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233.391
■ ARTÍCULOS ORIGINALES
Estudio del número de neuronas del núcleo
ambiguo y sus parámetros morfométricos
tras lesión y regeneración del nervio laríngeo
recurrente de la rata
Arán Pascual-Font, Eva Maranillo, Teresa Vázquez, José Ramón Sañudo y Francisco J. Valderrama-Canales
Departamento de Anatomía y Embriología Humana I. Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid. Madrid. España.
Introducción y objetivo: Para conseguir la reinervación
funcional y/o el trasplante ortotópico tras lesiones de los
nervios laríngeos es esencial conocer la reorganización
morfofuncional de las neuronas que inervan la laringe. Debido a la escasez de este tipo de estudios en la literatura
consultada, en nuestro trabajo estudiamos la organización
de las motoneuronas laríngeas del núcleo ambiguo (NA)
tras sección y posterior regeneración del nervio laríngeo recurrente (NLR) de la rata adulta.
Material y métodos: El trazador utilizado fue la dextranamina biotinada (BDA) de peso molecular 3 kDa, lo que representa una innovación en la literatura científica consultada, nunca antes utilizada en este modelo. Los sujetos se
distribuyeron en un grupo control de 14 animales y cuatro
grupos experimentales de entre 10 y 16 animales cada uno.
En los grupos experimentales se estudió la regeneración en
cuatro intervalos de tiempo tras la axotomía: entre 21 y
28 días, entre 42 y 60 días, entre 90 y 120 días y entre 150 y
180 días. En el grupo control se trazó el NLR intacto y en
los grupos experimentales el NLR axotomizado después de
cada intervalo de regeneración.
Resultados: El número de neuronas marcadas en el grupo
control fue de 143 ± 38; en los grupos experimentales el número de neuronas trazadas fue siempre menor que en el
grupo control (21-28 días: 14 ± 23 neuronas; 42-60 días:
46 ± 49; 90-120 días: 55 ± 57; 150-180 días: 61 ± 60). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre el
grupo control y los grupos experimentales en los parámetros morfométricos analizados para los somas neuronales.
Conclusiones: Los resultados muestran que la axotomía
del NLR de la rata comporta una disminución en el número de neuronas trazadas del NA, pero no afecta al tamaño
ni su forma en los períodos estudiados.
Palabras clave: Laringe. Axotomía. Degeneración. BDA.
On the Number and Morphometrical Parameters
of the Nucleus Ambiguous Neurons After the Injury
and Regeneration of the Recurrent Laryngeal Nerve
in the Rat
Introduction and objectives: In laryngeal nerves injuries it
is essential to know the morpho-functional reorganization of
the neurons which supply the larynx in order to be successful with the clinical techniques of functional reinnervation
and/or orthotopic transplant. Due to the lack of this type of
studies in the literature, we investigated the organization of
laryngeal motoneurons in the nucleus ambiguous (NA) after
the axotomy and regeneration of the recurrent laryngeal nerve (RLN) in adult rats.
Material and methods: We used biotinylated dextran amines (BDA, 3 kDa), this fact is an innovation in the field, because this is a novel methodological approach to this model.
We studied a control group of 14 animals and four experimental groups of between 10 and 16 animals each one. In the
experimental groups we studied the regeneration of the axotomized nerve in four different intervals of time after the injury: 21-28 days, 42-60 days, 90-120 days, and 150-180 days.
In the control group we traced the RLN without injury while
in the experimental groups we traced the axotomized RLN
after each regeneration interval.
Results: The number of traced neurons in the control group
was 143 ± 38; in the experimental groups the number was always lower than in the control (21-28 days: 14 ± 23 neurons;
42-60 days: 46 ± 49; 90-120 days: 55 ± 57; 150-180 days:
61 ± 60). The morphologic parameters studied within the neuronal bodies in the experimental groups were no statistically
different when compared with those in the control group.
Conclusions: Results show that the tracing of the RLN after
its axotomy and regeneration, in the adult rat, involves a decrease in the number of traced neurons within the NA but no
changes in their size or shape during the analysed periods.
Key words: Larynx. Axotomy. Degeneration. BDA.
Correspondencia: Dr. F.J. Valderrama-Canales.
Departamento de Anatomía y Embiología Humana I.
Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid.
28040 Madrid. España.
Correo electrónico: [email protected]
Recibido el 29-11-2007.
Aceptado para su publicación el 14-2-2008.
INTRODUCCIÓN
En la actualidad el factor limitante para conseguir una
recuperación plenamente funcional de la laringe, tras un
trasplante, no es ni la revascularización ni el posible rechazo del órgano trasplantado, sino conseguir una reinervaActa Otorrinolaringol Esp. 2008;59(4):163-9
163
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Pascual-Font A et al. Regeneración de las fibras del núcleo ambiguo
ción funcional. En los procesos de reinervación, los axones
en regeneración toman una dirección incorrecta, de tal forma que inervan grupos musculares inadecuados, con el resultado del fenómeno conocido como sincinesia, que se traduce en una movilidad glótica inadecuada, que altera la
función laríngea1-3. Para alcanzar una reinervación funcional en los trasplantes y/o parálisis laríngeas se necesita,
por tanto, del conocimiento exhaustivo de los acontecimientos morfológicos que ocurren periférica y centralmente tras una lesión de la inervación laríngea. Mientras que se
han publicado diferentes estudios sobre las modificaciones
que suceden en la periferia, sólo en dos trabajos de la literatura consultada, realizados en el cobaya y la rata, se hace
mención a los cambios morfológicos y funcionales que se
producen en el núcleo ambiguo (NA) tras una lesión y posterior regeneración del nervio laríngeo recurrente (NLR).
En el cobaya se ha descrito la pérdida de la somatotopía en
el NA y un descenso acusado en el número de sus neuronas en los tiempos de recuperación iniciales, que se modera a medida que el tiempo de reinervación aumenta4. Por
otra parte, en la rata también se ha descrito que tras lesión
y regeneración del NLR la representación somatotópica de
los distintos músculos laríngeos en el NA se desorganiza, y
también se menciona un descenso en el número de neuronas2. La pérdida de la somatotopía descrita en ambos trabajos se ha interpretado como la base del fracaso en la reinervación selectiva. Sin embargo, en ninguno de los dos
trabajos mencionados se describen los cambios en forma
y/o tamaño de las neuronas axotomizadas.
Por lo tanto, debido a la escasez de trabajos que estudian
las modificaciones que ocurren en el NA tras una lesión y
posterior regeneración de los nervios laríngeos, nos planteamos el desarrollo de este trabajo. El objetivo del presente estudio, por tanto, es describir, en la rata, los cambios
que se producen en el número, la forma y el tamaño de las
neuronas trazadas en el NA tras la axotomía del NLR, a diferentes tiempos de reinervación, utilizando como trazador
neuronal las dextranaminas biotinadas (BDA, biotinylated
dextranamines), nunca antes empleadas en el modelo de lesión y regeneración del NLR, y que se han descrito como
marcadores neuronales de gran precisión y transporte rápido, que revelan la estructura dendrítica y axonal de las
neuronas marcadas5.
MATERIAL Y MÉTODO
Se utilizaron 72 ratas Sprague-Dawley, machos, de entre
300 y 450 g de peso (3-4 meses de edad), que se distribuyeron en dos series: una serie control de 14 animales a los que
se trazó el NLR izquierdo sin previa lesión, y una serie experimental de 58 animales divididos en 4 grupos de 10 a
16 animales cada uno, clasificados según el tiempo de supervivencia transcurrido desde que se axotomizó el NLR
izquierdo. Los cuatro intervalos de tiempo estaban comprendidos en 21-28, 42-60, 90-120 y 150-180 días.
En la serie control el NLR se lesionó caudalmente a la
glándula tiroides, junto al quinto anillo traqueal, para faci164 Acta Otorrinolaringol Esp. 2008;59(4):163-9
litar la captación del trazador5,6. A continuación se cubrió el
cabo proximal del nervio con el BDA 3 kDa (Molecular
Probes, Oregon, Estados Unidos) en forma de liofilizado
hidratado sobre la punta de un fino alfiler entomológico.
