridos que presentan (Infoagro 2003,
Guaragna et al. 2006).
Hay híbridos que brindan una buena oportunidad de rentabilidad anual. Por
ejemplo, híbridos de Cattleya dan cinco o seis flores por planta al año; Cymbidium
posee un promedio de tres varas por planta anualmente, cada vara produce entre siete y
doce flores y Phalaenopsis, da una o dos varas por planta al año, con aproximadamente
veinte flores. Normalmente, las orquídeas florecen una vez al año y la época está
determinada por la genética de la planta. Cada híbrido florece una vez al año pero, en
algunos géneros se han desarrollado híbridos que florecen en distintos momentos del
año. Esto da la posibilidad de tener flores todo el año.
Entre los principales países productores de orquídeas cabe destacar: Brasil,
China, Costa Rica, Estados Unidos, Filipinas, Indonesia, Países Bajos y Tailandia
(Infoagro 2003). Sin embargo, el aumento de la demanda en los países industrializados
ofrece una oportunidad para el impulso de mercados de exportación en otros países en
desarrollo.
D. Híbridos de orquídeas
En la naturaleza existen híbridos naturales de orquídeas, los cuales son
generalmente interespecíficos, es decir, plantas de diferente especie pero del mismo
género. Se han encontrado híbridos en Guatemala de los géneros Lycaste, Maxillaria y
Cattleya (Dix y Dix 2006). Sin embargo, en Guatemala la hibridación de especies ha
14
sido importante en la comercialización de orquídeas. Se han cultivado híbridos
interespecíficos e intergenéricos con éxito. Por ejemplo, Lycaste skinneri (Bateman ex
Lindl) Lindl., cuya variedad alba es la flor nacional del país, ha servido para producir
más de 250 híbridos que se cultivan hoy en Europa, Asia, Australia y América (Dix y
Dix 2006).
La historia de la hibridización es tan vieja como el cultivo de orquídeas. Los
primeros híbridos en crecer en invernaderos europeos eran miembros del género
Cattleya, en 1852. Sin embargo, era muy difícil producir plántulas por medio de las
semillas de estos híbridos. Pero tras el descubrimiento de la siembra antiséptica por
Knudson en 1922, la cantidad de hibridización artificial aumentó enormemente. Hasta
la fecha, el número de híbridos de la familia Orchidaceae se estima en una cifra mayor a
25,000. Esto comprende híbridos naturales y artificiales, pero siendo muchísimo mayor
el número de híbridos artificiales (Jezek 2005). Los cultivadores de orquídeas han ido
perfeccionado la hibridación, mediante hibridaciones sucesivas, para obtener flores más
grandes, más vistosas, con mayor número de flores o inflorescencias, más resistentes a
plagas o enfermedades, con hojas más llamativas, etc, y han ayudado a que estas
características positivas desde el punto de vista comercial, se mantengan por
generaciones. Entre los híbridos más populares, debido a su gran valor ornamental,
están los de los géneros Cymbidium, Paphiopedilum, Phalaenopsis, Cattleya, Laelia,
Vanda, Odontoglossum y en menor grado Dendrobium y Oncidum (Jezek 2005). El
cultivo de híbridos se ve también beneficiado ya que los híbridos reproducidos
artificialmente de los géneros: Cymbidium, Dendrobium, Miltonia, Odontoglossum,
Oncidium, Phalaenopsis y Vanda no están sujetos a la disposición del Apéndice II de
CITES, por lo que pueden ser comercializados internacionalmente (CITES 2007).
E. Enfermedades y plagas en orquídeas
Las condiciones de cultivo de orquídeas en invernaderos son aptas para su
propicio crecimiento; sin embargo, también es propicio que se den en él muchas
enfermedades y plagas. Estas enfermedades y plagas son consecuencia de un riego
incorrecto, mala ventilación, hábitos de fertilización incorrectos y otros errores de
cultivo. En función de su origen hay cinco tipos de enfermedades: las provocadas por
animales, hongos, bacterias o virus y las de origen fisiológico (Jezek 2005).
Las enfermedades causadas por insectos y hongos pueden ser controladas por
medio de insecticidas y fungicidas que resultan en la mayoría de casos efectivas. Las
infecciones por bacterias se ven provocadas por fríos húmedos de larga duración. Una
solución puede ser intensificar la ventilación y limitar el riego temporalmente. Las
enfermedades de origen fisiológico se deben a la falta de condiciones óptimas de
nutrientes, luz, agua, ventilación, temperatura, etc. La solución a estas enfermedades es
mantener las condiciones de crecimiento óptimas para la especie cultivada. Por último,
las enfermedades virales no tienen aún una cura, la única manera de combatirlas es
eliminando a las plantas infectadas o mediante la reproducción in vitro de células
presumiblemente sanas de la planta para originar más plantas. Se puede saber si una
planta está infectada realizando un examen para detectar la presencia de virus. Es
importante saber qué virus es para poder determinar cómo se transmite y evitar su
dispersión mediante el control o manejo de este transmisor. Además, hay que tomar
medidas preventivas en el manejo de las plantas como desinfectar los utensilios
15
utilizados para el corte de flores y hojas (Jezek 2005), usar desinfección de manos, de
vestimenta en algunos casos, etc.
F. Enfermedades virales en orquídeas
La mayoría de los géneros de orquídeas pueden ser afectados por uno o más
virus, lo cual es un grave problema sobre todo por el incremento en la importación y el
rápido intercambio de plantas por comerciantes y entusiastas ya que esto favorece la
introducción y dispersión de enfermedades provocadas por virus en plantas de
invernaderos y colecciones (Report on plant disease 1990). En los últimos años los
virus han tomado gran relevancia dentro del cultivo de orquídeas. La alta incidencia de
estos patógenos puede ser atribuida a la facilidad de transmisión por herramientas
usadas en las prácticas culturales, de plantas infectadas que no presentan síntomas y al
desconocimiento popular de prácticas preventivas de estas enfermedades (Cárdenas
2000). Otro factor de mucha importancia es la gran popularidad y el aumento del
cultivo de orquídeas, lo cual ha hecho surgir invernaderos con gran número de plantas
colocadas en condiciones de alta humedad y temperatura, lo cual favorece el
aparecimiento y dispersión de infecciones virales; a esto se le suma la continua adición
de especímenes de diferentes orígenes sin previa cuarentena y que pueden estar
contaminados.
Más de veinticinco virus han sido reportados en orquídeas (Moreira et al. 1999,
Cárdenas 2000). Frecuentemente las plantas infectadas por virus suelen florecer con
menos eficiencia, pierden vigor y producen flores de menor calidad que las plantas sana,
afectando el valor de exhibición o comercial de las plantas (Report on plant disease
1990; Hu et al. 1993). Además los virus causan una gran cantidad de anormalidades en
la planta, como cambios en la forma, color y apariencia de la misma. Dos de los efectos
más notables son el amarillamiento (clorosis) por inhibición de la formación de
cloroplastos y muerte de los tejidos (necrosis). Estos síntomas pueden ocurrir
separadamente o en combinación. También producen debilitamiento y reducción de la
capacidad productiva, enanismo y lo más importante en el caso de las orquídeas,
manchas y/o deformación de la flor. En algunas especies, los virus manifiestan
síntomas sólo en los puntos de inoculación; sin embargo, sus efectos pueden ocurrir
tiempo después en cualquier parte de la planta y causar mucho daño (Cárdenas 2000).
Sin embargo, a veces, la infección por virus puede ser asintomática. En estos casos los
síntomas pueden aparecer mucho después de la infección, manifestarse únicamente en
las flores o no presentar nunca síntomas (Jezek 2005; Labrín et al. 2005). En este
último caso el riesgo es el de propagar la infección viral a otras plantas por medio de los
utensilios de corte usados en invernaderos, por contacto entre plantas o por medio de
vectores como áfidos, ácaros o trips.
Cymbidium mosaic potexvirus (CyMV) y Odontoglossum ringspot
tobamovirus (ORSV, también llamado TMV-O) son considerados los virus más
importantes desde el punto de vista económico y de prevalencia (Wisler 1989; Moreira
et al. 1999; Cárdenas 2000; Labrín et al. 2005; Guaragna et al. 2006). Estos virus
afectan una amplia gama de géneros de orquídeas y son transmitidos por contacto entre
plantas o por medio de las herramientas utilizadas en el invernadero (Wisler 1989;
Report on plant disease 1990; Cárdenas 2000).
Estos dos virus producen una serie de síntomas que incluyen estrías necróticas,
manchas cloróticas y patrones necróticos lineares en hojas (Figura 5 y 6), así como
16
necrosis en flores en el caso de CyMV; y veteado de la flor en el caso de ORSV, ya que
los síntomas foliares son frecuentemente desapercibidos o están ausentes. Las flores
afectadas pueden sufrir deformación severa, el pigmento normal de los sépalos y pétalos
es reemplazado por manchas irregulares de un color de mayor o menor intensidad al de
la flor en estado normal (Fig. 7). No hay un patrón definido para este estriado. En otras
plantas este virus puede presentar manchas, estrías y anillos cloróticos o necróticos
(Wisler 1989; Cárdenas 2000; Labrín et al. 2005). Es común encontrar una
combinación de estos virus en una misma planta, una infección mixta de CyMV y
ORSV, ya que estos dos virus son biológicamente similares y con características
epidemiológicas similares (transmisión mecánica) (Freitas-Astúa 2003). Los síntomas
de la infección mixta son los mismos que para cada uno de ellos individualmente, éstos
son: anillos cloróticos a necróticos y estriado color negruzco en la superficie foliar
(Labrín et al. 2005).
