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UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR ANALISIS DE POLIMORFISMOS GENETICOS DEL GEN NOD2/CARD15 Y TLR4, ASOCIADOS A ENFERMEDADES INFLAMATORIAS INTESTINALES (EII) EN PACIENTES CHILENOS Memoria para optar al titulo profesional de Bioquímico ALEXIS LUIS PERALTA BONDI Directora de Tesis Nombre Departamento Co-Director Nombre Departamento Profesor Patrocinante Departamento : Dra. Marcela Hermoso Ramello. : Programa Disciplinario de Inmunología, ICBM Facultad de Medicina, Universidad de Chile : Dr. Rodrigo Quera Pino : Departamento Gastroenterología, Hospital José Joaquín Aguirre, Universidad de Chile : Dr. Dante Miranda Wilson. : Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Cs. Químicas y Farmacéuticas, Univ. De Chile Santiago-Chile 2007 Para Genny y Melchor ii Mis sinceros agradecimientos Agradecer es una ardua tarea en si, ya que no quisiera dejar a nadie al margen de estas palabras, pero al iniciar esta labor, se puso en mi una gran responsabilidad y confianza, por este motivo agradezco en primera instancia a la Dra. Marcela Hermoso, por creer en mi, por su estimulo y por su invaluable apoyo en los momentos difíciles. Doy gracias a mis compañeros “Lillos” por todo el asesoramiento técnico-científico, por sus substanciales sugerencias y por compartir su conocimiento conmigo, dedico palabras de gratitud especialmente a Frano, Sergio, Lucia, Bender, Rodrigo, Ramón y Caroll, por su entera e incondicional predisposición y simplemente por entregarme su amistad. Agradezco al Dr. Rodrigo Quera y al Dr. Dante Miranda por su apoyo y excelente disposición. A Genny y María Inés, por el empuje y la fuerza cuando estas fueron necesarias. Y a todas aquellas personas que de una u otra forma, colaboraron o participaron en la realización de esta tesis, hago extensivo mis más sinceros agradecimientos iii INDICE GENERAL DEDICATORIA...................................................................................................................ii AGRADECIMIENTOS .......................................................................................................iii INDICE GENERAL ............................................................................................................iv INDICE DE FIGURAS........................................................................................................vi INDICE DE TABLAS ........................................................................................................vii ABREVIATURIAS ........................................................................................................... viii RESUMEN.........................................................................................................................xi SUMMARY ...................................................................................................................... xiii 1 INTRODUCCION ............................................................................................................ 1 1.1 Enfermedad Inflamatoria Intestinal ......................................................................... 1 1.1.1 Colitis Ulcerosa.................................................................................. 2 1.1.2 Enfermedad de Crohn........................................................................ 2 1.2 Patron inmune de las EII ........................................................................................ 4 1.3 Etiopatogenia en Enfermedad Inflamatoria Intestinal ............................................. 5 1.4 Tratamiento de Enfermedad Inflamatoria Intestinal ................................................ 6 1.5 Respuesta Inmune Innata y Patrones de reconocimiento de patógenos ................ 9 1.5.1 Respuesta Inmune Innata .................................................................. 9 1.5.2 Receptores Toll................................................................................ 10 1.5.3 Receptores Intracelulares ................................................................ 13 1.5.3.1 Dominio de oligomerización unido a nucleótidos - 2 (NOD2)......... 14 1.5.4 Polimorfismos genéticos en PRRs ................................................... 15 2 HIPOTESIS................................................................................................................... 19 2.1 Objetivo General .................................................................................................. 19 2.2 Objetivos Especificos ........................................................................................... 19 2.3 Diseño Experimental ............................................................................................ 20 3 PACIENTES, MATERIALES Y METODOS .................................................................. 22 3.1 Pacientes ............................................................................................................. 22 3.2 Controles.............................................................................................................. 24 3.3 Materiales ............................................................................................................ 27 3.3.1 Material Biológico............................................................................. 27 3.3.2 Enzimas........................................................................................... 27 3.3.3 Oligonucleótidos .............................................................................. 28 3.4 Métodos ............................................................................................................... 29 3.4.1 Extracción ADN ............................................................................... 29 3.4.2 Deteccion e Identificacion de grupos sanguineos ............................ 30 3.4.3 Análisis Genético, Detección de polimorfismos................................ 30 3.4.3.1 Polimorfismos TLR4...................................................................... 30 3.4.3.2 Polimorfismos NOD2/CARD15...................................................... 32 3.4.4 Electroforesis en geles de poliacrilamida ......................................... 46 3.4.5 Analisis Estadistico .......................................................................... 35 4 RESULTADOS ............................................................................................................. 36 5 DISCUCION.................................................................................................................. 42 iv 6 CONCLUSIONES ......................................................................................................... 48 7 BIBLIOGRAFIA............................................................................................................. 50 8 ANEXOS ...................................................................................................................... 55 8.1 Publicaciones....................................................................................................... 55 8.2 Trabajos presentados en Congresos.................................................................... 55 v INDICE FIGURAS Figura I Esquema comparativo EC vs CU ....................................................... 3 Figura II Esquema de la vía transduccional de los receptores TLR asociados a la membrana plasmática .............................................. 11 Figura III Esquema de la vía transduccional de los receptores TLR asociados a endosomas................................................................... 12 Figura IV Diagrama de variantes polimórficas para TLR4 ............................... 16 Figura V Diagrama de mutaciones para NOD2/CARD15 ............................... 17 Figura VI Estructura del gen NOD2/CARD15 y localización de las variantes genéticas asociadas a EC ................................................ 18 Figura VII Esquema de análisis de restricción para la variante Asp299Gly del TLR4 ........................................................................ 31 Figura VIII Gel de poliacrilamida que muestra la expresión de la variante genética Arg702Trp del gen NOD2/CARD15 ................................... 39 Figura IX Gel de poliacrilamida que muestra la expresión de la variante polimórfica Gly908Arg del gen NOD2/CARD15 ............................... 40 Figura X Gel de poliacrilamida que muestra la expresión de la variante polimórfica Asp299Gly del gen TLR4 ............................................... 41 Figura XI Modelo propuesto ............................................................................ 49 vi INDICE DE TABLAS Tabla I. Manifestaciones clínicas más comunes asociadas a EII ............... 4 Tabla II. Indicaciones de cirugía .................................................................. 8 Tabla III. Genotificación de los polimorfismos genéticos ............................ 