En la serie experimental se realizó la sección completa del
NLR izquierdo, en el plano del quinto o el sexto anillo traqueal, dejando los dos cabos en contacto. Una vez transcurridos los diferentes períodos de supervivencia postoperatorio de entre 21 y 180 días, se trazó el nervio axotomizado
con BDA 3 kDa distalmente a la zona lesionada, para garantizar que, de producirse una regeneración de las fibras
seccionadas, sean éstas las que resulten trazadas por el
BDA. Se dejó actuar el BDA durante 10 min para permitir
la captación por parte del nervio, y a continuación se limpió la zona con solución salina, se cerraron los planos
musculares y se suturó la piel6,7. Las dextranaminas biotinadas (BDA) se han descrito como marcadores neuronales
de gran precisión y transporte rápido, que revelan la estructura dendrítica y axonal de las neuronas marcadas5. En
determinadas condiciones son transportados tanto retrógrada como anterógradamente, lo que nos permite visualizar en el mismo animal las proyecciones central y periférica de las fibras trazadas7,8. Además, son moléculas muy
solubles en soluciones acuosas, lo que permite su fácil manejo y, en su forma lisinada, se unen a los tejidos fijados
con aldehídos de forma que su señal no se pierde con el
tiempo5.
Una vez transcurridos 7 días desde el trazado del nervio,
tanto en el grupo control como en el experimental, se realizó perfusión intracardíaca con paraformaldehído al 4 % en
PB a los animales de ambas series. El tronco del encéfalo
fue extraído, crioprotegido con sacarosa al 15 y el 30 %, y
cortado en el criostato en secciones transversales de 50 ␮m.
La presencia del BDA se detectó mediante la incubación
con avidina-biotina-peroxidasa (Vector, California, Estados
Unidos) y el posterior revelado con diaminobencidina intensificada con níquel (Vector, California, Estados Unidos).
En algunos casos se realizó un contraste mediante la tinción de Nissl.
En ambas series se analizó el número de neuronas marcadas, contadas en cada sección en el microscopio óptico a
20 aumentos, explorando con el micrométrico toda la profundidad de la sección. Los parámetros morfométricos de
los somas (área, perímetro, longitud, anchura, factor de forma y diámetro equivalente) se evaluaron mediante el software Visilog 5.49 y las diferencias entre los grupos de la serie control y la experimental se analizaron mediante la
prueba de la t de Student.
RESULTADOS
En todos los casos estudiados, control y experimentales,
las neuronas trazadas eran ipsolaterales al nervio trazado y
no se observaron diferencias entre los lados izquierdo y derecho.
Con respecto a la serie control, todas las neuronas trazadas se localizaron en el NA (fig. 1A), y la mayoría de las
neuronas presentaban morfología multipolar (fig. 1B). El
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Pascual-Font A et al. Regeneración de las fibras del núcleo ambiguo
▲d
▲
I
Figura 1. El trazado del nervio laríngeo
recurrente marca, ipsolateralmente,
neuronas en el núcleo ambiguo (NA). A:
sección de la médula oblongada en el
nivel del núcleo olivar inferior. Escala:
500 ␮m; d: dorsal; l: lateral. B: detalle de
las neuronas del núcleo ambiguo
recuadradas en A. Escala: 50 ␮m.
NA
A
B
Casos
con marcación
neuronal
Número
promedio
de neuronas
14/14
143 ± 380
21-28 días
5/10
14 ± 23
42-60 días
13/16
46 ± 49
90-120 días
11/16
55 ± 57
150-180 días
10/16
61 ± 60
Tiempo tras la lesión
Control
Para cada grupo se indica el número de casos en los que se ha obtenido
marcación en las neuronas del núcleo ambiguo, así como la media de
neuronas trazadas.
número de neuronas observadas fue entre 121 y 214, con
una media de 143 ± 38 (tabla I y fig. 2). El tamaño medio de
las neuronas fue de 43,2 ␮m de diámetro mayor y 25,5 ␮m
de diámetro menor, mientras que el área media de estas
neuronas era 574 ␮m2. El perímetro medio era 118 ␮m; el
factor de forma, 1,98 y el diámetro equivalente, 26,8 ␮m
(tabla II y fig. 3). En algunas secciones se identificaron fibras en el trayecto de formación del origen aparente del
nervio, así como neuronas aberrantes (fig. 4). En ningún
caso se hallaron neuronas o fibras marcadas en otros territorios del tronco del encéfalo o de la médula espinal.