Figura 5. Daño provocado en hojas por Cymbidium mosaic virus (CyMV)
Fuente: FODECYT 067-2007
Figura 6. Daño provocado en hojas por Odontoglossum ringspot Tobamovirus (ORSV) en a)
una hoja de Cymbidium (American Orchid Society 2008) y b) una hoja de Phalaenopsis.
b.
a.
Fuente: FODECYT 067-2007
Fuente: FODECYT 067-2007
Un ejemplo de los daños causados en flores se presenta en la figura 7. Cambios
en la coloración como anillos o estriaciones de diferentes tonalidades se pueden
observar, a veces hacen la apariencia de estas flores más interesantes pero
lamentablemente esos rasgos rápidamente se vuelven necróticos haciendo que la flor
pronto muera y no pueda ser comercializada.
17
Figura 7. Daño provocado por a) Virus de la mancha anillada del Odontoglosum
(ORSV o TMV-O) en una flor de Cymbidium b) la combinación de ORSV y el virus del
mosaico del Cymbidium (CymMV) en una flor de Cymbidium y c) ORSV en una flor
de Cattleya.
a)
b)
c)
Fuente: American Orchid Society 2008.
Debido a su amplia distribución, estos dos virus han recibido mucha atención de
los cultivadores y coleccionistas de orquídeas; sin embargo, se han encontrado al menos
ocho géneros de virus en orquídeas en el mundo (Cucumovirus, Nepovirus, Potexvirus,
Potyvirus, Rhabdovirus, Tobamovirus, Tombusvirus y Tospovirus). Entre los virus más
conocidos de estos géneros se pueden encontrar:
Cucumber Mosaic Virus (CMV), reportado en Phalaenopsis (Wisler 1989).
Capaz de infectar una amplia variedad de plantas de diferentes familias. Su distribución
mundial no es conocida y produce síntomas que incluyen el aparecimiento de rayas
blancas o jaspeados en las flores y mosaico o estriados en las hojas. Este virus puede
ser transmitido principalmente por pulgones o áfidos (Freitas-Astúa 2003) de forma no
persistente o semi persistente. Este virus infecta a más de 190 especies repartidas en
más de 40 familias de plantas. Las especies más afectadas son las hortalizas como las
cucurbitáceas (pepino, melón, sandía, güisquil, calabaza, chilacayote, etc.), tomate,
chile y banano; y ornamentales como crisantemos, geranios y lirios. Los síntomas son
muy variables de especie a especie; sin embargo, la mayoría presenta lesiones cloróticas
o necróticas, amarillamiento y deformaciones en las hojas (Ferreira y Boley 1992).
Algunos síntomas virales se pueden observar en la figura 8. El CMV es uno de los
virus multirraciales, con mayor distribución a nivel mundial. Se puede diseminar
mecánicamente, por injertos o por medio de semillas (Rivera 1998, Cárdenas 2003a).
18
Figura 8. a) Cattleya percivaliana con síntomas de CMV, b) hoja de Coelogyne
rochussenii con síntoma de CMV, c) hojas de Laelia lobata con ORSV y CMV, d)
hojas de Epidendrum con síntomas de ORSV y CMV y e) CMV en Pescatoria wallisii
a)
d)
b)
c)
e)
Fuente: American Orchid Society 2008.
Bean Yellow Mosaic Virus (BYMV), fue reportado en Alemania occidental,
Estados Unidos, Japón (Wisler 1989) y más recientemente en Australia (Gibbs et al.
2000) y Costa Rica (Ortiz 2002). Fue reportado en los años 1930s en Gran Bretaña
como “Pea Mosaic” y más recientemente se reporta en orquídeas de los géneros
Calanthe, Masdevallia y en Dactylorhiza (Skelton et al. 2006; Hammond y Lawson
1988). Al igual que CMV, posee una gran cantidad de hospederos además de orquídeas
y produce síntomas que incluyen la formación de manchas necróticas o cloróticas en la
superficie de las hojas, así como mosaico y moteado en las mismas (Wisler 1989; Ortiz
2002; Skelton et al. 2006). La transmisión de este virus es mecánica o por áfidos de
manera no persistente (Kennedy et al. 1962 en Ortiz 2002; Hammond y Lawson 1988)
por al menos 20 especies. Este virus se puede transmitir por semilla y polen; sin
embargo, en orquídeas no se ha informado su transmisión por semilla (Freitas-Astúa
2003). La figura 9 muestra algunos de los síntomas encontrados en plantas infectadas.
19
Figura 9. Hoja de Dactylorhiza foliosa con síntomas del virus del mosaico amarillo de
la judía (BYMV).
a)
Fuente: Skelton et al. 2006.
Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV), reportado para orquídeas en California,
Florida y Hawaii (Hu et al. 1993; Sclar & Anisco 2001; Baker et al. 2007A), para los
géneros Phalaenopsis y Oncidium. Este virus pertenece al grupo de los Tospovirus, es
uno de los más cosmopolitas y posee uno de los más amplios rangos de hospederos,
cerca de 800 especies (Baker et al. 2007B). Los síntomas encontrados en orquídeas
incluyen manchas cloróticas con forma de anillo y lesiones necróticas de 1-2 cm de
diámetro (Hu et al. 1993; Baker et al. 2007A). Este virus es transmitido por trips
(Baker et al. 2007B), principalmente por Frankliniella occidentalis. La figura 10
muestra los síntomas que presentan las plantas con infección por TSWV.
Figura 10. Síntomas de infección con Tospovirus en una hoja de Phalaenopsis
b) síntomas de TSWV en una hoja de Phalaenopsis
a)
b)
Fuente: Baker et al. 2007B
Otro Tospovirus importante en orquídeas es el llamado Virus de las manchas
necróticas de la Impatiens (INSV). Este virus no se ha encontrado en orquídeas de
Guatemala hasta el momento pero causa manchas anulares similares a las de TSWV,
debilita la planta y finalmente la mata.
20
Otro virus importante en orquídeas es el Orchid fleck rhabdovirus (OFV). Fue
descubierto en Japón en plantas del género Cymbidium que tenían manchas cloróticas y
necróticas. Luego se reportó su presencia en Australia, Dinamarca, Alemania, Corea y
Estados Unidos, causando manchas y anillos cloróticos y necróticos en varios géneros
de orquídeas, especialmente en Dendrobium, Maxillaria, Cymbidium y Odontoglossum.
El virus pertenece a la familia Rhabdoviridae y se encuentra ampliamente distribuido.
Afecta a la familia Orchidaceae y a otras familias como Chenopodiaceae, Solanaceae y
las leguminosas. El virus se transmite por un ácaro, Brevipalpus californicus, de
manera persistente y puede también transmitirse por contacto entre plantas. La
transmisión es más eficiente a través de adultos y ninfas (Kondo et al. 2003, Kitajima et
al. 2005). El virus se aloja en la savia de la planta por lo que su transmisión puede ser
mecánica (Kondo et al. 2006; Kubo et al. 2009; Freitas-Astúa 2002). Ejemplos de los
síntomas que causa el OFV en orquídeas se presentan en la figura 11.
Figura 11. a) Síntomas de OFV en hojas, b) síntomas de OFV en bulbos, c) síntomas de
OFV en hojas de Dendrobium , d) síntomas de OFV en hoja de Cymbidium y e)
sintomatología de OFV en hojas de Laelia.
a)
b)
c)
d)
e)
Fotos de John Dooley 2011
Este virus, el Orchid fleck virus (OFV), tiene un genoma bipartite inusual de
ARN en sentido negativo con una secuencia similar a la de los nucleorabdovirus. Este
genoma consta de dos moléculas de ARN de una banda que tienen una longitud de 6413
y 6001 nucleótidos respectivamente, con un marco de lectura abierto (ORF) en sentido
complementario. También se encontraron similitudes entre el OFV y los rhabdovirus en
la complementariedad de las secuencias en las dos partes terminales de cada segmento
de ARN (las secuencias terminales son 39-UGUGUC—GACACA-59) y en las
secuencias intergénicas conservadas.
Por esto se propuso un nuevo género
Dichorhabdovirus dentro de la familia Rhabdoviridae del orden de los Mononegavirales
21
y con el OFV como el miembro prototipo y especie tipo (Kondo et al. 2006). La figura
12 muestra un ejemplo de la morfología del virus mediante una fotografía electrónica.
Figura 12. Micrografía electrónica de viriones de OFV purificado. Un aumento
del virus se encuentra en el área dentro del rectángulo.
Tomado de: Kondo et al. 2006.
G. Detección de virus en orquídeas
El diagnóstico visual de virus en hojas y flores de orquídeas es sumamente
difícil ya que los síntomas de las enfermedades virales son progresivos y varían
dependiendo de la:
- Combinación virus (tipo y cepa de virus)
- Planta hospedera (especie)
- Condiciones ambientales (luz, temperatura).
- Estado fisiológico y condiciones nutricionales del hospedero
Estos factores hacen variar la duración en tiempo entre la infección y la
aparición de síntomas. Algunos virus, bajo ciertas condiciones no causan la aparición
de síntomas, pero sí se manifiesta una reducción del vigor en la planta. Algunos factores
genéticos son los responsables de la tolerancia de algunas especies a ciertos virus,
mientras que en otras hay un alto nivel de susceptibilidad. Estos factores hacen
imposible la determinación de la enfermedad si alguna planta, en especial presenta
resistencia genética, ya que puede no manifestar síntomas aunque esté infectada (Report
on Plant Disease 1990; Cárdenas 2000).