28 Tabla IV. Manifestaciones Clínicas de pacientes portadores de EC........................................................................................... 37 Tabla V. Manifestaciones Clínicas de pacientes portadores de CU........................................................................................... 38 Tabla VI. Genotipos de NOD2/CARD15 y alelos Estudiados..................... 40 Tabla VII. Genotipo de TLR4 y alelos Estudiados........................................ 41 vii ABREVIATURIAS 5-ASA 6MP A ADN AP-1 Apaf-1 Arg702Trp Asp299Gly BLAST C3H/HeJ C57BL/10ScCr CARD CD14 C-Rel CTC CU CXCR4 EC EII ERK1/2 Gly908Arg HhaI HSP60 HSP70 HSP90 IBD iE-DAP IFNγ IFNα IFNβ IKK IL-1 IL-12 IL-12Rβ2 IL-17 IL-1R IL-23 IL-4 IL-6 IL-8 IRAKs IRFs JNK L1007fsinC L1007fsinsCMUTF L1007fsinsCR L1007fsinsCWTF LB : Acido 5-aminosalicílico : 6-mercaptopurina : Adenina : Ácido Desoxirribunocleico : Proteína adaptadora-1 : Factor 1 activante de la proteasa en apoptosis : Mutación puntual del gen NOD2/CARD15 : Mutación puntual del gen TLR4 : Basic Local Alignment Search Tool : Cepa de ratones C3H/HeJ : Cepa de ratones C57BL/10ScCr : Dominio de reclutamiento de caspasas : Proteína asociada a glicosilfosfatidilinositol : Sub-Unidad del Factor nuclear kappa B : Corticoides : Colitis Ulcerosa : Receptor de quimioquina 4 : Enfermedad de Crohn : Enfermedad Inflamatoria Intestinal : Quinasa reguladora de señales extracelulares 1 y2 : Mutación puntual del gen NOD2/CARD15 : Enzima de restricción HhaI : Proteína de shock térmico 60 : Proteína de shock térmico 70 : Proteína de shock térmico 90 : (innflamatory bowel disease) Enfermedad inflamatoria intestinal : Ácido diaminopimélico c-D-glutamil-meso : Interferón gamma : Interferón alfa : Interferón beta : Inhibidor del factor nuclear kappa : Interleuquina - 1 : Interleuquina - 12 : Receptor de Interleuquina 12 beta : Interleuquina - 17 : Receptor de interleuquina-1 : Interleuquina - 23 : Interleuquina - 4 : Interleuquina - 6 : Interleuquina - 8 : Quinasa asociada al receptor de Interleuquina-1 : Factor regulador de Interferón : Quinasa N-terminal c-jun : Mutación por inserción del gen NOD2/CARD15 : Partidor sentido mutante de la variante polimórfica L1007fsinC : Partidor Antisentido de la variante polimórfica L1007fsinC : Partidor sentido nativo de la variante polimórfica L1007fsinC : Linfocito B viii LBP LPS LTA MAPK MDP MMPs Mut NcoI NF-κB NOD1 NOD2/CARD15 NOS-2 P1 P2 P3 PA Pam3Cys-Ser-Lys4 PAMPs Pb PCR PCR-RFLP PGE2 PGN PRRs R702WMUTF R702WR R702WWTF Rip2/RICK RNA S1 S2 S3 SNPs STAT-4 Taq T-bet Thr399Ile TIR TLR1 TLR1/6 TLR11 TLR2 TLR3 TLR4 TLR7 TLR8 TLR9 TLRs : Proteína de unión a LPS : Lipopolisacaridos : Ácido lipoteicoico : Mitógeno activador de proteína Quinasa : Muramildipeptido : Metaloproteinasas : Mutante : Enzima de restricción NcoI : Factor nuclear kappa B : Dominio de oligomerización unido a nucleótidos - 1 : Dominio de oligomerización unido a nucleótidos - 2 : Oxido nítrico sintetasa 2 : Pella 1 : Pella 2 : Pella 3 : Periodontitis agresiva : Lipoproteína bacteriana sintética : Patrones moleculares asociados a patógenos : Pares de Bases : (Polymerase Chain Reaction) Reacción en cadena de la polimerasa : (Restriction fragment length polymorphism PCR) : Prostaglandina E2 : Peptidoglicano : Receptores de patrones de reconocimiento : Partidor sentido mutante de la variante polimórfica Arg702Trp : Partidor Antisentido de la variante polimórfica Arg702Trp : Partidor sentido nativo de la variante polimórfica Arg702Trp : receptor-interacting serine-threonine kinase 2 : Ácido Ribonucleico : Sobrenadante 1 : Sobrenadante 2 : Sobrenadante 3 : (Single Nucleotide Polymorphisms) Polimorfismos de un sólo nucleótido. : (Signal transducer and activator of transcription 4) activador transcripcional y transductor de señal - 4 : ADN Polimerasa del organismo Thermus aquaticus : Factor de transcripcion T-box especifico de celula T : Mutación puntual de gen TLR4 : Toll/receptor de IL-1 : Receptor tipo Toll 1 : Receptor tipo Toll 1 y 6 : Receptor tipo Toll 11 : Receptor tipo Toll 2 : Receptor tipo Toll 3 : Receptor tipo Toll 4 : Receptor tipo Toll 7 : Receptor tipo Toll 8 : Receptor tipo Toll 9 : Receptores tipo Toll ix TNF-α TRAF-6 VHS WT : Factor de necrosis tumoral alfa : Receptor de TNF asociado al factor - 6 : velocidad de eritrosedimentación : (Wild Type) nativo x RESUMEN Polimorfismos en el gen de los receptores NOD2/CARD15 y Tipo Toll 4 de pacientes chilenos con Enfermedad Inflamatoria Intestinal La Enfermedad de Crohn (EC) y la Colitis Ulcerosa (CU) enfermedades inflamatorias intestinales (EII) multifactoriales que presentan una relación genética importante. Recientemente se han descrito polimorfismos en los genes de los receptores de reconocimiento de patógenos NOD2/CARD15 y Toll tipo 4 (TLR4), que estarían involucrados en la patogénesis de las EII. No existen antecedentes descritos acerca de la frecuencia de estos polimorfismos en población latinoamericana El objetivo principal de esta tesis es determinar la frecuencia de polimorfismos Asp299Gly de TLR4 y L1007fsinC, Arg702Trp, Gly908Arg de NOD2/CARD15 en un grupo de pacientes chilenos portadores de EII. Se estudiará DNA obtenido de sangre periférica de 44 pacientes con EII (22 EC, 22 CU) y 20 controles sanos. Los polimorfismos se determinaron mediante PCR-RFLP o PCR alelo específico. Se caracterizaron ademas características clínicas y demográficas. Dentro de los pacientes diagnosticados con EC, encontramos un patrón clínico inflamatorio en 14 de ellos, 5 pacientes presentaron un fenotipo penetrante y 5 desarrollaron estenosis, en cuanto a la localización de la enfermedad en EC, un xi individuo manifiesto compromiso esofágico, 5 presentaron daño perianal, 7 con compromiso de íleo y 16 pacientes mostraron compromiso colónico. Pacientes diagnosticados con CU, 2 de ellos presentaron proctitis, 2 proctosigmoiditis, 4 colitis izquierda y 14 desarrollaron pancolitis. El análisis genético de NOD2/CARD15 reveló la presencia del alelo Arg702Trp, L1007fsinsC y Gly908Arg, en dos pacientes con EC, uno con EC y uno con CU, respectivamente. El alelo mutado del polimorfismo Asp299Gly del gen de TLR4 fue identificado en dos pacientes uno con EC y uno con CU. PCR y PCR-RFLP es una técnica sensible y confiable, y es considerado un excelente método de detección de polimorfismos. Este es el primer estudio genético realizado en pacientes chilenos con EII, donde se demuestra que los alelos asociados con estas patologías se presentan con una frecuencia equivalente a grupos europeos según lo publicado en estudios anteriores. Sin embargo, factores ambientales u otros polimorfismos genéticos podrían estar involucrados en la patogénesis de EII en nuestra población. xii SUMMARY NOD2/CARD15 and Toll-like 4 receptor gene polymorphism in Chilean patients with Inflammatory Bowel Disease Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) are multifactorial diseases with a genetic background. Genes related to the innate immune response have been observed to be involved. Polymorphisms of Toll-like receptor 4 (TLR4) and CARD15/NOD2 are thought to be involved in the pathogenesis of inflammatory bowel disease (IBD). There is no information about the frequency of these polymorphisms in South American and Chilean populations. The main subject of this thesis is investigate the distribution of NOD2/CARD15 (Arg702Trp, Gly908Arg and Leu1007fsinsC) and TLR4 (Asp299Gly) polymorphisms in Chilean patients with IBD. DNA was obtained from 22 CD, 22 UC patients and 20 healthy individuals. Genotyping was performed by allele-specific PCR and by PCR-RFLP analysis. Clinical and demographic features were characterized. Among the CD patients, the clinical pattern was deemed inflammatory in 14, while five had penetrating and five stricturing, variants. One patient had esophageal involvement, five perianal, seven ileal and in 16 the colon was involved. Among the UC patients, two had proctitis, two proctosigmoiditis, four left-sided colitis and 14 pancolitis. NOD2/CARD15 analysis revealed the presence of the Arg702Trp allele in two CD patients (both xiii Heterozygotes), L1007fsinsC in one CD patient (heterozygote) while Gly908Arg was found in one UC patient. The Asp299Gly TLR4 allele was identified in one UC and one CD patient. PCR and RFLP-PCR is a sensitive and reliable technique, and it is consider an excellent method to detecting genetics polymorphisms. This genetic study shows that the alleles frequently associated with IBD (L1007fsinsC, Gly908Arg and Arg702Trp in NOD2/CARD15 and Asp299Gly TLR4) have a low incidence in Chilean, IBD patients, which is similar to European populations. It is possible that, in addition to environmental factors, other genetic polymorphisms may be involved in the pathogenesis of the disease in Chilean, IBD patients. xiv 1 INTRODUCCION 1.1 Enfermedad Inflamatoria Intestinal Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) se caracterizan por su cronicidad, severidad, complicaciones, morbilidad quirúrgica, limitada eficacia terapéutica médica, deterioro de la calidad de vida de quienes la padecen y un gran riesgo de desarrollar cáncer colorectal (1). Las EII se caracterizan por presentar una respuesta inflamatoria crónica y descontrolada de la mucosa intestinal hacia antígenos provenientes del lumen intestinal (2-4). Las EII son entidades heterogéneas con distintos fenotipos, tales como ileitis, ileocolitis, pancolitis y proctocolitis, además la Enfermedad de Crohn (EC) puede manifestarse con un fenotipo inflamatorio estenosante o penetrante. Esta diversidad en su presentación clínica determina estrategias terapéuticas poco uniformes (5, 6). Pese a la diversidad fenotípica de las EII, su diagnóstico se realiza basándose en exámenes clínicos, endoscópicos, histológicos, radiológicos y serológicos, lo que ha permitido clasificarlas en dos grupos principales, la Colitis Ulcerosa (CU) y la Enfermedad de Crohn (EC). En algunos pacientes muchas de las características de los exámenes se superponen, conformando el subgrupo de Colitis Indeterminada, que comprende entre un 10 a un 15 % de los casos (7). 