Número de neuronas
Tabla I. Resultados obtenidos en el número de neuronas
tras el trazado con BDA del nervio laríngeo recurrente
en los grupos lesionados
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Control
21-28
días
42-60
días
90-120
días
150-180
días
Figura 2. Número medio de neuronas marcadas tras el trazado con
BDA del nervio laríngeo recurrente en el grupo control y en los diferentes
grupos experimentales en los que el nervio laríngeo recurrente que
había sido seccionado se trazó con BDA a distintos tiempos después
de la lesión. Se indica la desviación estándar de cada media.
En cuanto a la serie experimental, se han obtenido los siguientes datos en cada grupo:
– Grupo de 21-28 días de supervivencia tras la lesión.
Únicamente se han obtenido neuronas trazadas en 5 de los
10 animales del grupo, con una media de 14 ± 23 neuronas,
de marcación débil (tabla I y fig. 5).
– Grupo de 42-60 días de supervivencia tras la lesión.
Aparecen neuronas trazadas en el NA en 13 de los 16 animales de esta serie, con una media de 46 ± 50 neuronas trazadas en el NA (tabla I y fig. 6).
Tabla II. Morfometría del cuerpo de las neuronas marcadas tras el trazado con BDA del nervio laríngeo recurrente
Grupo
n
Área (␮m2) Perímetro (␮m) Diámetro mayor (␮m) Diámetro menor (␮m) Factor de forma Diámetro equivalente (␮m)
Control
243 574 ± 171
118 ± 25
43 ± 80
26 ± 6
1,9 ± 0,5
27 ± 4
21-28 días
145 485 ± 269
99 ± 36
38 ± 14
21 ± 8
1,8 ± 0,7
24 ± 8
42-60 días
341 534 ± 217
101 ± 30
37 ± 10
23 ± 7
1,6 ± 0,4
26 ± 6
90-120 días
203 214 ± 241
60 ± 34
22 ± 13
14 ± 7
1,8 ± 0,7
14 ± 8
Grupo control y diferentes grupos experimentales en que el nervio laríngeo recurrente que había sido seccionado se trazó con BDA a distintos tiempos después
de la lesión. Se indica la desviación estándar de cada media.
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B
Control 21-28
días
42-60
días
90-120 150-180
días
días
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Control 21-28
días
Control
21-28
días
42-60
días
90-120 150-180
días
días
50
40
30
20
10
Control 21-28
días
42-60 90-120 150-180
días
días
días
F
35
3
30
2,5
25
Factor de forma
40
35
30
25
20
15
10
5
0
60
0
42-60 90-120 150-180
días
días
días
E
Diámetro equivalente (µm)
Diámetro menor (µm)
D
C
Diámetro máximo (µm)
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Perímetro del soma (µm)
Área del soma (µm2)
A
20
15
10
5
0
Control 21-28
días
42-60
días
90-120 150-180
días
días
2
1,5
1
0,5
0
Control 21-28
días
42-60
días
90-120 150-180
días
días
Figura 3. Composición de los gráficos que muestran los resultados referentes a los parámetros morfométricos analizados en el grupo control
y en los diferentes grupos experimentales. En las abscisas aparece el parámetro analizado y en las ordenadas los diferentes grupos estudiados.
En todos los casos se indica la desviación estándar de cada media. Las diferencias no fueron significativas en ningún caso (t de Student, p > 0,05).
▲d
▲
I
Figura 4. Sección de la médula oblongada en el nivel del núcleo de
la oliva inferior, en la que se observan neuronas aberrantes
marcadas como consecuencia del trazado del nervio laríngeo
recurrente. Obsérvese su morfología fusiforme y la posición que
ocupan, desplazada del área que corresponde al núcleo ambiguo.
Escala: 500 ␮m; d: dorsal; l: lateral.
– Grupo de 90-120 días de supervivencia tras la lesión.
En 11 de los 16 animales se trazaron neuronas en el NA, la
media del número de neuronas era de 55 ± 58 (tabla I y
fig. 7).
– Grupo de 150-180 días de supervivencia tras la lesión.
Identificamos neuronas en el NA en 10 de los 16 animales,
con una media de 61 ± 60 neuronas trazadas (tabla I y
fig. 8).