Además, es importante recalcar que en muchas ocasiones los síntomas
observados en una planta no son causados únicamente por un solo virus. En muchos
casos la planta puede presentar dos o más virus. Esto también dificulta determinar la
enfermedad viral y los síntomas que corresponden a cada uno de los virus. Sumado a
éstos, los síntomas de distintos virus pertenecientes a familias diferentes pueden
22
también ser similares. Por lo general, los síntomas como manchas necróticas o
cloróticas son generales para muchos tipos de virus.
Los síntomas de virus en la familia Orchidaceae son tan diversos como la familia
misma y pueden expresarse levemente o provocar severas distorsiones en flores y hojas.
Además, los síntomas virales pueden ser confundidos con síntomas provocados por
otros patógenos o por deficiencias nutricionales (Wisler 1989; Report on plant disease
1990); por ejemplo, síntomas típicos de virus son manchas o líneas cloróticas o
necróticas; sin embargo, enfermedades causadas por hongos y bacterias, así como
deficiencias de luz o déficit hídrico pueden causar síntomas similares (Wisler 1989). Es
por estas razones que se han desarrollado diversas técnicas de detección de virus en
plantas. Entre éstas se encuentran el uso de plantas indicadoras, microscopía electrónica
y de luz y técnicas serológicas como inmuno difusión, pruebas ELISA (Wisler 1989).
Estas pruebas son muy útiles cuando se quieren evaluar varias muestras y necesitan
sensibilidad y especificidad. Son muy útiles cuando se cuenta con anticuerpos de
calidad. Finalmente podemos encontrar técnicas moleculares como PCR que son útiles
principalmente en trabajos en los que se necesita mucha sensibilidad y especificidad.
Los métodos serológicos que emplean enzimas como marcadores se conocen
como ensayos inmunoenzimáticos. La prueba de ELISA (Enzyme-linked
immunosorbent assay) forma parte de estos ensayos (Batista et al. 2008). Fue descrita
por primera vez por Clark y Adams en 1977 (Salazar 1990). Esta técnica consiste en la
inmovilización en una fase sólida, del antígeno o el anticuerpo, sobre el cual se
adicionan, de forma secuencial y previo lavado para eliminar los elementos
deficientemente fijados o no fijados, los demás componentes de la reacción (ver Fig.
13). La presencia de la reacción antígeno-anticuerpo se revela mediante la adición del
sustrato específico de la enzima y la consiguiente formación de productos coloreados,
que permiten la evaluación de los resultados de forma visual, cualitativamente, o
mediante la lectura de la absorbancia en un espectrofotómetro denominado lector de
placas ELISA (Wisler 1989 ; Batista et al. 2008).
Existen numerosos tipos de ELISA, que pueden agruparse en dos categorías:
ensayos directos o indirectos. En los ensayos directos se utilizan como conjugados los
anticuerpos específicos, que reconocen al patógeno, marcados con la enzima, mientras
que en los indirectos se emplean como conjugados anticuerpos que reaccionan con los
anticuerpos de la especie animal en la que se produjeron los específicos del patógeno.
Dentro de las numerosas variantes descritas, las denominadas sándwich de doble
anticuerpo (ELISA-DAS) (ver Figura 13) y de doble anticuerpo indirecto (ELISADASI) son las más utilizadas para el diagnóstico rutinario de fitopatógenos (Batista et
al. 2008; Salazar 1990).
Esta técnica es muy utilizada para la detección de virus tanto en cultivos
agrícolas como ornamentales. Se ha utilizado ampliamente tanto para diagnosis como
para investigación debido a su relativa facilidad, bajo costo y confiabilidad.
23
Figura 13. Pasos del procedimiento de ELISA directo. I = savia de planta
infectada con virus y S = savia de planta sana.
Fuente: Salazar 1990.
H. Terapias para tratamiento de virus
Los virus son uno de los agentes patógenos que causan mayores pérdidas en un
gran número de cultivos a nivel mundial (Over de Linden y Eliott 1971). Cuando las
plantas infectadas por virus son propagadas de forma vegetativa, el patógeno pasa
rápidamente de una generación a la próxima, por lo que toda una población de plantas
puede verse infectada en poco tiempo (Dodds y Roberts 1990).
El diagnóstico de plantas enfermas puede indicar la presencia de uno o más virus
en una planta. Cuando no se cuenta con plantas madre libres de patógenos, o cuando se
trata de especies o variedades difíciles de reproducir, es posible aplicar técnicas para la
eliminación de los mismos, obteniendo de esta manera material sano que pueda ser
reproducido asexualmente. En la actualidad se cuenta con varios procedimientos para la
eliminación de virus en plantas enfermas, entre estos se encuentran:
Quimioterapia. Existen reportes acerca de la curación de plantas infectadas con
virus por medio de tratamientos químicos. Debido a que el metabolismo del virus está
estrechamente relacionado con el hospedero, los químicos utilizados para interferir con
la replicación viral son muchas veces fitotóxicos. Algunos de los químicos utilizados
son: citovirina, virazol o virazole, ácido fosfoacético, derivados de purinas y pirimidinas
(principalmente 2-tiouracilo y 8-aguanina) y amantadita (Anmirato et. al. 1990). En
orquídeas se ha reportado el uso exitoso de Virazole a base de ribavirina en cultivo in
vitro como tratamiento para infecciones virales (Albouy et al. 1988). Esto se ha
24
reportado para la eliminación exitosa de ORSV en orquídeas utilizando concentraciones
de 35 mg/l (Toussaint et al. 1993). Sin embargo, el método es laborioso, caro y no
asegura el 100% de desinfección (Freitas-Astúa 2003). Esta técnica se utiliza muchas
veces complementada con la técnica de cultivo de meristemos en orquídeas (FreitasAstúa 2003), en cítricos (Sanjeev et al. 2007), entre otros.
Cultivo de meristemos. Este procedimiento se basa en la utilización de
pequeñas secciones de la yema apical de las plantas como explante, incluyendo el domo
meristemático y el primordio foliar (Hartmann et. al. 2002); también pueden utilizarse
meristemos de raíz (Dodds y Roberts 1990). Se utiliza principalmente para la
eliminación de virus sistémicos, viroides, hongos y bacterias superficiales. Esta técnica
es posible debido a que el meristemo, por ser un tejido de rápido crecimiento, está libre
de patógenos, probablemente debido a la alta concentración de auxinas presentes que
puede impedir su reproducción y a que la replicación en el caso de los virus es más lenta
que la mitosis de las células de éste. Esto es posible aunque el resto de la planta este
infectado, siendo así que mientras más pequeño el explante utilizado, más efectiva es la
eliminación del patógeno. Se ha observado que meristemos de longitudes de 0.10 a
0.15 mm han provisto una eliminación del 100 % de virus, disminuyendo este rango a
medida que se tienen porciones meristemáticas de mayor tamaño. Por otra parte,
explantes más pequeños son más difíciles de establecer (Hartmann et al. 2002).
En el caso específico de las orquídeas se recomienda utilizar como explante,
brotes jóvenes de 3 a 5 cm de longitud (ver figura 14), los cuales deben ser cortados y
separados de la planta madre con bisturí previamente desinfectado. A este brote, luego
de la desinfección, se le extraen las yemas laterales y el meristemo apical para su
siembra in vitro (Alvarado 2000).
Figura 14. Brote lateral de Cattleya que puede ser utilizado como explante para
el cultivo de meristemos.
Fuente: Alvarado 2000.
Termoterapia. La termoterapia es una técnica en la cual se emplean altas
temperaturas para la erradicación de enfermedades en plantas. Está documentado el uso
de esta técnica para el control de hongos en semillas, pre-tratamiento de porta-injertos
25
para eliminación de virus y principalmente eliminación de virus en plantas completas.
La temperatura y tiempo de exposición al calor ya sea por medio de aire o agua caliente
depende del cultivo y tipo de virus; generalmente se utilizan temperaturas entre 35 – 40º
C y exposición de varias semanas para eliminación de virus en plantas y tratamientos
con agua caliente (49 – 57 º C) para semillas (Hartmann et al. 2002).
Esta técnica es complementaria a la extracción de meristemos apicales (de raíz,
terminal o de tallos) in vitro. La combinación de técnicas incluyen el crecimiento de
plantas de 6-12 semanas a 30–40º C antes de la extracción de meristemos de las plantas,
su introducción in vitro y luego su evaluación. Puede también incluir la extracción de
meristemos pequeños previo al tratamiento de calor, evaluación de la presencia de virus,
luego exponer esos explantes a temperaturas de 30-40º C por varias semanas y luego
evaluar si se ha eliminado el virus. A esas temperaturas los virus son inactivados por el
calor y los tejidos de las plantas pueden seguir creciendo (Dodds y Roberts 1990).