1 1.1.1 Colitis Ulcerosa La CU es una patología inflamatoria recurrente que afecta principalmente el colon con predominio en la zona distal o recto, se caracteriza por presentar erosiones de intensidad variable, hemorragia, edema local y masiva regeneración epitelial (8) (Figura I). La inflamación afecta exclusivamente a la mucosa intestinal y en escasas situaciones puede extenderse a la capa muscular (3). La mayoría de los pacientes que presenta CU deriva en pancolitis (60%), 25% de los casos se limita a colon izquierdo y un 15% afecta exclusivamente el recto (9), las manifestaciones clínicas asociadas a la CU son crisis de diarreas en muchas ocasiones acompañadas de sangre, compromiso del estado general, fiebre, perdida de peso y compromiso extraintestinal como artralgias, artritis, compromiso dermatológico, ocular y hepático, entre otros (3). (Tabla I) 1.1.2 Enfermedad de Crohn La EC es un trastorno inflamatorio transmural (afecta todas las capas de la pared intestinal), granulomatoso, crónico e idiopático, involucra cualquier segmento del tracto gastrointestinal (Figura I), afectando principalmente íleon terminal y colon; es de carácter discontinuo y asimétrico (9). En la colonoscopía la mayoría de los pacientes presentan ulceraciones en la mucosa, de aspecto normal generalmente y casi un 30% de los afectados presentan granulomas no caseosos (3). Las características clínicas más comunes que presentan los pacientes con EC son el compromiso del estado general, baja de peso, fiebre, diarreas recurrentes, 2 dolor abdominal agudo y reducción del diámetro del intestino llegando a desarrollar estenosis y obstrucción intestinal, formación de abscesos y fístulas principalmente a nivel perianal (3). El compromiso extraintestinal también es frecuente en estos pacientes, con compromiso articular, dermatológico, ocular, entre otros. (Tabla I) A B Figura I. A. Diagrama de la distribución de la Enfermedad de Crohn, se muestra el compromiso inflamatorio de cualquier segmento del tracto gastrointestinal. B. En el caso de la Colitis Ulcerosa, esta afecta principalmente colon con predominio de la zona distal y recto 3 L. Ortigosa; BSCP Can Ped Volumen 30, nº 1 1.2 Los Patrón Inmune de las EII ligandos del lumen intestinal reconocidos por receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) son translocados hacia la lámina propia, en donde se ponen en contacto con células dendríticas (CDs) que poseen receptores de reconocimiento, entre los que destaca los receptores tipo Toll (TLRs) (10). Las CDs son capaces de conectar la inmunidad innata con la adaptativa, a través de la activación de los linfocitos T naïve en órganos linfoides secundarios, pudiendo 4 dirigir la respuesta inmune hacia un perfil Th1 (respuesta inmune celular) como ocurre en la EC o Th2 (respuesta inmune humoral) como se ve en CU, dependiendo del tipo de patógeno y el ambiente de citoquinas circundante (11). Recientemente se ha descrito a la Interleuquina – 17 (IL-17), la que es producida por los linfocitos Th17, cuya función es independiente de Th1 y Th2 (12). 1.3 Etiopatogenia en Enfermedad Inflamatoria Intestinal A pesar que la etiología de las EII aún no se comprende en su totalidad, lo que implica ausencia de un tratamiento definitivo, factores genéticos, inmunológicos y medioambientales han sido relacionados a su patogénesis (13). El tabaquismo, determina un aumento progresivo de la prevalencia de las EII en países desarrollados y también en Chile (5). Además, componentes genéticos han sido asociados al aumento en el riesgo de desarrollar la enfermedad (2). Normalmente el intestino humano está expuesto a una amplia variedad de antígenos provenientes del medio ambiente y de alimentos, discriminando entre antígenos patogénicos de no patogénicos (2). El sistema inmune intestinal se ha desarrollado para proteger simultáneamente al huésped de infecciones patogénicas, mientras mantiene la coexistencia con la flora comensal. El equilibrio entre un estado de respuesta y no-respuesta inmune se mantiene a través de la participación de diferentes tejidos, células, y moléculas efectoras. En las EII este equilibrio se rompe, originando una respuesta crónica descontrolada de la mucosa 5 intestinal hacia antígenos provenientes del lumen intestinal, tales como bacterias comensales o alimentos ingeridos (3, 4). Al respecto, modelos murinos de enfermedad inflamatoria intestinal han contribuido a la identificación de genes candidatos en la regulación de la respuesta inmune innata, como el TLR4 y el regulador intracelular NOD2/CARD15, en este sentido, los polimorfismos de estos genes estarían asociados a la predisposición genética a desarrollar EII (14-16). El aumento de la incidencia y prevalencia de las EII ha sido descrito en áreas desarrolladas del norte de Europa, Reino Unido y Estados Unidos. Sin embargo, la frecuencia de las EII en zonas en desarrollo como Asia, África y Latinoamérica pone en evidencia que su ocurrencia es un proceso dinámico (17). 1.4 Tratamiento de Enfermedad Inflamatoria Intestinal Pese a la falta de antecedentes de esta enfermedad en nuestro país, experiencias recopiladas por un grupo de investigación perteneciente al Departamento de Gastroenterología del Hospital Clínico de la Universidad de Chile ha confirmado un incremento en la incidencia de la enfermedad. De un total de 258 pacientes atendidos en el Hospital Clínico de la Universidad de Chile y Clínica Las Condes entre 1990 y 2002, un 69% de los pacientes con EC y un 59% con CU fue diagnosticado durante el periodo 1996-2002, 181 de ellos correspondieron a CU (70,15%) mientras que sólo 57 presentaban EC (20,09%) con una relación CU/EC de 3,2:1. Además, el 60% de los pacientes eran de sexo femenino (5). 6 Actualmente, el tratamiento para las EII es sintomático e involucra el uso de drogas anti-inflamatorias tales como aminosalicilatos y sulfasalazina. Este tratamiento es eficaz en crisis leves y moderadas de CU y en la EC con compromiso de colon, además estos fármacos son de elección en mantener la remisión de estos pacientes. El uso de corticoides (GC) es muy eficaz para obtener la remisión en las formas moderadas y severas de las EII, se usa principalmente prednisona (18). Este tratamiento esta indicado en el brote leve/moderado de la EC ileal o ileocecal, y puede utilizarse también en forma de enema en casos de CU distal (19). El Tratamiento con Inmunosupresores, como los antimetabolitos azatioprina y 6-mercaptopurina (6MP) son eficaces para tratar pacientes que desarrollan corticodependencia o corticorresistencia, también se emplean como tratamiento para fístulas entéricas y perianales. Los antibióticos de amplio espectro es un tratamiento a considerar en el caso de colitis severa, megacolon toxico y complicaciones de la EC, como abscesos y fístulas. El metronidazol y la ciprofloxacina son los antibióticos de elección específicamente en el uso de brotes leves a moderados de colitis e ileocolitis de la EC (18, 20). 