166 Acta Otorrinolaringol Esp. 2008;59(4):163-9
Debido a que en grupos experimentales complejos,
como el del motivo de estudio, y a que, por las técnicas
quirúrgica y de trazado neuronal, se introducen variables
que dan como resultado que la muestra final resulte muy
heterogénea para poder realizar análisis estadísticos, no hemos realizado ninguna comparación estadística entre el
número de neuronas trazadas en el grupo control y el de
los grupos experimentales. No obstante, sí hemos realizado
una interpretación biológica de los datos, recogida en el
apartado de discusión del estudio.
Distinto es el caso de los parámetros morfométricos estudiados, tanto en el grupo control como en los grupos experimentales (área media del soma; factor de forma; perímetro; diámetros medios mayor, menor y equivalente), en
los que los resultados numéricos obtenidos son susceptibles de análisis estadístico. Los datos recogidos en el estudio se presentan detalladamente en la tabla II y en la figura 3. La interpretación de dichos datos queda recogida en el
capítulo de discusión.
DISCUSIÓN
Los resultados que hemos obtenido muestran que en los
trazados del NLR del grupo control se identificaron neuronas únicamente en el NA ipsolateral, en ningún caso en
otros territorios del tronco del encéfalo o de la médula espinal, tal y como ha sido descrito tanto en la rata10,11 como
en otras especies estudiadas12-15. Se contaron entre 121 y
214 neuronas trazadas por NA (media ± desviación estándar de 143 ± 38), dato coincidente con las cuantificaciones
de otros autores10. La morfología mayoritaria de las neuro-
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▲d
▲
I
Figura 5. Trazado del nervio laríngeo recurrente
entre los días 21 y 28 tras la lesión. A: visión
general de una sección de la médula oblongada
en el nivel del núcleo olivar inferior, con marcación
de las neuronas del núcleo ambiguo ipsolateral.
Escala: 200 ␮m; d: dorsal; l: lateral. B: detalle
de las neuronas marcadas. Escala: 50 ␮m.
A
B
▲d
▲
I
B
A
C
Figura 6. Trazado
del nervio laríngeo
recurrente, entre los
días 42 y 60 tras la
lesión. A: aspecto
general de una
sección de la
médula oblongada,
con marcación de
las neuronas del
núcleo ambiguo
ipsolateral. Escala:
200 ␮m; d: dorsal; l:
lateral. B, C: detalle
de las neuronas del
núcleo ambiguo
marcadas en A.
Escala: 50 ␮m.
▲d
▲
I
Figura 7. Trazado del nervio laríngeo recurrente,
entre 90 y 120 días tras la lesión. A: aspecto
general de una sección de la médula oblongada
en el nivel del núcleo olivar inferior, con marcación
de las neuronas del núcleo ambiguo ipsolateral.
Escala: 200 ␮m; d: dorsal; l: lateral. B: detalle de
las neuronas del núcleo ambiguo marcadas en A.
Escala: 50 ␮m.
A
B
Acta Otorrinolaringol Esp. 2008;59(4):163-9
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Pascual-Font A et al. Regeneración de las fibras del núcleo ambiguo
A
nas identificadas era multipolar, tal y como se ha descrito
en otros trabajos12,14,16. También se han identificado neuronas desplazadas del NA, denominadas “aberrantes” por
Ramón y Cajal17.
Al igual que en el grupo control, en los grupos de la serie experimental se identificaron neuronas únicamente en
el NA ipsolateral. Sin embargo, tras la axotomía del NLR,
el número medio de neuronas trazadas en el NA es menor
que el número medio de neuronas del grupo control, independientemente del tiempo de regeneración transcurrido
desde dicha axotomía. En el grupo de 21-28 días las neuronas marcadas con respecto al grupo control representan
únicamente un 10 %. No obstante, a partir del grupo de
42-60 días se produce una recuperación paulatina en el número de neuronas trazadas, hasta que en el grupo en que el
tiempo de regeneración era mayor, 150-180 días, se traza
hasta un 42 % de las neuronas con respecto al grupo control. Esta disminución en el número de neuronas trazadas
en los animales lesionados coincide con lo descrito previamente en la rata, en la que se observó, con respecto al grupo control, una pérdida del 50 % de neuronas del NA
105 días después de lesionar el NLR2. Además, el hecho observado en el presente estudio de que el aumento del tiempo de regeneración permitía la marcación de más neuronas
también se ha descrito en el cobaya, en el que, tras lesionar
el NLR el número de neuronas trazadas en el NA, aumentaba gradualmente de 20 neuronas en el día 14 tras la lesión a 90 neuronas en el día 1804.