I. Limpieza de virus en orquídeas
En el caso de las orquídeas, sólo existen medidas preventivas para evitar
enfermedades por virus, ya que por su naturaleza y velocidad de mutación hasta hoy no
se tienen tratamientos efectivos para éstos. Plantas de mucho valor genético afectadas
de virus sólo tienen la posibilidad de rescatarse mediante la limpieza con cultivo in vitro
de tejido meristemático (Vázquez 2000). Esta técnica fue reportada por primera vez en
1950, para eliminar CyMV de plantas de Cymbidium infectadas; sin embargo, años más
tarde Burnett (1984) descubrió que la infección no fue totalmente erradicada en las
plantas obtenidas después del procedimiento (Wisler 1989). Esto se debe a que las
técnicas utilizadas para el cultivo de meristemo fueron desarrolladas para la
propagación en masa de las orquídeas, no para el control de virus en las mismas. Ya
que únicamente el tejido meristemático se encuentra libre de virus, es necesario hacer
cortes muy pequeños, lo cual hace sumamente difícil el crecimiento de los mismos aún
en el medio adecuado. Al hacer cortes demasiado grandes se corre el riesgo de
transmitir el virus que se desea eliminar a la nueva generación de plantas producidas.
Se ha sugerido que la adición de reguladores de crecimiento al medio de cultivo puede
suprimir los virus que se encuentren en el tejido cultivado (Cybularz-Urban & HanusFajerska 2006); sin embargo, esta técnica tampoco logró erradicar completamente los
virus en tejidos infectados.
En orquídeas se ha reportado la limpieza de algunos ejemplares por medio de la
combinación de cultivo de meristemos, a veces combinado con otra técnica. Tal es el
caso de la eliminación de ORSV por medio de cultivo de meristemos combinado con el
uso de un antiviral ribavirin reportado por Freitas-Astúa (2003). Otro ejemplo es la
eliminación de CMV y CymMV de Vanilla planifolia por medio de cultivo de
meristemos reportado por Retheesh y Bhat (2010).
26
PARTE III
III.1 RESULTADOS
A. Diagnóstico de enfermedades virales
Se analizaron un total de 180 orquídeas provenientes de 6 cultivares. A cada planta se
le realizó una prueba de ELISA para los virus siguientes: virus del mosaico del
Cymbidium (CyMV), el virus de la mancha anillada de Odontoglossum (ORSV), el
virus del bronceado del tomate (TSWV), el virus del mosaico del pepino (CMV), el
virus del mosaico del tabaco (TMV) y Potyvirus (Poty). Se encontró un total de 36
orquídeas infectadas (20%). No se encontró orquídeas infectadas con TSWV, CMV, ni
Potyvirus. Los resultados completos se presentan en el Anexo 3. En el cuadro 1 se
presenta el número de plantas infectadas, el porcentaje de infección y sintomatología
presente en las plantas. Los síntomas fueron observados en orquídeas cultivadas en
invernaderos. Las imágenes de síntomas pueden observarse en el Anexo 4.
Cuadro 1: Número de plantas positivas para los virus analizados
Virus
Número de
plantas
infectadas
Porcentaje de
Porcentaje de infección
infección sobre el sobre el total de plantas
total de plantas
infectadas
analizadas
Sintomatología
en hojas
CymMV (únicamente)
22
12.15 %
61.11 %
Líneas cloróticas
ORSV (únicamente)
2
1.10 %
5.56 %
Manchas cloróticas
TMV (únicamente)
3
1.66 %
8.33 %
Manchas y/o líneas
cloróticas
CMV
0
0%
0%
---
TSWV
0
0%
0%
---
Potyvirus
0
0%
0%
---
CymMV/ORSV
4
2.21 %
11.11 %
Manchas y líneas
cloróticas
ORSV/TMV
1
0.55 %
2.78 %
Líneas cloróticas,
manchas cloróticas y
manchas necróticas.
CymMV/ORSV/TMV
4
2.21 %
11.11 %
Líneas cloróticas,
manchas cloróticas y
manchas necróticas.
Total
36
19.89 %
100%
FUENTE: FD 067-2012
Se encontró que el 20% de todas las plantas analizadas estaban infectadas con
uno o más virus y que el 33% de las plantas infectadas presentaron infección mixta por
dos o más virus. La figura 15 presenta la frecuencia de los diferentes virus que se
encontraron en las plantas colectadas
27
Figura 15. Frecuencia de los diferentes virus encontrados en las muestras de orquídeas
colectadas.
Fuente: FODECYT 067-2007.
Estas frecuencias corresponden a un 53% de veces que se encontró a CymMV,
un 31% a ORSV y en un 16% de casos se encontró a TMV. La figura 16 presenta el
número de plantas infectadas por 1, 2 ó 3 virus. El virus más comúnmente encontrado
fue el virus del mosaico del Cymbidium (CyMV). Se puede observar que la presencia
de infecciones mixtas por 2 o 3 virus simultáneamente no es muy diferente. Se
encontraron infecciones mixtas con CymMV y ORSV en un 55.56% y con CymMV y
TMV en un 44.44%.
Figura 16. Número de plantas de orquídeas con infecciones mixtas por 2 y 3 virus
simultáneamente.
Fuente: FODECYT 067-2007.
28
La figura 17 muestra la distribución de la presencia de virus en las 36 plantas de
orquídeas colectadas para el estudio.
CymM
V/OR
SV/ T
MV
ORS
V/TM
V
CymM
V/OR
SV
Potyv
irus
TSW
V
CMV
TMV
(únic
amen
te)
ORS
V (ún
icam
ente)
70.00%
60.00%
50.00%
40.00%
30.00%
20.00%
10.00%
0.00%
CymM
V (ún
icam
ente)
Porcentaje (%)
Figura 17. Gráfica de la distribución de la presencia de virus en orquídeas infectadas.
Fuente: FODECYT 067-2007.
El virus encontrado más comúnmente fue el virus del mosaico del Cymbidium
(CyMV) con un porcentaje de 61.11 %. También se pudo encontrar el virus de la
mancha anillada del Odontoglossum (ORSV) y el virus del mosaico del tabaco (TMV).
Al ir a recoger las plantas infectadas a los diferentes invernaderos, únicamente
nos dieron 24 plantas de las 36 infectadas. Las orquídeas que se trasladaron al
invernadero de la UVG para ser sometidas a los diferentes tratamientos se presentan en
el cuadro 2. Estas plantas fueron seleccionadas para someterlas a hidroterapia,
termoterapia y a cultivo de meristemos. Se dividieron las plantas para someterlas al
tratamiento de hidroterapia y termoterapia pero de algunas no se tuvo suficiente material
y para cultivo de tejidos únicamente se pudo utilizar una planta ya que los meristemos
estaban bastante dañados y secos. La selección de orquídeas para cada tratamiento se
presenta en el cuadro 3.
29
Cuadro 2. Orquídeas infectadas trasladadas al invernadero de la UVG.
Número
Género
Especie
43
Pleurothallis
Inmersa
46
Phalenopsis
Dontis
49
Paphio
Insigne
50
Oncidium
Sphacelatum
56
Sin ID
Kisses
64
Lemboglossum Sp
70
Encyclia
Cochleata
74
Híbrido
Cattleya
77
Cattleya
portia-cerula
83
Epidendrum
X obrienianum
86
Híbrido
Epidendrum
87
Amarillo
Epidendrum
88
Morado
Epidendrum
90
Judy Paige
Ascocenda
91
Suksamram Beauty
Ascocenda
92
Pine rivers
Vascostilis
96
Vanda
Tricolor
104
Osmoglossum
Pulchellum
111
Phalenopsis
Fulcra
116
Híbrido
Cattleya
145
híbrido 2
Cattleya
149
guatemalensis MS Palmieri
Cattleya
150
Oncidium
Olorosa
158
Sweet sugar
Oncidium
Total (24 plantas infectadas)
ORSV
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
8
CymMV
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
18
TMV
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
5
No. virus
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
1
1
1
1
1
3
1
2
1
1
3
24
Fuente: FODECYT 067-2007.
Cuadro 3. Orquídeas tratadas con hidroterapia, termoterapia y cultivo de meristemos
No.
43
70
74
83
86
87
88
116
145
150
158
Género
Especie
Hidroterapia Termoterapia
X
Pleurothallis
inmersa
X
X
Encyclia
cochleata
híbrido
X
X
Cattleya
X
X
Epidendrum x obrienianum
híbrido
X
Epidendrum
amarillo
X
X
Epidendrum
morado
X
X
Epidendrum
híbrido
X
X
Cattleya
híbrido 2
X
X
Cattleya
X
X
Oncidium
olorosa
Sweet sugar
X
X
Oncidium
Total
10
8
Cultivo de meristemos
X
1
Fuente: FODECYT 067-2007.
Las plantas infectadas se sometieron a uno o más tratamientos dependiendo de la
disponibilidad de réplicas. Se sometieron 10 plantas infectadas a hidroterapia, 8 a
termoterapia
y
una
a
cultivo
de
meristemos.
30
B. Terapias de limpieza de virus
Los resultados de los diferentes tratamientos a los que se sometieron las diferentes plantas se presentan en los cuadros 4, 5, 6 y 7.
Cuadro 4. Resultados de la prueba de ELISA en las orquídeas tratadas con hidroterapia.
No.
43
70
74
83
86
88
111
116
145
158
Cód.