7 El uso de anticuerpos monoclonales anti-factor de necrosis tumoral alfa (infliximab) se ha demostrado eficaz en el tratamiento de la EC, principalmente en el fenotipo inflamatorio y en presencia de fístulas (21). El tratamiento nutricional, ya sea la nutrición parenteral o enteral con dieta elemental o polimérica es de gran utilidad en casos de EC con estenosis, fístulas o malnutrición. La nutrición parenteral tiene utilidad como tratamiento de apoyo pre y post quirúrgico en la CU. Por ultimo el tratamiento quirúrgico tiene utilidad curativa en CU y es de carácter paliativo en la EC, esta medida se lleva a cabo principalmente en pacientes que no responden a la terapia medica intensiva (20) y se basan según el criterio que se expone en la tabla II. (9) 8 1.5 Respuesta Inmune Innata y Patrones de reconocimiento de patógenos La respuesta inmune se activa frente a sustancias extrañas (antígenos), incluyendo microorganismos, proteínas y polisacáridos. El sistema inmune esta formado por diferentes tipos celulares cuyo papel fundamental es la defensa contra la invasión de diferentes toxinas. En esta función colaboran otros mecanismos de defensa inespecíficos, como la integridad de membranas, fagocitosis, etc. 1.5.1 Respuesta Inmune Innata En humanos y otros mamíferos, la respuesta inmune innata proporciona la primera línea de defensa contra la invasión de bacterias patógenas (16). Los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), como lipopolisacáridos (LPS) de bacterias Gram negativas o como el ácido lipoteicoico (LTA) de bacterias Gram positivas son reconocidos por macrófagos y otras células inmunes, produciendo una respuesta aguda hacia esos patógenos (22). Los patógenos poseen patrones estructurales moleculares específicos, llamadas PAMPs, células inmunes reconocen e identifican estos patrones moleculares a través de receptores de detección de patógenos, también conocidos como receptores de reconocimiento de patrones (PRRs). Los PRRs son receptores codificados por una línea germinal que reconocen PAMPs específicos activando la respuesta inmune en la célula. 9 Estudios genéticos en humanos y animales han logrado relacionar el sistema inmune innato con la inflamación crónica. Recientes investigaciones han demostrado que variantes genéticas en los PRRs del hospedero estarían involucradas en el aumento de la susceptibilidad a generar colitis. Los PRRs son moléculas de diferentes familias, tales como NOD2/CARD15, receptores de PAMPs intracelulares, y Receptores de membrana tipo Toll (TLR) (23), que al reconocer productos microbianos inician una respuesta inflamatoria (24) 1.5.2 Receptores Toll La vía de transduccional del receptor Toll de Drosophila muestra una alta similitud con la vía de la interleuquina 1 (IL-1) en mamíferos, que se asocia con la activación del factor transcripcional nuclear kappa B (NF-κB) que activa respuestas inflamatorias (25). Los receptores tipo Toll (TLRs) comprenden la familia de receptores transmembrana de tipo I, son caracterizados por poseer un dominio extracelular rico en repeticiones de leucina (LRRs) y un dominio intracelular TIR (Toll/receptor de IL-1/resistencia) (26) Los TLRs reconocen selectivamente una gran variedad de PAMPs (27), en la actualidad se han identificado 11 TLRs (28). Los TLRs 1, 2, 4, 5 y 6 se ubican en la superficie celular y reconocen PAMPs de origen bacterianos (25) (Figura II), mientras que los TLRs 3, 7, 8 y 9, se asocian principalmente al reconocimiento de ácidos nucleicos, bacterianos y virales, hasta la fecha se ha reportado localización intracelular endosomal (29) (Figura III). 10 Figura II. Diagrama de la vía transduccional de los receptores TLR asociados a la membrana plasmática con sus respectivos ligandos (interacción PRRs-PAMPs), se observa la interacción de moléculas adaptadoras (MyD88) con los dominios TIR de los TLRs, MyD88 genera la activación de quinasas asociadas al receptor de IL-1 (IRAK) y del factor 6 asociado al receptor TNF (TRAF-6) provocando la translocación al núcleo celular del factor transcripcional NF-κB, se observa además la vía independiente de MyD88, que genera la activación de NF-κB por medio de las proteínas fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y el homólogo celular del oncogen transformante del retrovirus AKT8 (Akt), estimulando también la generación de citoquinas proinflamatorias. 11 Figura III. Diagrama que representa la vía transduccional de los receptores TLR asociados al endosoma (TLR 3,7/8,9) con sus respectivos ligandos virales (interacción PRRs-PAMPs), se observa interacción de moléculas adaptadoras MyD88 y TRIF, con los dominios TIR de los TLRs, generando la activación de factores transcripcionales (NF-κB, IRF 3/7 y ATF2) y su traslocación al núcleo celular, generando la síntesis de IFNs. En particular, esta tesis se centro en el estudio de TLR4. Estudios realizados sobre este receptor muestran que cepas murinas C3H/HeJ y C57BL/10ScCr son resistentes al shock endotóxico, debido a mutaciones en el gen TLR4 que provocan una hipo respuesta a lipopolisacáridos (LPS) (30) El TLR 4 reconoce específicamente al LPS, aunque también taxol (un potente agente antitumoral en humanos), derivado de Taxus Brevifolia (31) e 12 identifica de igual forma proteínas del virus respiratorio sincicial (32). Además, TLR4 reconoce algunos ligandos endógenos, tales como, proteínas de shock térmico (HSP60 y HSP70), involucradas en la inflamación asociada a la arteriosclerosis entre otros efectos (25). El reconocimiento de LPS requiere de moléculas adicionales. El LPS se une a una proteína de unión a LPS presente en el suero (LBP), el complejo LPS-LBP es reconocido por el co-receptor CD14 (cluster de diferenciación 14) (27), que se expresa en monocitos, macrófagos y neutrófilos. La estimulación por LPS provoca la interacción entre el CD14 y TLR4, y posteriormente se une a este complejo la proteína MD-2, que se asocia a la porción extracelular del TLR4 para estabilizar el complejo (33). 1.5.3 Receptores Intracelulares Las proteínas que contienen el dominio de oligomerización unido a nucleótidos (NOD) comprenden una familia de receptores de reconocimiento intracelular de componentes bacterianos (34), que en esta tesis se enfoco en el estudio genético de uno de sus integrantes, el NOD2/CARD15. 13 1.5.3.1 Dominio de oligomerización unido a nucleótidos – 2 (NOD2/CARD15) La expresión de NOD2/CARD15 confiere sensibilidad a peptidoglicano (PGN) en varios tipos celulares (29), en particular a. un derivado de este, el muramil dipéptido, MurNAc-L-Ala-DisoGln (MDP) (35, 36). El MDP esta presente en la mayoría de las bacterias, por lo que NOD2/CARD15 juega un importante papel en la identificación de antígenos bacterianos a nivel intracelular. El reconocimiento de PGN por parte de NOD2/CARD15 induce su oligomerización, reclutando receptores que interactúan con proteínas serina/treonina quinasas 2 (Rip2/RICK) (36) que conduce a la activación de NF-κB vía el receptor de TNF y TLR4 (37). Una deficiencia en la expresión de Rip2/RICK predispone a una mayor sensibilidad a la infección provocada por patógenos intracelulares como Listeria monocytogenes (19). Al introducir NOD2/CARD15 en fibroblastos de embriones deficientes en Rip2/RICK no se genera activación de NF-κB (38). De este modo, Rip2/RICK es esencial para que NOD2 ejerza su acción de reconocimiento de PGN a nivel intracelular (29). 14 1.5.4 Polimorfismos genéticos en PRRs Los factores genéticos juegan un papel importante en la patogénesis de EC y CU. Estudios epidemiológicos en gemelos monocigóticos y bicigóticos, como también en estudios familiares, afirman que el componente genético en EC es mucho más fuerte que en CU (2). El gen TLR4 y sus dos variantes polimorficas, Asp299Gly y Thr399Ile (Figura IV), han sido descritas en pacientes con EC y CU (14). Los polimorfismos de TLR4 se asocian fuertemente con el desarrollo de EII de acuerdo con las diferencias étnicas en una población (39). La asociación entre mutaciones del gen NOD2/CARD15 y las EII, principalmente EC, ha sido descrita recientemente (16). Las variantes genéticas de NOD2/CARD15 que contienen las mutaciones Gly908Arg, Arg702Trp y L1007fsinsC (Figura V), han sido asociadas con una activación defectuosa de NFκB en respuesta a componentes bacterianos (40, 41). Este déficit en las vías de señalización intracelular frente a productos bacterianos, deterioran la respuesta inmune innata que es esencial para contrarrestar la invasión bacteriana inicial, y puede condicionar a estos pacientes a presentar una inflamación crónica y destrucción de la mucosa. Las células epiteliales y los macrófagos intestinales de lesiones por EC presentan una mayor expresión de NOD2/CARD15. Las células de Paneth, que se encuentran principalmente en el íleon terminal, explicarían la 15 mayor asociación que existe entre NOD2/CARD15 y EC, con compromiso ileal predominante. Variantes polimórficas descritas para TLR4 Asp299Gly glicina ácido aspártico O O H HO OH OH NH2 O NH 2 GAC GGC Thr399Ile isoleucina treonina O HO O OH OH NH 2 NH 2 ACU AUU Figura IV. Las mutaciones puntuales producidas en la posición 299 del gen del TLR4, muestran el cambio de una adenina por una guanina, que genera una variación en la lectura del codón, expresando una glicina en la posición del ácido aspártico. La mutación en la posición 399 del gen del TLR4, donde existe el cambio de una citosina por un uracilo, que genera una variación en la lectura del codón, sintetizándose una Isoleucina en la posición de la treonina. 