Hemos de destacar que en nuestro estudio hemos identificado casos en los que el trazado del NLR distalmente a
la zona de la lesión no marcaba ningún cuerpo neuronal
en el NA; en todos los grupos experimentales ocurrió algún caso. Este hecho podría deberse a que las fibras nerviosas en regeneración no hayan podido atravesar distalmente la zona fibrosada de la lesión y continuar por el
envoltorio nervioso, imposibilitando así la captación del
trazador. También puede deberse a que las fibras hayan
regenerado pero hacia lugares aberrantes al haberse perdido la continuidad entre los cabos del nervio lesionado,
por lo que no habrían continuado por su camino funcional y, de nuevo, se imposibilitaría la captación del trazador. Finalmente, cabe la posibilidad de que, por motivos
desconocidos, no se hayan producido fenómenos de regeneración.
168 Acta Otorrinolaringol Esp. 2008;59(4):163-9
B
Figura 8. Trazado del nervio laríngeo
recurrente, entre 150 y 180 días
después de seccionado. A: aspecto
general de una sección de la médula
oblongada en el nivel del núcleo olivar
inferior, con marcación de las neuronas
del núcleo ambiguo ipsolateral.
Escala: 200 ␮m. B: detalle de
las neuronas del núcleo ambiguo
marcadas en A. Escala: 50 ␮m.
Los datos numéricos que hemos obtenido en relación
con las medidas morfométricas de las neuronas trazadas,
tanto en el grupo control como en los grupos experimentales, son susceptibles de un análisis estadístico, como relatamos en el apartado de material y método. En esta línea, los
resultados muestran que no hay diferencias significativas
entre los parámetros morfométricos analizados en las neuronas del grupo control y de los grupos experimentales.
Biológicamente, esto significa que se mantienen, por tanto,
el tamaño y la forma de las neuronas de los grupos experimentales con respecto a las neuronas de los controles. Sin
embargo, se ha descrito que en el cuerpo celular de la neurona axotomizada se produce un conjunto de fenómenos
denominados cromatólisis, proceso que conlleva un cambio en la forma y el tamaño del soma18. El hecho de que, en
los animales de los grupos experimentales, la forma y el tamaño de las neuronas del NA tras la sección del NLR se
mantengan invariables podría deberse a dos factores: bien
que no haya habido ninguna variación morfológica en las
neuronas axotomizadas o bien a que si se han producido
dichos cambios, éstos han acontecido antes de los 21 días
tras la lesión, momento en que iniciamos el análisis de estos parámetros neuronales, lo cual nos hubiera impedido
detectar y cuantificar los cambios. Esta última hipótesis estaría apoyada por lo descrito en la rata tras la sección del
nervio ciático, ya que el tamaño de las neuronas aumentaba en dos fases con dos picos máximos, uno de 3 a 4 días y
otro de 8 a 11 días tras la lesión19, en ambos casos, tiempos
inferiores al más temprano de nuestros análisis, 21 días.
En resumen, los resultados presentados revelan que el
trazado con BDA del NLR previamente lesionado, y con
diferentes intervalos de tiempo de regeneración, identifica
siempre un número de neuronas que no alcanza, en el mejor de los casos, el 50 % con respecto al grupo control. El
número es ascendente en función del tiempo de regeneración. Por otra parte, el tamaño y la forma de los cuerpos
neuronales de los grupos experimentales no son diferentes
de los de las neuronas control.
Como principal conclusión, nuestro estudio muestra que
tras la axotomía del NLR se producen fenómenos de regeneración en las fibras del nervio axotomizado, aunque parece evidente que, al menos con 6 meses de regeneración,
no todas las fibras seccionadas consiguen regenerar, puesto
que en ningún caso los experimentos consiguen trazar el
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mismo número de neuronas que en el grupo control. Los
citados fenómenos de regeneración son dependientes del
factor tiempo.
BIBLIOGRAFÍA
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