6LM
33LM
37LM
6JM
9JM
11JM
34JM
39JM
39LM
16SM
Género
Pleurothallis
Encyclia
Cattleya
Epidendrum
Epidendrum
Epidendrum
Phalenopsis
Cattleya
Cattleya
Oncidium
Especie
Inmersa
Cochleata
Híbrido
X obrienianum
Híbrido
Morado
Fulcra
Híbrido
híbrido 2
Sweet sugar
ORSV
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
Positivo
Antes del tratamiento
CymMV TMV
No. virus
Positivo Negativo
1
Negativo Negativo
1
Positivo Negativo
1
Positivo Negativo
1
Positivo Negativo
2
Positivo Negativo
2
Positivo Positivo
3
Positivo Negativo
1
Negativo Positivo
2
Positivo Positivo
3
Después del tratamiento
ORSV
CymMV TMV
No. virus
Negativo Negativo Negativo
0
Positivo Positivo Positivo
3
Negativo Positivo Negativo
1
Negativo Positivo Negativo
1
Positivo Positivo Negativo
2
Positivo Positivo Positivo
3
Positivo Positivo Positivo
3
Negativo Positivo Negativo
1
Positivo Negativo Positivo
2
Positivo Positivo Positivo
3
Conclusiones
Se eliminó CymMV
Se detectó TMV y CymMV
Permanece igual
Permanece igual
Permanece igual
Se detectó TMV
Permanece igual
Permanece igual
Permanece igual
Permanece igual
Fuente: FODECYT 067-2007
Se eliminó un solo virus de las 10 plantas tratadas con el tratamiento de hidroterapia. El virus de la planta que fue eliminado fue el virus
del mosaico del Cymbidium (CyMV). Las nueve plantas restantes permanecieron con el mismo número de virus presentes y en dos de ellas se
detectó la presencia de virus que no habían sido detectados anteriormente. El porcentaje de limpieza de este método fue del 10%.
31
Cuadro 5. Resultados de la prueba de ELISA en las orquídeas tratadas con termoterapia.
No.
70
74
83
88
111
116
145
158
Código
33LM
37LM
6JM
11JM
34JM
39JM
39LM
16SM
Género
Encyclia
Cattleya
Epidendrum
Epidendrum
Phalenopsis
Cattleya
Cattleya
Oncidium
Especie
cochleata
híbrido
X obrienianum
morado
fulcra
híbrido
híbrido 2
Sweet sugar
ORSV
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
Positivo
Antes del tratamiento
CymMV TMV
No. virus
Negativo Negativo
1
Positivo Negativo
1
Positivo Negativo
1
Positivo Negativo
2
Positivo Positivo
3
Positivo Negativo
1
Negativo Positivo
2
Positivo Positivo
3
Después del tratamiento
ORSV
CymMV TMV
No. virus
Positivo Positivo Positivo
3
Negativo Positivo Negativo
1
Negativo Positivo Negativo
1
Positivo Positivo Positivo
3
Positivo Positivo Positivo
3
Negativo Positivo Negativo
1
Positivo Negativo Positivo
2
Positivo Positivo Positivo
3
Conclusiones
Se detectó TMV y CymMV
Permanece igual
Permanece igual
Se detectó TMV
Permanece igual
Permanece igual
Permanece igual
Permanece igual
Fuente: FODECYT 067-2007
No se eliminó ningún virus por medio de la termoterapia y se detectó virus que no habían podido ser detectados en el primer análisis.
Cuadro 6. Resultados de la prueba de ELISA en las orquídeas tratadas con cultivo de meristmemos.
Número
86
Código
9JM
Género
Epidendrum
Especie
híbrido
ORSV
Positivo
Antes del tratamiento
CymMV TMV
No. virus
Positivo
Negativo
2
ORSV
Positivo
Después del tratamiento
CymMV TMV
No. virus
Positivo
Negativo
2
Conclusiones
Permanece igual
Fuente: FODECYT 067-2007
La planta sometida a cultivo de meristemos, permaneció igual, es decir, no se eliminó ningún virus.
32
Cuadro 7. Resultados de la prueba de ELISA en las orquídeas tratadas con termoterapia a 42°C luego del cultivo de meristemos.
Antes del tratamiento
No. Código Género
86
9JM
Especie ORSV
CymMV TMV
Epidendrum Híbrido Positivo Positivo
Positivo
Después del tratamiento
No.
virus
3
Tratamiento
8 horas
42°C
16 horas
42°C
1 día a 42°C
2 días a 42°C
Control
No. De plantas
tratadas
ORSV
CymMV TMV
No.
virus Conclusiones
6
Positivo
Positivo
Positivo
3
Permanece igual
6
6
6
6
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
3
3
3
3
Permanece igual
Permanece igual
Permanece igual
Permanece igual
Fuente: FODECYT 067-2007
Las plantas obtenidas por medio de cultivo de meristemos in vitro se trataron con termoterapia a 42°C por lapsos de tiempo diferentes.
Las plantas originales (sin tratamiento) presentaban 3 virus: el virus del mosaico del Cymbidium (CyMV), el virus de la mancha anillada de
Odontoglossum (ORSV) y el virus del mosaico del tabaco (TMV). Tanto el control como los cuatro tratamientos resultaron positivos para los
tres virus después de los tratamientos.
33
III.2. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
A. Diagnóstico de enfermedades virales.
Se analizaron un total de 180 orquídeas provenientes de 6 cultivares, los
resultados de las pruebas de ELISA se muestran en el cuadro No. 1. Los virus
analizados fueron los siguientes: virus del mosaico del Cymbidium (CyMV), el virus de
la mancha anillada de Odontoglossum (ORSV), el virus del bronceado del tomate
(TSWV), el virus del mosaico del pepino (CMV), el virus del mosaico del tabaco
(TMV) y Potyvirus (Poty).
La identidad de los cultivares se mantuvo secreta para no afectar a los cultivares
en cuestión. De los 6 cultivares visitados, únicamente dos se encontraron libres de
virus. Los otros 4 cultivares presentaron plantas infectadas con 2 o 3 de los siguientes
virus: el virus del mosaico del Cymbidium (CyMV), el virus de la mancha anillada de
Odontoglossum (ORSV) y el virus del mosaico del tabaco (TMV).
Este hallazgo es muy importante porque no se encontraron virus transmitidos por
vectores. Todos los encontrados son transmitidos mecánicamente. Esto implica que
probablemente lo que tienen que hacer los cultivares para mejorar la situación de sus
plantas es incrementar el cuidado en sus medidas de higiene. Estos virus son
transmitidos por el manejo de las plantas, por ejemplo, durante el corte de la flor puede
haber contacto con las manos de la savia de la planta y si toca otra planta
inmediatamente y también posee o se le hace una herida, la savia presente en las manos
en este caso puede contaminar la segunda planta. Lo mismo ocurre con las
herramientas y algunas veces con la vestimenta. Se recomienda que durante toda la
manipulación de las plantas y con todo lo que se manipulen éstas se vigile que esté
desinfectado. Esto se puede hacer con hipoclorito de sodio al 10% o hipoclorito de
calcio al 3% o con cualquier otro desinfectante que inactive virus, hasta con agua y
jabón pero se necesita lavar a conciencia la herramienta o las manos. No se deben tocar
dos plantas seguidas sin lavarse o desinfectarse las manos.
En todos los cultivares se escogió plantas que presentaban algún tipo de
sintomatología. Se observó, manchas anilladas en las hojas, manchas cloróticas,
manchas necróticas o deformaciones. En base a la sintomatología presentada
principalmente en las hojas se tomaron las muestras. No todas las orquídeas de los
cultivares fueron analizadas, por lo tanto no puede establecerse un porcentaje de
infección en cada cultivar. Sin embargo, sí pudo establecerse la presencia de virus en
los cultivares, basándose en la sintomatología de las plantas.
Existió un 80.11% de plantas que también presentaban la sintomatología descrita
anteriormente pero no presentaron presencia de ninguno de los virus analizados. Esto
puede deberse a faltas nutricionales, lumínicas, quemaduras por fertilizantes foliares,
pesticidas, presencia de alguna plaga como hongos o bacterias o presencia de algún otro
virus que no se haya tomado en cuenta en este proyecto. Así mismo, es también
probable que existan orquídeas que no presentaran sintomatología obvia pero que se
encuentren infectadas. Para ello sería recomendable que se realizara un análisis
completo de cada cultivar y así apartar todas las plantas con virus para no afectar a las
plantas limpias. Se recomienda entonces apartar o aislar las plantas con virus para
34
minimizar el riesgo para las plantas limpias. Así mismo, se recomienda nunca utilizar
las tijeras de podar y cualquier otro utensilio sin antes haberlo desinfectado con cloro o
algún desinfectante anti-viral comercial como se dijo anteriormente; aun cuando no se
observe ninguna sintomatología. Esta debe ser una práctica de rutina en cualquier
situación (Wisler 1989). La práctica de tener un lugar para cuarentena es muy
recomendable porque es allí en donde se pueden colocar las plantas sospechosas de
enfermedades o bien las plantas enfermas mientras se les aplique la termoterapia o
hidroterapia.
Debido a que más de la mitad de los cultivares tienen presencia de virus, es de
gran importancia que los cultivadores estén al tanto de la sintomatología de los virus
encontrados y de cómo pueden comprobar su presencia. La sintomatología observada
(ver cuadro No. 1) es, en términos generales, líneas cloróticas en presencia del virus del
mosaico del Cymbidium (CyMV) y manchas cloróticas en presencia del virus de la
mancha anillada de Odontoglossum (ORSV). La sintomatología de las combinaciones
de 2 o 3 virus y del virus del mosaico del tabaco (TMV) es la combinación de las
sintomatologías anteriores, líneas cloróticas y manchas cloróticas. En el anexo 4 se
encuentran las fotografías de los síntomas de las plantas que se analizaron.