16 Variantes polimórficas descritas para NOD2/CARD15 Arg702Trp triptofano arginina N N N N N O O N UGG CGG Gly908Arg arginina glicina O N H N N OH NH 2 GGA O N CGA Figura V. Las mutaciones puntuales producidas en la posición 702 del gen NOD2/CARD15, donde existe el cambio de una citosina por un uracilo, lo que genera una variación en la lectura del codón, sintetizándose un triptofano en la posición de la arginina. La mutación en la posición 908 del gen NOD2/CARD15, donde existe el cambio de una guanina por una citosina, lo que genera una variación en la lectura del codón, sintetizándose una arginina en la posición de la glicina. Las mutaciones en el gen NOD2/CARD15 se han asociado al fenotipo estenosante, a resecciones ileales frecuentes y a presentación a edad precoz (42, 17 43). Pacientes con la variante polimórfica Arg702Trp tendrían una evolución más lenta que aquellos sin esta variante (6, 44). Las mutaciones estudiadas en el gen NOD2/CARD15 afectan principalmente al dominio LRR (Figura VI). Aun no es claro el mecanismo de susceptibilidad que genera las mutaciones de NOD2 en pacientes con EC. Las mutaciones en NOD2/CARD15 se asocian también con el síndrome de Blau, artritis granulómatosa y uveítis, todas ellas enfermedades inflamatorias (45). Además, la presencia de estas mutaciones podría ser un factor de riesgo genético de desarrollo de cáncer colorectal esporádico (46). Activación de apoptosis y de NF-κB Oligomerización Reconocimiento bacteriano 28 124 127 220 CARD1 CARD2 273 557 Dominio de unión nuclear 744 1020 1040 Región de repeticiones de Leucina N-Terminal C-Terminal Arg702Trp Gly908Arg L1007fsinC Figura VI. Diagrama del gen NOD2/CARD15 y la localización de las variantes genéticas asociadas a EC, los números representan la posición de los aminoácidos. 18 2 HIPOTESIS Dado que los PRRs se asocian directamente al reconocimiento de componentes bacterianos a nivel de mucosa intestinal y debido a que factores genéticos juegan un papel importante en la patogénesis de EIIs, la hipótesis es: Polimorfismos en los genes de los receptores de reconocimiento de patógenos NOD2/CARD15 y Toll tipo 4 (TLR4) se relacionan con Enfermedad inflamatoria intestinal en pacientes Chilenos 2.1 Objetivo General El objetivo de esta tesis es determinar la frecuencia de polimorfismos Asp299Gly de TLR-4 y L1007fsinC, Arg702Trp, Gly908Arg de NOD2/CARD15 en un grupo de pacientes chilenos portadores de EII 2.2 Objetivos Específicos 1. Estudiar mediante análisis bioinformático los polimorfismos de los genes TLR4 y NOD2/CARD15 y diseñar oligonucleótidos específicos para su detección. 19 2. Determinar las características clínicas y demográficas de las EIIs, basados en el análisis del historial médico, tipificación grupos sanguíneos (0, A, B ó AB) y factor Rh. 3. Estudiar la frecuencia y asociación de los polimorfismos asociados a los genes TLR4 y NOD2/CARD15 en una muestra de pacientes chilenos con EII. 2.3 Diseño Experimental Para desarrollar el Objetivo específico 1: Estudiar mediante análisis Bioinformático de secuencias y oligonucleótidos se utilizaron diversas herramientas, tales como programas de alineamiento de las secuencias obtenidas con las secuencias consenso, publicadas y analizar la presencia de polimorfismos, se realizaron ensayos BLAST (The Basic Local Alignment Search Tool). Este programa permite comparar la secuencia a analizar contra una gran cantidad de secuencias que se encuentran en la base de datos NCBI (National Center for Biotechnology Information), mediante una heurística. El diseño y análisis de los oligonucleótidos se realizó mediante el programa Vector NTITM para PC (Vector NTI Advance 9.0) y el OligoAnalyzer (“Integrated DNA Technologies”, www.idtdna.com). 20 Con el fin de evaluar el objetivo específico 2: “Estudiar características clínicas y demográficas de las EIIs”; nos basamos en la clasificación de fichas clínicas, donde se detallan, sexo, edad, edad de diagnóstico, duración de la enfermedad (meses), herencia, manifestaciones extraintestinales, parámetros analizados en pacientes portadores de EIIs, tales como, endoscopías, colonoscopías y/o exámenes de imageneología, además se realizo la tipificación de grupos sanguíneos (ABO) de pacientes y controles, mediante la detección e identificación de anticuerpos eritrocitarios in vitro. Con la finalidad de evaluar el objetivo específico 3, “Determinar la frecuencia de polimorfismos en los genes TLR4 y NOD2/CARD15” se utilizó DNA genómico obtenido a partir de sangre heparinizada utilizando el método de Chomczynski. En cada muestra se cuantificó la concentración de ADN por Espectroscopía de UV, para realizar posteriormente la reacción de genotipificación por PCR (polymerase chain reaction) y PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism PCR). La genotificación de los polimorfismos genéticos de TLR4, Asp299Gly, se llevó a cabo utilizando PCR-RFLP. Los partidores específicos que se utilizaron para TLR4 Asp299Gly están detallados en la Tabla III. El partidor sentido lleva incorporado el nucleótido alterado que genera un sitio de restricción sensible a NcoI. Después de la digestión el tamaño de los fragmentos para portadores del alelo polimórfico disminuirían de 249 pb (nativo) a 223 pb para el residuo 299. Se 21 realizó PCR-RFLP para la variante genética de NOD2/CARD15 Gly908Arg utilizando la enzima de restricción HhaI y partidores detallados en la tabla III. La mutación “missense” Arg702Trp y L1007fsinsC se genotipificó por amplificación de PCR mediante el ensayo de alelo específico utilizando dos partidores sentido específicos para cada alelo, en combinación con un partidor reverso común (Tabla III), en dos reacciones de PCR separadas. El terminal 3’- de los partidores sentido alinea con una región que difiere entre los dos alelos. Los productos de PCR se resolvieron en geles de poliacrilamida y visualizados por tinción con bromuro de etidio. 3 PACIENTES, MATERIALES Y METODOS 3.1 Pacientes 3.1.1 Criterios de inclusión Se consideró como paciente portador de EII aquellos que presentaron un debut de su enfermedad al momento del diagnóstico o que presentaron una reactivación de la misma y que cumplieron con los siguientes criterios clínicos y diagnóstico: Se consideraron portadores de EC a aquellos pacientes que presentaban un cuadro clínico sugerente, con alteraciones del intestino delgado, 22 colon o ambos, con biopsias altamente compatibles. La localización y extensión del compromiso de EC se determinó por endoscopía o colonoscopía y/o exámenes por imágenes (tránsito intestinal, tomografía de abdomen y pelvis y enema baritado). Se consideraron portadores de CU a aquellos pacientes que, además de presentar un cuadro clínico sugerente, contaban con alteraciones endoscópicas características del colon y biopsias compatibles con el diagnóstico y en quienes se habían descartado causas inflamatorias específicas o infecciones bacterianas o parasitarias. Los pacientes incluidos en el estudio cumplieron los siguientes criterios 1. Pacientes de ambos sexos, mayores de 14 años. 2. Presencia de fase activa de la enfermedad. • En el caso de la CU se consideraron pacientes en fase activa aquellos que presentaron un puntaje mayor a 6 en el score de Mayo (47). • En el caso de EC se consideraron pacientes en fase activa aquellos que presentaron un índice de actividad de Enfermedad de Crohn (CDAI) mayor a 220 (48) o bien aquellos que presentaron evidencias de complicaciones como absceso, fístula o estenosis. 23 3. Los pacientes con EII fueron reclutados en el Hospital Clínico de la Universidad de Chile. Los pacientes ambulatorios con CU activa fueron tratados con corticoides en forma oral en dosis 4,0-60 mg de prednisona al día (49). Cuando el paciente requirió hospitalización por la severidad de su cuadro o frente a la presencia de complicaciones se trataron con esteroides por vía endovenosa. Se consideraron pacientes en remisión o en etapa inactiva, a aquéllos que obtuvieron un score de Mayo menor o igual a 2 (50). Los pacientes portadores de EC activa fueron tratados con esteroides corticoides en forma oral en dosis 40-60 mg de prednisona al día en el caso de los pacientes ambulatorios. Cuando el paciente requirió de hospitalización por la presencia de complicaciones y grado de severidad de su enfermedad, se trató con esteroides por vía endovenosa. Se les administró antibióticos (metronidazol y/o ciprofloxacino) según el tipo de cuadro clínico que presentó el paciente y frente a la sospecha de complicaciones (50). 3.2 Controles Controles libres de la enfermedad: Se consideraron como control a los pacientes del Hospital Clínico de la Universidad de Chile a los cuales su médico tratante haya solicitado una colonoscopía como parte de su estudio clínico por alguna patología digestiva distinta de EC o CU. 24 Para ambos grupos se consignaron las características: 1. Demográficas: sexo, edad, antecedentes familiares de EII, hábito tabáquico. 