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Expresión diferencial
mediante
chips de ADN
Master de Genética y Evolución 2010/2011
Genómica Funcional
Michael Hackenberg ([email protected])
http://bioinfo2.ugr.es/genomicafuncional
Definición
La expresión diferencial es el cambio de los niveles de expresión de uno o mas genes
entre dos o varios condiciones
Algunos análisis típicos donde se emplean estas técnicas son:
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Para detectar posibles causas de una enfermedad (muestras sanas frente a muestras
patológicos o muestras que corresponden a distintas fases de la enfermedad)
Para caracterizar las diferencias entre diferentes tipos celulares (hígado frente a cerebro,
etc.)
En el desarrollo (no-diferenciado frente a diferenciado o los diferentes fases de
diferenciación)
Para medir los efectos de estímulos externos: medicamentos, luz, alimentación, sueño, etc
Células o organismos mutantes frente al wild-type
Métodos experimentales
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Chips de ADN
SAGE
Secuenciación masiva
Definición
Los chips de ADN permiten medir simultáneamente miles de propiedades genómicas como la
expresión génica o polimorfismos (tanto SNPs como CNV - variaciones en el número de copias).
Principio básico
El principio en que se basa la técnica de chip de ADN es la hibridación entre dos hebras
complementarios de ADN. Para ello se fijan miles de oligonucelotidos (sondas) en una superficie
sólida con el fin de que las moléculas de ARN de las muestran hibridan con ellas. Las muestras se
etiquetan con fluoróforos con lo que la intensidad de la luz emitida es proporcional a los niveles
de expresión.
Un canal frente a dos canales
Aparte de las muchas diferencies de fabricación que existen se puede distinguir dos tipos de
chips de ADN, los que usan un ‘canal’ y los que usan dos ‘canales’. Los de dos canales miden por
lo general la expresión relativa entre dos muestras (caso y control). Las dos muestras hibridan en
las mismas sondas (hibridación competitiva). Los chips de un canal miden la expresión absoluta
de una muestra.
Descripción:
Los ficheros CEL almacenan
las intensidades para los
diferentes ‘spots’ del chip de
ADN
Existen artefactos que pueden enmascarar la señal biológica o generar una señal falsa
(preparación de la muestra, el proceso de hibridación, sesgo de fluoritas, hibridación
cruzada, escáner).
estos artefactos tienen que ser analizados y corregidos (si es posible)
este paso se llama preprocesado y incluye la inspección de los datos crudos, la
filtración de muestras con mala calidad, y la normalización.
La normalización se puede dividir en 4 pasos
• Corrección del ruido de fondo (background correction)
• Correcciones dentro de la muestra – within array correction (afecta principalmente los
chips de dos canales)
• Calibrar las muestras entre si – between array scaling (tomar en cuenta diferencias en las
intensidades)
• Unir las diferentes sondas que corresponden al mismo gene o transcrito
Ruido de fondo en función de la concentración
Efecto del escáner sobre los valores de intensidad
Objetivo:
Medir “cuanto” mas se expresa un gen en una muestra comparado con otra
Ratio > 0: El gen i se expresa mas en A que en B
Ratio < 0: El gen i se expresa mas en B que en A
Ratio = 1: El gen i se expresa dos veces mas en A que en B
Ratio = -1: El gen i se expresa dos veces mas en B que en A
Normalmente A son los “casos” mientras que B son los “controles”
Para estimar si los niveles de expresión de un
gen son significativamente diferentes entre
dos condiciones, tenemos que analizar las
distribuciones de los niveles de expresión en
las dos condiciones
Definiciones:
Error de tipo I: Un error tipo I se da cuando se rechaza erróneamente la hipótesis
Ejemplo
Hipótesis nula: Los niveles de expresión son iguales en las dos condiciones.
Si hemos fijado el nivel de significación en 0.05 y la probabilidad (valor P) es menor que 0.05
rechazamos la hipótesis nula y deducimos que hay expresión diferencial.
Un valor P de 0.05 implica que rechazaremos un 5% de las hipótesis erróneamente
En un experimento de expresión génica, se pone a prueba simultáneamente miles de
hipótesis lo que lleva a la acumulación del error de tipo I
Para mantener el nivel de significación del experimento global, hay que corregir los valores p
Corrección de Bonferoni:
Multiplicar los valores P por el número de tests se controla el familywise error rate
(probabilidad de cometer errores de tipo I)
Corrección de Benjamini y Hochberg
Controla la proporción de hipótesis rechazadas erróneamente
indicado si se rechazan muchas hipótesis como es el caso de la expresión diferencial (pocos
genes cambian sus niveles de expresión)
Babelomics http://babelomics.bioinfo.cipf.es/ permite llevar a cabo diferentes tipos
de análisis relacionados con la expresión génica incluyendo la normalización de los
datos crudos
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Detectar genes que se expresan diferencialmente entre dos y mas condiciones
Analizar los resultados tanto de los chips de un canal como los de dos canales
Detectar genes que se expresan diferencialmente en función a una variable numérica (dosis
de un medicamento, etc.)
Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/):
Es un repositorio público de datos de microarray (chips de AND) y secuenciación. Además de la
posibilidad de buscar y navegar en el repositorio, existen varias herramientas para descargar los
datos y ver perfiles curados de la expresión génica.
Todas las plataformas que existen
en GEO
Buscar tanto por el nombre de la
‘plataforma’ (chips de ADN,
Illumina Genome Analyzer etc.),
el tipo de datos (mRNA,
microRNA, SNP) o cualquier
palabra clave (cancer)