El virus encontrado más comúnmente (ver figura 17) fue el virus del mosaico del
Cymbidium (CyMV) con un porcentaje de 61.11 %. El estudio de este virus
específicamente es importante para saber qué medidas utilizar para no seguir
propagándolo. El virus del Cymbidium (CyMV) es un virus que no tiene un vector
conocido y su transmisión es mecánica. Además, los otros dos virus encontrados en
menor porcentaje son también transmitidos mecánicamente, el ORSV y el TMV. La
presencia de TMV puede indicar que en el manejo de las plantas de orquídeas está
involucrado o involucrada una persona fumadora. Este virus es un virus muy estable
que puede transmitirse si un fumador toca una planta herida sin desinfectarse antes o si
toca una herramienta y ésta corta la planta sin que se haya desinfectado antes. Es más,
se ha encontrado que algunos periódicos con los que se tapan a las flores a veces para
evitar el sol o para cualquier actividad que se realice en el invernadero, han sido
encontrados infectados con TMV al hacerles una prueba. Esto da idea de lo estables
que son estos virus.
Para evitar la infección por estos virus expusimos que es importante la higiene
en la manipulación de las plantas. Un estudio llevado a cabo por Hu et al. (1994),
establece que efectivamente la higiene es de extremada importancia para evitar la
presencia de estos virus en el invernadero. En este estudio comprobaron que
compuestos como leche descremada a una concentración mínima del 30% y etanol al
80% fueron efectivos en evitar la infección por CyMV y ORSV en invernaderos cuando
se trataba de hospederos que manifestaban síntomas locales del virus. Sin embargo, con
virus que presentan síntomas sistémicos no fueron efectivos. Por esto, se hicieron
estudios con orquídeas que presentaron infecciones sistémicas por estos virus y llegaron
a la conclusión que NaOH a una concentración del 1%y cloro inactivaban al virus y no
permitían la transmisión de estos dos virus a las plantas. Además, se evidenció que
NaOH a esa concentración no causa daño fitotóxicos en las plantas. La recomendación
fue de usarlo en la desinfección de herramientas y en la higiene del invernadero.
Physan no fue efectivo para hospederos con infección sistémica aunque para infecciones
locales sí. Este estudio se hizo en Hawaii y demostró que la higiene y la elección del
desinfectante adecuado son clave para invernaderos libres de estos virus.
35
B. Terapias de limpieza de virus
Luego del diagnóstico de presencia de virus, se procedió a colectar las plantas
infectadas. Se recogió un total de 24 plantas infectadas pertenecientes a 3 cultivares.
Estas plantas fueron trasladadas al invernadero de la Universidad del Valle de
Guatemala. Las plantas grandes se separaron en dos o tres segmentos para propagarlas y
tener más material para realizar las pruebas. Sin embargo, en el proceso de
aclimatación se perdieron algunas plantas que no resistieron la separación. Las plantas
que se sometieron a tratamiento fueron aquellas que se encontraban bien establecidas.
Las plantas que se observaron débiles no se utilizaron ya que los tratamientos son
bastante agresivos y podían matarla. Para el tratamiento de cultivo de meristemos se
escogió una planta del género Epidendrum ya que este género presenta hojas alternas,
no basales, y por lo tanto se pueden obtener varios meristemos de una planta. A
diferencia del resto de géneros donde únicamente podemos obtener un meristemo basal
de cada planta.
a) Hidroterapia
Se trató un total de 10 plantas infectadas con hidroterapia. Las plantas tratadas
mostraron signos de quemadura luego del tratamiento, como el amarillamiento de las
hojas y ablandamiento de los tejidos. Las plantas fueron llevadas nuevamente a
invernadero para su aclimatación. Se tomó muestras para ELISA de los tejidos verdes,
es decir tejidos vivos.
Con este método únicamente se logró limpiar una planta. Por lo tanto, el
porcentaje de limpieza de este método es del 10%. Cabe mencionar que la planta que se
limpió solamente tenía un virus - virus del mosaico del Cymbidium (CyMV).
La efectividad de este método es baja y los daños a las plantas son muy fuertes.
Algunas de las plantas fueron dañadas a tal grado que murieron en el invernadero. Por
lo tanto, el método no se recomienda como método de desinfección o limpieza de virus
en orquídeas utilizando las mismas condiciones que en este estudio. Se cree que se
debe probar con temperaturas más altas pero por tiempos más cortos porque así el efecto
puede ser drástico pero por corto tiempo quizá no afecte tanto a la planta.
Finalmente, se comprobó la presencia de otros virus en dos plantas que no tenían
reportado el virus en el diagnóstico. Lo más probable es que estas dos plantas hayan
adquirido la concentración adecuada para la detección de este virus en el lapso de
tiempo entre el primer diagnóstico y la extracción de las plantas de los cultivares o bien
en el lapso de separación de las plantas para obtener réplicas. Otra posible razón puede
ser que como el virus no se distribuye de manera igual por toda la planta, se haya
muestreado tejido sin virus y que la segunda vez ya el tiempo que pasó entre estas dos
evaluaciones haya permitido que toda la planta se infectara con virus y se haya podido
detectar. Hu et al. (1994) reportan que se distribuye de acuerdo al diagrama que se
presenta en la figura 18. En esta figura se puede observar que no todas las hojas
presentan al virus al inicio de la infección y que hasta de por lo menos un mes o mes y
medio la infección está en toda la planta.
36
Figura 18. Movimiento del virus del mosaico del Cymbidium (CyMV) en híbridos de
Dendrobium infectados.
Fuente: Hu et al. 1994.
b) Termoterapia
Se trató un total de 10 plantas con este método; sin embargo, dos de éstas
murieron en el tratamiento y es por ello que en el cuadro 6 únicamente se presentan 8.
En este tratamiento no se logró limpiar ninguna planta, todas resultaron positivas
después del tratamiento.
El porcentaje de decesos durante el tratamiento fue del 20%, siendo este
tratamiento más agresivo que la hidroterapia. Sin embargo, la recuperación de las
plantas que sobreviven a esta terapia es mejor que las que sobreviven a la hidroterapia.
De igual manera que la hidroterapia, en la termoterapia tampoco las
temperaturas y tiempos utilizados en este estudio se recomiendan para la eliminación de
virus, ya que éstos persisten, en todos los casos, luego de la terapia. Se recomienda
hacer pruebas con temperaturas más altas pero con tiempos cortos para tratar de dañar
menos a la planta.
Nuevamente se confirma la presencia de nuevos virus en las dos mismas plantas
que en la hidroterapia. Esto confirma que el virus fue adquirido antes de la separación
de la planta original pero no se había distribuido completamente en la planta.
37
c) Cultivo de meristemos
En este proyecto se utilizó como método de desinfección el cultivo de
meristemos. Esto se hizo porque se ha reportado la limpieza de virus por medio de este
método en otros cultivos y como se explicó con anterioridad, el virus se replica y se
mueve más lentamente que la división celular.
Se utilizó plantas de Epidendrum debido a que éste presenta hojas a lo largo del
tallo, no todas basales. De esta manera se extrajo el meristemo de cada nudo foliar. Los
otros géneros disponibles de plantas infectadas eran Encyclia, Cattleya, Phalenopsis y
Oncidium. Todos estos géneros tienen hojas basales por lo que la disponibilidad de
meristemos es menor, por lo que la cantidad de plántulas que podríamos obtener de cada
planta adulta es muy pequeña. Es por ello que se decidió trabajar con el género
Epidendrum.
Se logró establecer plantas obtenidas de cultivo de meristemos. A estas plantas
se les corrió la prueba ELISA y nuevamente resultaron positivas para los virus
presentados antes de su cultivo, el virus del mosaico del Cymbidium (CyMV) y el virus
de la mancha anillada de Odontoglossum (ORSV).
Por lo tanto, este método tampoco es efectivo para la limpieza de virus en
orquídeas. Probablemente hay que tratar de hacer los meristemos más pequeños aún
pero no se sabe si podrán aún reproducirse.
d) Termoterapia luego del cultivo de meristemos
Debido a que no se obtuvieron los resultados deseados en las plantas tratadas
con cualquiera de las tres terapias anteriores, se decidió realizar la combinación de dos
métodos, el cultivo de meristemos y la termoterapia. Las plantas introducidas a cultivo
in vitro fueron meristemadas y reproducidas. De esta manera se obtuvo un lote de 30
plantas a las cuales se les realizó una prueba ELISA antes de realizar la termoterapia.
De esta manera se comprobó la presencia de los tres virus encontrados a lo largo de este
proyecto.
Se dividieron las plantas en cinco lotes o grupos para realizar cinco tratamientos
de termoterapia y ver si alguno era eficaz para la limpieza de virus. El tratamiento más
prolongado duraba 2 días (48 horas) a 42°C. No se realizó ningún tratamiento con
tiempo mayor o temperatura mayor ya que las tasas de mortandad de las orquídeas son
muy elevadas. La tasa de mortandad a 42°C y 48 horas fue del 33 % (2 de las 6 plantas
tratadas murieron en la terapia y las cuatro que sobrevivieron a la terapia se vieron muy
afectadas (la mayoría de hojas fenecieron).
Para todos los tratamientos de esta terapia, los resultados de la prueba ELISA
muestran que todas las plantas (tratadas y control) permanecieron positivas (ver cuadro
No. 8). Por lo tanto, al igual que las terapias individuales, el tratamiento de cultivo de
tejidos seguido de termoterapia a 42°C no eliminó los virus en orquídeas y no es un
método efectivo el la limpieza de virus.