2. Clínicas: edad de diagnóstico, localización y comportamiento (inflamatorio, estenosis y perforación) de la enfermedad, presencia de manifestaciones extraintestinales (articulares, dermatológicas, oculares, hepatobiliares, vasculares, etc.), necesidad de cirugía y respuesta a tratamiento. Criterios de exclusión: Se excluyeron del estudio, a aquellos pacientes que presenten alguno de los siguientes criterios: • Pacientes portadores de Colitis Indeterminada. • Pacientes asmáticos. • Pacientes portadores de alguna enfermedad de origen autoinmune. • Pacientes portadores de cuadros alérgicos severos. • Pacientes portadores de enfermedad Celíaca. • Pacientes portadores de alguna bacteriemia no identificada. Al grupo de Pacientes y controles se les realizó: 25 • toma de muestra de sangre periférica • biopsias escalonadas de mucosa intestinal mediante colonoscopía. Todos los individuos firmaron carta de consentimiento informado sobre los objetivos de este estudio. Este proyecto fue evaluado por el comité de ética del Hospital Clínico de la Universidad de Chile. Tamaño Muestral: Debido a la falta de antecedentes de prevalencia de la enfermedad en población chilena, se tomó como un 32% de prevalencia en base al valor promedio de datos de prevalencia de ambas enfermedades inflamatorias, en población hospitalaria, en dos regiones de España (17). El tamaño de la muestra se calculó a partir de un universo de 44 pacientes, reclutados en el Hospital Clínico de la Universidad de Chile. El cálculo de tamaño de la muestra se hizo a través del programa “Epi Info 2006” (51) (Método de Arcoseno), en el que se consideraron los siguientes parámetros: Error Tipo I 0.05% a una cola. Error Tipo II 20%. Además, se calculó el tamaño de la muestra con un 5% más en caso de pérdida. El número de sujetos a incluir en el estudio, es de 22 pacientes para CU activa, 22 EC activa y 20 controles sanos a la enfermedad. La selección de la muestra se realizó por oportunidad. 26 Materiales 3.3 3.3.1 Material Biológico • Sangre total de pacientes portadores de EII (EC y CU) • Sangre total de controles sanos. 3.3.2 Enzimas • Taq ADN polimerasa Genesys ®, Fermelo S.A. • NcoI enzima de restricción Invitrogen™ • HhaI enzima de restricción Invitrogen™ • Reactivos monoclonales tipificadores del sistema ABO (anti-A, anti-B y anti-AB) (BiosChile S.A.) 27 3.3.3 Oligonucleótidos Tabla III. Genotificación de los polimorfismos genéticos MUTACION Asp299Gly Gly908Arg Arg702Trp L1007fsinsC GEN ORIENTACI ON PARTIDORES Sentido (FW) 5’GATTAGCATACTTAGACTACTACCTC CATGGT-3’ TLR4 Antisentido (REV) 5’GATCAACTTCTGAAAAAGCATTCCCAC3’ Sentido (FW) 5’ CCCAGCTCCTCCCTCTTC 3’ NOD2/CARD15 NOD2/CARD15 NOD2/CARD15 AMPLIC ON UBICACIÓN EXONAL 249bp Exón 4 Bases 1029 a la 1278 380bp Antisentido (REV) 5’-AAGTCTGTAATGTAAAGCCAC-3’ Sentido (FW1) 5’ ATCTGAGAAGGCCCTGCTCC-3’ Sentido (FW2) 5’-ATCTGAGAAGGCCCTGCTCT 3’ Antisentido (REV) 5’ CCCACACTTAGCCTTGATG-3’ Sentido (FW1) 5’ CAGAAGCCCTCCTGCAGGCCCT 3’ Sentido (FW2) 5’ CAGAAGCCCTCCTGCAGGCCCCT-3’ Antisentido (REV) 5’ TCTTCAACCACATCCCCATT-3’ Exón 8 Exón 4 Exón 11 28 3.4 Métodos 3.4.1 Extracción ADN A partir de 500 µL sangre heparinizada total se agregaron 25 mL de buffer de lisis (Cloruro de amonio 0,15 M, carbonato monoácido de potasio 10 nM, EDTA disódico 0,1 mM) se homogenizó y luego se centrifugó a 3500 RPM por 10 minutos a 4ºC (Centrifugación 1), obteniendo sobrenadante 1 (S1) y pella 1 (P1) Posteriormente se eliminó S1 y P1 se resuspendió en 5 mL de buffer de lisis, este se centrifugó 3500 RPM por 10 minutos a 4ºC (Centrifugación 2), obteniendo S2 y P2. El siguiente paso consistió en eliminar S2 y P2 se resuspendió con 1 mL de solución de Chomczynski, se traspaso a tubo eppendorf, y se centrifugó a 1200 RPM por 10 minutos a Tº ambiente (Centrifugación 3), obteniéndose S3 y P3. A S3 (P3 se elimina) se le agregó alcohol isopropílico a –20ºC en proporción 1:1, se mezcló suave por agitación y se obtuvo un precipitado blanquecino de ácidos nucleicos. El precipitado se separó y se recolectó en tubo eppendorf, se agregó 1mL de Etanol 70% a –20ºC dejando reposar por 5 - 10 minutos, para eliminar sales contaminantes. Se eliminó el Etanol y se repitió el proceso anterior. Después del 29 segundo lavado con Etanol se dejó secar 15 minutos a temperatura ambiente y se resuspendió el ADN en 300 µL de buffer TE 1X pH 8,6. (52) 3.4.2 Detección e identificación de grupo sanguíneo Se analizó suero de pacientes y controles para detectar anticuerpos contra antígeno eritrocitarios (isoaglutininas), mediante hematíes A, B y O previamente tipificados. Se procedió según fabricante del kit comercial, utilizando técnica en lámina, considerando el diagnostico según las reacciones positivas que generan aglutinación de los hematíes. 3.4.3 Análisis Genético, Detección de polimorfismos 3.4.3.1 Polimorfismos TLR4 El polimorfismo Asp299Gly, variante genética del receptor TLR4, fue genotipificado mediante análisis de PCR-RFLP. Los partidores de PCR utilizados fueron: Sentido (FW) :5’ GATTAGCATACTTAGACTACTACCTCCATGGT 3’ Antisentido (REV) :5’ GATCAACTTCTGAAAAAGCATTCCCAC 3’. La base destacada en color en el primer sentido (FW) indica la localización del nucleótido alterado usado para generar un sitio de restricción (TLR4 30 Asp299Gly) reconocido por la enzima de restricción NcoI. Posteriormente se realizó la amplificación por PCR: 1 Hold 35 ciclos 1 Hold Temperatura 94.0ºC 94ºC 53ºC 72ºC 4ºC Tiempo 4 min 45 seg 1 min 45 seg ∞ El protocolo de amplificación generó un transcrito de 249 pb, producto que fue digerido con 1 U de enzima de restricción NcoI, a 37°C, por 12 horas. Posterior a la digestión, el alelo que posee la base nitrogenada adenina en el primer sentido, es el nativo, y por lo tanto, no posee la mutación. Este alelo genera el fragmento de 249 pb, y el que posee guanina, responsable de la mutación puntual, genera el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción NcoI, obteniendo dos fragmentos de 223 y 26 pb (Figura VII). Figura VII. Esquema de análisis de restricción realizado para confirmar la variante Asp299Gly de TLR4 31 3.4.3.2 Polimorfismos NOD2/CARD15 La mutación “missense” de la variante genética Gly908Arg del gen NOD2/CARD15 genera un sitio de restricción que es reconocido por la enzima HhaI, este polimorfismo fue identificado mediante análisis de PCR-RFLP, los partidores utilizados en esta tipificación fueron: Sentido (FW) :5’ CCCAGCTCCTCCCTCTTC 3’ Antisentido (REV) :5’ AAGTCTGTAATGTAAAGCCAC 3’ 1 Hold 35 ciclos 1 Hold Temperatura 94.0ºC 94ºC 55ºC 72ºC 4ºC Tiempo 4 min 45 seg 1 min 45 seg ∞ Después de la digestión que se realizó a 37°C, por 12 horas, el alelo nativo generó un fragmento intacto de 380 pb, mientras que el perfil RFLP de la variante Arg908 generó dos fragmentos de 138 pb y 242 pb después de la digestión enzimática con HhaI. La mutación puntual Arg702Trp fue analizada y genotipificada por amplificación de PCR alelo específico, usando dos partidores sentido. Uno correspondiente al partidor sentido alelo específico nativo (R702WWTF) y el otro 32 partidor sentido alelo específico mutado (R702WMUTF), ambos oligonucleótidos se complementan con un partidor reverso común (R702WR). Sentido (R702WWTF) :5’ ATCTGAGAAGGCCCTGCTCC-3’ Sentido (R702WMUTF) :5’-ATCTGAGAAGGCCCTGCTCT 3’ Antisentido (R702WR) : 5’ CCCACACTTAGCCTTGATG-3’ La reacción de PCR se realizó en dos procedimientos por separado siguiendo un protocolo único: 1 Hold 40 ciclos 1 Hold Temperatura 94.0ºC 94ºC 57ºC 72ºC 4ºC Tiempo 4 min 45 seg 1 min 45 seg ∞ La región 3´ de los partidores alineó en forma heterogénea, diferenciando los alelos nativo y mutado en estudio. La inserción de una citosina en el marco de lectura del gen que codifica para NOD2/CARD15, generó una variante polimórfica que fue genotipificada mediante la amplificación por PCR realizando ensayos de alelos específicos. Para esta variante denominada L1007fsinsC, usamos dos partidores sentido. Uno correspondiente al partidor sentido alelo específico nativo (L1007fsinsCWTF) y un 33 partidor sentido alelo específico mutado (L1007fsinsCMUTF), ambos oligonucleótidos se complementan con un partidor reverso común (L1007fsinsCR) Sentido (L1007fsinsCWTF) : 5’ CAGAAGCCCTCCTGCAGGCCCT 3’ Sentido (L1007fsinsCMUTF) : 5’ CAGAAGCCCTCCTGCAGGCCCCT 3’ Antisentido (L1007fsinsCR) : 5’ TCTTCAACCACATCCCCATT 3’ El procedimiento se realizó en dos reacciones de PCR por separado, en donde la región 3´ de los partidores fue capaz de alinear en forma heterogénea, diferenciando los alelos nativo y mutado. 1 Hold 45 ciclos 1 Hold Temperatura 94.0ºC 94ºC 68ºC 72ºC 4ºC Tiempo 4 min 45 seg 1 min 45 seg ∞ 3.4.4 Electroforesis en geles de poliacrilamida Se utilizaron geles de poliacrilamida al 10%, pH neutro, para la separación electroforética de fragmentos de ADN obtenidos. El ADN fue visualizado mediante tinción de bromuro de etidio y fluorescencia con luz UV, se estimó peso molecular utilizando marcador de peso molecular Invitrogen™ de 100 pb. 34 3.4.5 Análisis Estadístico Todos los valores fueron expresados como promedio + SE. Se utilizó el test de χ2 para establecer la significancia estadística de las diferencias de frecuencias génicas y genotípicas del polimorfismo estudiado entre los grupos de pacientes portadores de EII y control. Se consideró una diferencia estadísticamente significativa con un valor de p < 0.05 35 4 RESULTADOS Las características clínicas y demográficas de los pacientes con EC y CU se observan en las tablas IV y V. En ambos grupos de pacientes se observó una marcada tendencia al sexo femenino, las características demográficas del grupo control fueron similares. El predominio de individuos con una herencia americana nativa fueron similares entre pacientes con EC (55%), pacientes CU (62%) y controles sanos (57%), característica observada mediante la identificación de grupos sanguíneos A, B, O. (Tabla IV, Tabla V). En el grupo de EC, la mayoría de los pacientes (14 pacientes) tiene solo compromiso colónico, otros 5 desarrollo compromiso de ileon, 5 pacientes tienen daño perianal, dos pacientes generaron compromiso íleo-colon y solo uno desarrollo enfermedad esofágica. La mayoría de los pacientes (14 pacientes) exhibieron un fenotipo inflamatorio, 10 pacientes presentaron compromiso articular, 12 pacientes no presentaron consumo de tabaco y sólo un paciente con EC presentó relación hereditaria directa con un pariente que padecía de CU. Entre los pacientes con CU, la mayoría (14 pacientes) desarrollaron pancolitis y se reportaron manifestaciones articulares en 10 de ellos, 10 pacientes se catalogaron como ex– fumadores (definidos como pacientes que dejaron el hábito tabáquico a lo menos 6 meses antes del diagnostico de EII). 