38
Esta combinación de técnicas no fue muy eficiente pero últimamente se han
reportado otras técnicas como quimioterapia con Ribavirin y electroterapia así como
combinaciones de técnicas. Mahmoud et al. (2009) reportó para eliminación del virus
PVY en papa, tratamientos de doble ciclo de termoterapia, quimioterapia, electroterapia
y su combinación. Reportó que el primer ciclo que se proporcionó de termoterapia a
plantas de papa fue realmente desalentador ya que como muestra la figura 19,
únicamente se obtuvo un 2 % de plantas libres de virus. Pero, a estas plantas se les hizo
cortes para sembrarlos, se sometieron a nueva termoterapia y se reprodujeron 35% de
los cuales el 30% aproximadamente estaba libre de virus (PVY). Sin embargo, con el
uso de técnicas como quimioterapia y electroterapia se obtuvieron mejores resultados.
Esto sería muy interesante evaluarlo porque las orquídeas son bastante susceptibles a
tratamientos fuertes.
Figura 19. Efecto de la termoterapia para la eliminación de PVY.
Fuente: Mahmoud et al. 2009.
a) Dos plantas de 6 que sobrevivieron al tratamiento resultaron libres de virus y 4 se mantuvieron
infectadas. b) Treinta y cinco plantas resultaron después de la segunda termoterapia a las plantas
que se mantuvieron infectadas pero 30 se comprobó que estaban libres de virus.
39
PARTE IV
IV.1. CONCLUSIONES

No se logró implementar una metodología que permitiera eliminar las
infecciones virales en orquídeas, únicamente para plántulas infectadas por 1
virus y no para infecciones mixtas.

Se encontró que, por el método de ELISA, se pudo determinar que el 20% (36
plantas infectadas de 180 plantas analizadas) de todas las plantas analizadas
estaban infectadas con uno o más virus.

Ninguna de las terapias realizadas (hidroterapia, termoterapia, cultivo de
meristemos y combinación de cultivo de meristemos y termoterapia) fueron
efectivas para la limpieza de virus en orquídeas.

La extracción de meristemos se llevó a cabo con eficiencia ya que pudimos
obtener varias plántulas de Epidendrum de los mismos.

El cultivo in vitro de orquídeas no fue efectivo para limpiar las plantas de virus,
todas resultaron tener los mismos virus al reproducirse de los meristemos.

Únicamente una planta fue limpiada por medio de hidroterapia y ésta no
presentaba infección mixta, solamente la presencia de 1 virus, CyMV.

La sintomatología observada es: líneas cloróticas en presencia del virus del
mosaico del Cymbidium (CyMV) y manchas cloróticas en presencia del virus de
la mancha anillada de Odontoglossum (ORSV).

La hipótesis sobre la eficiencia de la hidroterapia sobre la termoterapia no se
pudo comprobar, por lo que no se rechaza la hipótesis alterna 1 aunque en un
caso se logró obtener una planta libre de virus por esta técnica a diferencia de la
termoterapia. Se acepta la hipótesis nula que establece que ninguno de los dos
métodos (hidroterapia o termoterapia) son eficaces en la limpieza de virus de
orquídeas cultivadas.

La segunda hipótesis alterna se rechaza también, aceptando la hipótesis nula
porque ninguno de los dos métodos fue efectivo para limpieza de virus en
orquídeas.
40
IV.2. RECOMENDACIONES
 Realizar más pruebas de terapias, variando las temperaturas, los tiempos de
duración y las combinaciones de las diferentes terapias, a fin de obtener un
tratamiento efectivo en la eliminación de virus en orquídeas.
 Evaluar diferentes tamaños de meristemos para determinar el idóneo para la
eliminación de virus de las diferentes variedades de orquídeas.
 Realizar un estudio en invernadero para determinar cuál es el efecto de estos
tratamientos en orquídeas de diferentes especies infectadas por un virus o
infectadas por combinaciones de los mismos.
 Combinar la técnica de termoterapia con quimioterapia o electroterapia o evaluar
las otras dos técnicas y estimar su eficiencia.
 Tratar de monitorear las temperaturas tanto de la cámara de termoterapia como
de la de hidroterapia para determinar la distribución real de las temperaturas en
estas cámaras y estar seguros que la planta o el meristemo esté sometido a la
temperatura que se quiere.
 Realizar en los cultivares un análisis de todas las orquídeas para determinar si
los cultivares son libres de virus y así poder aislar las plantas infectadas y evitar
contagios.
 Informar a todos los cultivadores sobre la incidencia de virus en orquídeas y dar
a conocer los probables síntomas de los virus encontrados.
41
IV.3. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICA
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45
ANEXOS
46
IV.4. ANEXOS
ANEXO No. 1: METODOLOGÍA DE ELISA DIRECTO FOSFATASA ALCALINA
Anticuerpo de cobertura (para 96 pozos)
En un beaker colocar:
10 ml de buffer de cobertura
50 l de anticuerpo (Agdia)
Agitar por aproximadamente 10 minutos
Agregar 100 l a cada pozo, cubrir con tape
Incubar en cámara húmeda por 4 horas o toda la noche a 4°C.
Preparación de muestras
Todas las muestras se trabajan en duplicado. Se puede trabajar 46 muestras
máximo, más los controles negativo y positivo.
En un tubo:
pesar 0.1 g de cada muestra
agregar 1.0 ml de buffer de extracción directo
macerar (entre cada muestra lavar el macerador con cloro al 10% y luego
con agua destilada)
Lavado de la placa
Se utiliza el lavador de placas automático BIORAD ImmunoWash modelo 1575.
Se emplea PBST como solución de lavado.
Colocación de muestras
Colocar en dos pozos buffer de extracción directo, lo cual servirá de blanco.
Realizar el mapa en duplicado
Colocar control positivo de Agdia (si no hay control positivo de Agdia puede
colocar muestra de una hoja infectada)
Colocar control negativo de Agdia (si no hay control negativo de Agdia puede
colocar muestra de una hoja no infectada)
Colocar 100 l de cada muestra en el pozo respectivo y en duplicado
Cubrir con tape
Incubar 2 horas en cámara húmeda a temperatura ambiente o toda la noche a 4°C
Lavado de placa
Véase paso 3.
Anticuerpo conjugado
En un beaker colocar (para los 96 pozos):
10 ml de buffer de conjugado
50 l de anticuerpo conjugado
Agitar por 10 minutos
Agregar 100 l a cada pozo, cubrir con tape
Incubar en cámara húmeda por 2 horas a temperatura ambiente
Lavado de placa
Véase paso 3
47
Sustrato
En un beaker colocar:
10 ml de buffer de dietanolamina 1M, pH 9.8, MgCl2 0.5 mM
Evitar que el beaker esté expuesto a la luz (cubrirlo con papel aluminio)
2 pastillas de sustrato (p-nitrofenilfosfato)
Agregar 100 l a cada pozo
Colocar en cámara oscura
Lectura de placa
Se hacen dos lecturas (una hora y dos horas después de agregado el
sustrato) a 405 nm
Fin de la reacción
Agregue 50 l de NaOH 3M (opcional)
48
ANEXO No. 2: METODOLOGÍA DE ELISA INDIRECTO FOSFATASA
ALCALINA
Preparación de muestras
Todas las muestras se trabajan en duplicado. Se puede trabajar 46 muestras
máximo, más los controles negativo y positivo.
En un tubo:
pesar 0.1 g de cada muestra
agregar 1.0 ml de buffer de extracción indirecto
macerar (entre cada muestra lavar el macerador con cloro al 10% y luego
con agua destilada)
Colocación de muestras
Colocar en dos pozos buffer de extracción directo, lo cual servirá de blanco.
Realizar el mapa en duplicado
Colocar control positivo de Agdia (si no hay control positivo de Agdia puede
colocar muestra de una hoja infectada)
Colocar control negativo de Agdia (si no hay control negativo de Agdia puede
colocar muestra de una hoja no infectada)
Colocar 100 l de cada muestra en el pozo respectivo y en duplicado
Cubrir con tape
Incubar 1 horas en cámara húmeda a temperatura ambiente.
Lavado de la placa
Remover el tape
Vaciar la placa (sacudiéndola fuerte pero no bruscamente sobre el lavadero)
Agregar PBST como solución de lavado
Se deja 3 minutos entre cada lavado, esto se hace 2 veces
Se sacude y se seca somatando sobre servilletas hasta que quede bien seca
Anticuerpo (para 96 pozos)
En un beaker colocar:
10 ml de buffer de conjugado
50 l de anticuerpo (Agdia)
Agitar por aproximadamente 10 minutos
Agregar 100 l a cada pozo, cubrir con tape
Incubar en cámara húmeda por 2 horas o toda la noche a 4°C.
Lavado de placa
Véase paso 3.
Conjugado
En un beaker colocar (para los 96 pozos):
10 ml de buffer de conjugado
50 l de anticuerpo conjugado
Agitar por 10 minutos
Agregar 100 l a cada pozo, cubrir con tape
Incubar en cámara húmeda por 1 hora a temperatura ambiente
49
Lavado de placa
Véase paso 3
Sustrato
En un beaker colocar:
10 ml de buffer de dietanolamina 1M, pH 9.8, MgCl2 0.5 mM
Evitar que el beaker esté expuesto a la luz (cubrirlo con papel aluminio)
2 pastillas de sustrato (p-nitrofenilfosfato)
Agregar 100 l a cada pozo
Colocar en cámara oscura
Lectura de placa
Se hacen dos lecturas (una hora y hora y media después de agregado el
sustrato) a 405 nm
Fin de la reacción
Agregue 50 l de NaOH 3M (opcional)
50
ANEXO 3. Resultados de presencia de 6 virus en las 180 orquídeas analizadas.
No.
Género
Especie
ORSV
TSWV
TMV
CMV
CymMV
Poty
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
Arpophyllum
Trichopilia
Epidendrum
Encyclia
Stanhopea
Coelia
Brassia
Coelia
Oncidium
Trichopilia
Oncidium
Lycaste
Cattleya
Cattleya
Cattleya
Encyclia
Encyclia
Encyclia
Encyclia
Encyclia
Encyclia
Encyclia
Laelia
Oncidium
Phalenopsis
Phalenopsis
Phalenopsis
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Encyclia
Trigonidium
Stanhopea
Oncidium
Pleurothallis
Pleurothallis
Rhynchostele
Rhynchostele
Phalenopsis
Phalenopsis
Phragmipedium
Paphio
Oncidium
Pleurothallis
Sin ID
Pleurothallis
Oncidium
Dendrobium
Sin ID
Oncidium
Sobralia
Oncidium
Epidendrum
Encyclia
Giganteum
Tortilis
Verrucosum
Tuerckheimii
Oculata
Suburbans
Verrucosa
macrostachya
Sphacelatum
Tortilis
ornithorhynchum
Sp
Skinneri
Bowringiana
Aurantiaca
Cordigera
Belizensis
Ceratistes
Alata
Alata
Cordigera
Alata
Autumnalis
cavendishianum
Híbrido
Híbrido
Híbrido
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
cordigera
Sp
Sp
leucochilum
sp1
inmersa
sp1
sp2
dontis
dontis
Sp
insigne
sphacelatum
sp2
miniatura
sp3
sp1
híbrido
Kisses
ornithorhynchum
Sp
sp2
arbuscula
panthera
51
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125
Lycaste
Encyclia
Lemboglossum
Encyclia
Brassia
Sin ID
Rossioglossum
Vanda
Encyclia
Epidendrum
Oncidium
Maxilaria
Cattleya
Encyclia
Cattleya
Cattleya
Cattleya
Oncidium
Brassia
Oncidium
Brassia
Epidendrum
Cymbidium
Colmanara
Epidendrum
Epidendrum
Epidendrum
Epidendrum
Ascocenda
Ascocenda
Vascostilis
Mokara
Cytopodium
Cymbidium
Vanda
Encyclia
Encyclia
Brassia
Stelis
Elleanthus
Dendrobium
Sobralia
Osmoglossum
Epidendrum
Dendrobium
Oncidium
Miltonia
Encyclia
Cattleya
Phalenopsis
Brassia
VLC
Pleurothallis
Cattleya
Cattleya
Huntleya
Oncidium
Lockhartia
Stelis
Coelia
Ponera
Brassia
Trichopilia
Arpophyllum
cochleata
ochracea
Sp
Sp
maculata hibrido
jardín
williamsianum
Sp
cochleata
ciliare
maculatum
anceps
híbrido
phoenicia
guatemalensis
portia-cerula
loving Bankok
leucochilum
maculata hibrido
cherry baby
híbrido
X obrienianum
sp1
Wildcat
híbrido
amarillo
morado
radicans
Judy Paige
Suksamram Beauty
Pine rivers
Rora Alsahof
punctatum
sp2
tricolor
selligera
cordigera
maculata
Sp
cynarocephalus
nobilis
decora
pulchellum
cnemidophorum
Sp
Grower Ramsey
spectabilis
papilosa
sp.
fulcra
verrucosa
híbrido
tuerckheimii
ocracea x rex
híbrido
burtii
Jiuhboa-Gold
oerstedii
Sp
macrostachya
glomerata
verrucosa
tortilis
giganteum
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
52
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
Oncidium
Sin ID
Epidendrum
Epidendrum
Sin ID
Isochilus
Oncidium
Maxilaria
Maxilaria
Encyclia
Oncidium
Cattleya
Oncidium
Oncidium
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Cattleya
Trichopilia
147
148
149
150
151
Vanda
Vanda
Cattleya
Oncidium
Ascocenda
152
153
154
155
156
157
158
159
160
161
162
163
164
165
166
167
168
169
170
171
172
173
174
175
176
177
178
179
180
Phragmipedium
Dendrobium
Dendrobium
Phalenopsis
Phalenopsis
Cattleya
Oncidium
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
Sin ID
ornithorhynchum
polyanthum
ciliare
Sp
ornithorhynchum
teniufolia
Sp
Sp
leucochilum
aurantiaca
leucochilum
leucochilum
híbrida
tortilis
chindavat x
coerulea
Azul
guatemalensis
olorosa
John De Biase
Warszewiczianu
m
Ekapole
Ekapole 2
No. 1
No. 2
White Diamond
Sweet sugar
TOTAL
TOTAL DE PLANTAS INFECTADAS
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
15
0
8
0
26
36
53
0
ANEXO 4. Fotografías de los síntomas más comunes presentados por las orquídeas
infectadas por virus (muestras positivas en los análisis).
CymMV
CymMV
CymMV
Síntomas: líneas cloróticas
Síntomas: líneas cloróticas y
manchas necróticas
Síntomas: líneas cloróticas
CymMV
ORSV
TMV
Síntomas: líneas clorótricas,
manchas cloróticas evidentes y
manchas necróticas.
Síntomas: manchas cloróticas
Síntomas: manchas y líneas cloróticas
CymMV
CymMV
CymMV
Síntomas: líneas cloróticas
Síntomas: líneas cloróticas y
manchas cloróticas
Síntomas: líneas cloróticas
CymMV
ORSV y CymMV
ORSV y CymMV
Síntomas: líneas cloróticas
Síntomas: líneas y manchas
cloróticas
Síntomas: líneas y manchas cloróticas
ORSV y CymMV
CymMV
CymMV
Síntomas: líneas y manchas
cloróticas
Síntomas: manchas y líneas
cloróticas
Síntomas: líneas cloróticas
54
CymMV
CymMV
TMV
Síntomas: líneas cloróticas y
manchas necróticas
Síntomas: líneas cloróticas
Síntomas: líneas cloróticas
ORSV, CymMV, TMV
CymMV
ORSV, TMV
Síntomas: líneas clorótricas,
manchas cloróticas y manchas
necróticas.
Síntomas: líneas clorótricas,
manchas cloróticas y manchas
necróticas.
Síntomas: líneas clorótricas, manchas
cloróticas y manchas necróticas.
CymMV
CymMV
ORSV, CymMV, TMV
Síntomas: líneas cloróticas y
manchas necróticas
Síntomas: líneas cloróticas
Síntomas: líneas clorótricas, manchas
cloróticas y manchas necróticas.
FODECYT 067-2007
55
PARTE V
VI. 1. INFORME FINANCIERO
AD-R-0013
QUINCEAVA CONVOCATORIA
LINEA FODECYT
Nombre del Proyecto:
EVALUACIÓN DE MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN Y LIMPIEZA DE VIRUS
EN ORQUÍDEAS CULTIVADAS
067-2007
LICDA. SARA BARRIOS
Q73,969.50
12 MESES
01/03/2008 al 28/02/2009
PRÓRROGA AL 31/12/2009
TRANSFERENCIA
En Ejecuciòn
Asignacion
Pendiente de
Menos (-) Mas (+)
Presupuestaria
Ejecutado
Numero del Proyecto:
Investigador Principal:
Monto Autorizado:
Plazo en meses
Fecha de Inicio y Finalización:
Grupo
Renglon
Nombre del Gasto
Ejecutar
1
122
133
181
181
2
241
243
244
261
262
267
268
269
291
299
3
9
(-)
Servicios No Personales
Impresión, encuadernación y reproducción
Viáticos en el interior
Estudios,investigacionesy
proyectos
factibilidad
Estudios,investigacionesy
proyectos
factibilidad (Evaluación Externa de Impacto)
Monto Autorizado
( -) Ejecutado
Sub-total
( -) Apertura de Caja Chica
Total por Ejecutar
1,500.00
600.00
Q
Q
1,500.00
600.00
Q
30,000.00
Q 22,500.00 Q
7,500.00
Q
8,000.00
Q
8,000.00
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
140.00
100.00
100.00
100.00
750.00
560.00
100.00
25,000.00
200.00
95.00
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q 23,230.90 Q
Q
Q
140.00
100.00
100.00
100.00
750.00
560.00
100.00
1,769.10
200.00
95.00
Q
6,724.50
Q 6,724.50 Q
Q
73,969.50
Q 52,455.40 Q
21,514.10
Q
Q
Q
Q
Q
73,969.50
52,455.40
21,514.10
21,514.10
Disponibilidad: Q
21,514.10
de
de
Materiales y Suministros
Papel de escritorio
Productos de papel o cartón
Otros productos de papel, cartón e impresos
Elementos y compuestos químicos
Combustibles y Lubricantes
Tintes, pinturas y colorantes
Productos plásticos nylon, vinil y pvc
Otros productos químicos y conexos
Útiles de oficina
Otros materiales y suministros
Propiedad, planta y equipo
Asignaciones Globales
Gastos Administrativos (10%)
TOTAL
Q
Q
56
-