36 Tabla IV. Manifestaciones Clínicas de pacientes portadores de EC Pacientes Masculino/ Femenino Edad (Años) Edad de Diagnóstico Duración de la enfermedad (Meses) EII Familiar n (%) Manifestaciones Extraintestinales Articular Dermatológica Ocular Ulceraciones Bucales Habito Tabaco n (%) Nunca Fumador Ex Fumador Localización de la enfermedad n (%) Esofágica Íleo Colon Enfermedad Perianal Íleo-colon Patrón de la Enfermedad (%) Inflamación Estenosis Penetrante Cirugía n (%) Grupos Sanguíneos 8/14 46.8 Años (16/65) 41.6 Años (14/65) 40 Meses (1-216) 1(5) n % 10 (45) 5 (23) 2 (18) 5 (23 12 (55) 5 (23) 5 (23) 1 (5) 5 (23) 14 (64 5 (23) 2 (9) 14 (64) 5 (23) 5 (23) 10 (45) A 8(27.3) B 2(9.1) O 14(63.4) 37 Tabla V. Manifestaciones Clínicas de pacientes portadores de CU Pacientes Masculino/ Femenino Edad (Años) Edad de Diagnóstico Duración de la enfermedad (Meses) EII Familiar n (%) Manifestaciones Extraintestinales Articular Dermatológica Ocular Ulceraciones Bucales Habito Tabaco n (%) Nunca Fumador Ex Fumador Localización de la enfermedad n (%) Proctitis Rectosigmoiditis Colitis ulcerosa izquierda Pancolitis Cirugía n (%) Grupo Sanguíneo 9/13 37.8 Años (19/67) 32 Años (11/59) 9 Meses 0(0) n % 10 (45) 3 (14) 0 (0) 4 (18) 8 (36) 4 (18) 10 (45) 2 (9) 2 (9) 4 (18) 14 (64) 3 (14) A 8(36.4) B 0(0) O 14(63.6) Cuatro pacientes presentaron alguna de las tres mutaciones analizadas en el gen NOD2/CARD15, tres con EC y uno con CU (Tabla VI). La variante polimórfica Arg702Trp fue observada en dos pacientes con EC, ambos heterocigotos (Figura VIII). Uno de estos pacientes presentaba un diagnostico temprano de Crohn, mientras que el otro exhibía un compromiso íleo-colónico y un fenotipo penetrante. La mutación “missense” de la variante genética L1007fsinsC del gen NOD2/CARD15 se observó en solo un paciente heterocigoto portador de la EC, 38 quien mostró además compromiso colónico y esofágico, con un fenotipo de estenosis intestinal. NOD2/CARD15 Arg702Trp MUT CONTROL NOD primer mutante 439 pb NOD primer control 439 pb Heterocigoto Homocigoto Figura VIII. El gel de poliacrilamida muestra la expresión de la variante genética Arg702Trp del gen NOD2/CARD15, se observa la comparación entre la variante polimórfica (MUT) y la expresión nativa del gen de un sujeto control. El carril correspondiente al MUT alinea para ambos pares de partidores sentido (Primer mutante y primer control), frente a un partidor Antisentido común, esto no ocurre en el control, solo hay complementariedad entre el primer sentido control y el Antisentido común. La mutación Gly908Arg fue observada en un paciente con pancolitis ulcerativa y de carácter heterocigoto para la mutación. (Figura IX). Ninguno de los pacientes estudiados presentó más de una mutación para NOD2/CARD15 y ningún individuo control mostró variantes polimorficas. 39 Tabla VI. Genotipos de NOD2/CARD15 y alelos Estudiados Mutación Nº Diagnostico Arg702Trp 1 EC L1007finsC 1 1 EC EC Patrón de la Enfermedad Inflamación Colon, presentación temprana Penetrante Gly908Arg 1 CU Estenosis Total Localización de la Enfermedad Íleo-Colón Tracto gastroesofágico y colon Pancolitis 4 NOD2/CARD15 Gly908Arg MUT CONTROL 380 pb 242 pb 138 pb Figura IX. El gel de poliacrilamida muestra la expresión de la variante polimórfica Gly908Arg del gen NOD2/CARD15, se muestra la comparación entre el mutante (MUT) que presenta fragmentos del DNA debido al ataque realizado por la enzima de restricción HhaI y la expresión nativa del gen (WT) de un sujeto control que muestra una banda integra. El polimorfismo Asp299Gly se observó en dos pacientes, uno de ellos presentaba EC con compromiso de colon y perianal, además, exhibía un importante fenotipo inflamatorio, y el segundo paciente presentaba pancolitis ulcerativa (CU) (Figura X) (Tabla VII). Ninguno de los controles presentó variantes 40 polimórficas para TLR4, así como ninguno de los pacientes con EC o CU mostró coexistencia con cualquiera de las variantes analizadas para los genes codificantes de NOD2/CARD15 y TLR4. TLR4 Asp299Gly CU MUT CONTROL EC MUT 399 pb 377 pb Figura X. El gel de poliacrilamida muestra la expresión de la variante polimórfica Asp299Gly del gen TLR4, se muestra la comparación entre el mutante (MUT) que presenta dos bandas o fragmentos del DNA debido al ataque realizado por la enzima de restricción NcoI y la expresión nativa del gen de un sujeto control que muestra una banda integra. Tabla VII. Genotipo de TLR4 y alelos Estudiados Mutación Nº Diagnóstico Asp299Gly 1 EC CU Total 1 2 Patrón de la Enfermedad Inflamación Localización de la Enfermedad Colon, perianal Pancolitis 41 5 DISCUSION Este es el primer estudio que determina la prevalencia de la mutación del gen de NOD2/CARD15 y TLR4 en pacientes chilenos con CU y EC. A pesar que el número de pacientes en este estudio es bajo, nuestros resultados confirman, que similar a la situación que ocurre con la población europea, los pacientes chilenos tienen una baja frecuencia de las variantes alélicas asociadas a EII. A pesar del origen étnico de la población chilena es heterogénea que resulta de las diversas mezclas raciales que podrían alterar nuestros resultados, la heterogeneidad en este estudio fue evaluado por el sistema de grupo sanguíneo ABO y sugiere un porcentaje similar de componente Amerindio en todos los grupos, observándose una mayor frecuencia en el fenotipo sanguíneo de tipo O. La CU y EC son enfermedades multifactoriales, el tratamiento es principalmente sintomático con curso y resultados variables. Algunos pacientes pueden requerir cirugía o presentar complicaciones. La etiología de EII aún no está resuelta, pero se ha visto que estados iniciales se encuentran relacionados a una respuesta inflamatoria anormal contra microflora entérica comensal en individuos genéticamente predispuestos (40). Esta interpretación sostiene el concepto de que los polimorfismos genéticos pueden poseer relevancia como herramientas diagnósticas. Por otro lado, es relevante identificar los mecanismos intracelulares que producen la patogénesis de las EII por medio del desarrollo de nuevas terapias. Estudios recientes asigna un papel a los PRR, NOD2/CARD15 y 42 TLR4, y sus mecanismos de activación como efectores fundamentales en el desarrollo de EII (53). Los polimorfismos genéticos de estos PRR podrían ser un factor de riesgo para el desarrollo de EII e incluso podrían determinar la localización y severidad de la enfermedad. La EC es una enfermedad heterogénea y poligénica. Tres mutaciones del gen NOD2/CARD15 son las más frecuentes en pacientes caucásicos con EC comparada con los sujetos caucásicos control. Estas mutaciones no han sido observadas (54) o son muy raras (55) en pacientes africanos, arábicos (56) y asiáticos (57). En nuestro estudio, tres de 22 pacientes (13,6%) con EC presentan una de las tres variantes analizadas para el gen NOD2/CARD15. El riesgo relativo varía ampliamente en el desarrollo de EC. En la población del norte del Europa disminuye el riesgo que se atribuye al gen NOD2/CARD15 comparada con la población del sur de este continente. Incluso dentro del país existen algunas diferencias. El riesgo de desarrollar EII en pacientes de Edinburgo (Escocia) fue 11% comparada con un 27% de pacientes de Oxford (Inglaterra) (58). Las variantes del gen NOD2/CARD15 en la población Caucásica, muestra que el riesgo total de desarrollar EC en un paciente heterocigoto simple (genotipo MW, en el cual existe un cromosoma mutado y normal) fue de 2,4 (95% IC 2,0-2,9) y el riesgo de las personas con ambos cromosomas mutados (genotipo MM, homocigoto simple o heterocigoto compuesto) fue de 17,1 (95% IC 10,7-27,2) (59). El riesgo para desarrollar EC es incluso más variable entre variantes del gen NOD2/CARD15. El mismo análisis muestra que el riesgo para desarrollar EC fue de 4,1% para la variante L1007fsinsC (95% IC 3,2-5,2) comparada con 2,2% para 43 la variante Arg702Trp (95% IC 1,8-2,6) y 3.0% para la variante Gly908Arg (95% IC 2,4-3,7)(60). En este estudio dos pacientes con EC tienen la variante Arg702Trp y sólo uno la variante L1007fsinsC. Un estudio actual describe que la frecuencia de las variantes NOD2/CARD15 es similar en pacientes y sujetos control, sugiriendo que estas variantes no representarían un factor de riesgo para desarrollar CU (61). No obstante, otros estudios sugieren que el gen NOD2/CARD15 puede interactuar con el haplotipo IBD5 (OCTN1/N2) aumentando el riesgo de desarrollar CU (60). En nuestro análisis únicamente un paciente con CU muestra algunas de las tres variantes (Gly908Arg) para el gen NOD2/CARD15, mientras no hemos evaluado la presencia de las mutaciones del haplotipo IBD5. Las variantes NOD2/CARD15 que influyen sobre el tracto intestinal están involucradas en EC. Son más frecuentes en pacientes con compromiso ileal comparado con los pacientes con EC limitada al colon. La asociación entre las variantes de NOD2/CARD15 y el compromiso del íleon terminal puede ser explicada por la expresión restringida a las células de Paneth de NOD2/CARD15 en el epitelio intestinal y donde presenta mayor abundancia es en el íleon (40). En esta tesis, tres pacientes con EC tienen compromiso de colon, uno de ellos con compromiso asociado al íleon. El grupo muestral es demasiado bajo para explicar la baja frecuencia de las variantes de NOD2/CARD15 en pacientes con 44 enfermedad ileal. Por ahora, no hay estudios que evalúen la presencia de las variantes de NOD2/CARD15 en un gran número de pacientes con EC y compromiso gastrointestinal superior (ejemplo: esófago, estómago, duodeno o yeyuno). Únicamente uno de los cuatro pacientes tiene compromiso esofágico junto a enfermedad colónica. También han sido asociadas las variantes de NOD2/CARD15 con el riesgo de desarrollar estenosis intestinal y fístulas, que tienden a tener una lenta evolución (44). En este estudio de tres pacientes con alguna de las tres variantes de NOD2/CARD15, un paciente posee comportamiento perforante en el íleon y los otros presentaron estenosis en el colon. Las variantes de NOD2/CARD15 también han sido asociadas a una mayor intensidad en la enfermedad, alto riesgo quirúrgico y edad temprana en el diagnóstico. Por otro lado, las variantes de NOD2/CARD15 no han sido asociadas a una alta frecuencia de manifestaciones extraintestinales y no han determinado una respuesta diferencial al tratamiento con infliximab (62). Únicamente, uno de los tres pacientes con esta variante tiene manifestaciones extraintestinales y no a recibido tratamiento con infliximab, pero debido al bajo número de pacientes incluido en este estudio, no es posible determinar si existe alguna relación entre mutación en el gen NOD2/CARD15 y el fenotipo de pacientes chilenos con EC. Una asociación entre EII y polimorfismo de TLR4 ha sido sugerida por varios grupos de investigación. Sin embargo, el papel como predictor genético en el desarrollo y evolución de EII es más débil cuando se compara con las variantes de NOD2/CARD15 (60, 63). El alelo más frecuente de TLR4 descrito en EII es 45 Asp299Gly. Brand y colaboradores reportaron que 14,2% y 14,7% de los pacientes con EC eran heterocigotos para las variantes Asp299Gly y Thr399Ile, respectivamente, comparado a 37,7% de los pacientes que presenta al menos una mutación de NOD2/CARD15 (63). En este estudio, dos pacientes, uno con EC y uno con CU, presentaron el alelo Asp299Gly. No se evaluó la frecuencia polimórfica de Thr399Ile en los casos incluidos. La variante Asp299Gly también ha sido asociada con fenotipo de estenosis (63). Sin embargo, el único paciente con EC, que presenta el alelo Asp299Gly tiene un patrón clínico diferente. Otros grupos de investigación no han encontrado una asociación entre el polimorfismo de TLR4 y el riesgo de desarrollar EII (58). Estas diferencias probablemente podrían deberse a la diversidad étnica de los pacientes incluidos en el estudio y el criterio diagnóstico utilizado. La identificación del polimorfismo del gen de NOD2/CARD15 y TLR4, es una contribución importante para entender la heterogeneidad de EII. Un estudio genético de EII podría convertirse en una poderosa herramienta que ayudaría en la predicción de factores de riesgo en el desarrollo de una enfermedad más agresiva. Hasta hoy, el estudio de diferentes alteraciones genéticas relacionadas a EII (64), podría ayudar en un futuro próximo para mejorar el diagnóstico, pronóstico y el manejo terapéutico del paciente y la evolución de la enfermedad. Un mayor entendimiento de los tratamientos clínicos como resultado del diagnóstico utilizando herramientas genéticas puede mejorar la mortalidad y la calidad de vida de pacientes con EII. El polimorfismo de TLR4 Asp299Gly tiene un papel menor en los estudios poblacionales. Sin embargo, otros factores ambientales y genéticos podrían jugar 46 un papel en el desarrollo y evolución de las EII. Como el número de pacientes en este estudio fue bajo, iniciamos un estudio prospectivo multimétrico para aumentar la fuerza de las conclusiones y adicionalmente consideramos seguir a cada individuo por un largo período de tiempo como una forma de correlacionar fenotipo con genotipo. 47 6 CONCLUSIONES Los polimorfismos genéticos de podrían ser un factor de riesgo para el desarrollo de EII e incluso podrían determinar la localización y severidad de la enfermedad. Las mutaciones de los genes codificantes para TLR4 y NOD2/CARD15 pueden contribuir al desarrollo y evolución de EC y CU en pacientes chilenos con EII. Sin embargo, otros factores ambientales y genéticos podrían jugar un papel en el desarrollo y evolución de las EII Netea, M. y colaboradores, demostraron una relación sinérgica entre NOD2/CARD15 y TLR2 generando una regulación de los niveles de citoquinas pro y anti-inflamatorias, este sinergismo, se pierde en pacientes que presentan EC, específicamente cuando el gen NOD2/CARD15 se encuentra mutado. Sin embargo, recientes estudios demuestran la perdida de este sinergismo en el reconocimiento de MDP/LPS en pacientes con EII, mostrando cierta interacción también entre las vías tranduccionales de NOD2/CARD15 y TLR4 (Figura XI). Se estima que la mutación puntual asociada al dominio extracelular del TLR4, generaría un cambio de afinidad entre PAMPs y PRRs, provocando una sobre-estimulación de la vía tranduccional asociada a NF-kB y de este modo generando la producción de citoquinas proinflamatorias (Figura XI). Es de vital 48 importancia el continuar indagando estos puntos para elucidar de cierta forma la patogénesis asociada a las EIIs. Figura XI. Modelo que representa la localización de las variantes polimórficas de los receptores TLR4 y NOD2/CARD15. Patológicamente las variantes genéticas presentes en el receptor NOD2/CARD15, generarían una anómala oligomerización de la proteína, estimulando así la internalización al núcleo celular del factor transcripcional (NF-kB), generando la sobreproducción de citoquinas inflamatorias, algo similar ocurre en la mutación presente en el gen de TLR4, donde el mal reconocimiento del LPS, potencia la vía tranduccional asociada a NF-kB. 49 7 BIBLIOGRAFIA 1. Russel, M. G., and R. W. Stockbrugger. 1996. Epidemiology of inflammatory bowel disease: an update. Scand J Gastroenterol 31:417-427. 2. Beltran C., G. J., Peralta A., Figueroa C., Quera R., Valenzuela J., Hermoso M.A. 2005. Papel del sistema inmune en el desarrollo de EII. 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Arancibia, C. Beltrán, I. Aguirre, P. Silva, A. Peralta, F. Malinarich, M.A. Hermoso. 2007. Toll-like Receptors are Key Participants in Innate Immune Responses. Biological Research, vol 40, (2). Pag. 97-112 Figueroa C, Peralta A, Herrera L, Castro P, Quera R, Valenzuela J, Hermoso MA. 2006. Polymorphisms in the Toll-like receptor 4 and CARD15/NOD2 in Chilean patientes with inflammatory bowel disease. European Journal of Cytokine Network, 38 (2):,125-130. Beltrán C, Guerrero J, Castro P, Peralta A, Figueroa C, Quera R, Valenzuela J, Hermoso MA. 2005, Papel del Sistema Inmune en el Desarrollo de las Enfermedades Inflamatorias Intestinales (Role of the Immune System in Inflammatory Bowel Diseases Development). Gastroenterología Latinoamericana, Vol.16 (3), Pág.: 208-221 Sepúlveda S.E., Beltrán C.J., Peralta A., Rivas P., Rojas N., Figueroa C., Quera R., Hermoso M.A., Enfermedad Inflamatoria Intestinal: Una Mirada Inmunológica, aceptado para publicación en Revista Médica de Chile (2008). 8.2 Trabajos presentados en Congresos Polymorphisms in the Toll-like receptor 4 and CARD15/NOD2 in Chilean patients with inflammatory bowel disease. Peralta A, Herrera L, Figueroa C, Castro P, Gutierrez A, Quera R, Valenzuela J, Hermoso MA. Falk Symposium 151. Emerging Issues in Inflammatory Bowel Diseases Sydney- Australia, Marzo 2006 Polimorfismos de receptor TLR-4 y de NOD2/CARD15 en un grupo de pacientes chilenos con enfermedades inflamatorias intestinales: estudio preliminar. Figueroa C, Peralta A, Herrera L, Castro P, Gutiérrez A, Valenzuela J, Aguillón JC, Quera R, Hermoso M. XXXII Congreso Chileno de Gastroenterología. Pucón-Chile, Noviembre 2005 55 56
