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RED CYTED – PROYECTO CORNUCOPIA
GRUPO DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS.
CENTRO DE EDAFOLOGÍA Y BIOLOGÍA APLICADA DEL SEGURA.
CSIC. ESPAÑA
DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIDIABETICA (IN VITRO)
MEDIANTE LA INHIBICIÓN DE LA α-GLUCOSIDASA
1. DEFINICIÓN
La inhibición de la α-glucosidasa, una enzima clave que cataliza el paso final en el
proceso digestivo de los hidratos de carbono, puede retrasar la hidrólisis de
oligosacáridos y disacáridos en monosacáridos, disminuyendo la absorción de glucosa y
por consiguiente la reducción de la hiperglucemia postprandial.
1.1. OBJETIVO
Determinar la capacidad inhibidora de α-glucosidasa de una muestra
1.2. ALCANCE
Este procedimiento se podrá utilizar para determinar la capacidad inhibidora de αglucosidasa de cualquier extracto vegetal, así como también muestras de alimentos.
2. REACTIVOS
- Tampón: buffer fosfato potásico 10 mM, pH 7
-4-Nitrophenyl α-D-glucopyranosidasa 2 mM (3,01mg/5mL) en tampón (S=substrato)
- Muestra disuelta en tampón
2.1.1. Preparación de la enzima
- Disolver 1.35 mg en 1 mL de tampón
- Retirar 40 µL en un frasco de 10 mL y disolver con tampón (E= enzima).
2.1.2. Equipos, materiales y elementos de protección
 Espectrofotómetro
 Microplaca Costar UV
 Centrífuga
CEBAS - CSIC
Centro de Edafología y Biología Aplicada del Segura
P.O. BOX 164, Campus de Espinardo - 25, 30100 - MURCIA, SPAIN
Tel.: 968 39 6369.
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Balanza analítica
Balones volumétricos
Beakers
Pipetas, micropipetas y puntas
Agua destilada
2.1.3. Puntos de control
El análisis se debe realizar a temperatura ambiente y las muestras deben ser
protegidas de la luz y almacenadas a 4 ºC luego de su preparación.
3. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
3.1. PARA MUESTRAS SÓLIDAS
1. Preparar la muestra teniendo en cuenta que para muestras con alto
contenido de grasa se debe desengrasar.
2. Pesar una determinada cantidad, en un volumen de extractante
específico (pej: 100 mg/1 mL extractante MeOH/H20 70%)
3. Filtrar una alícuota de 5 mL a través de una membrana de nylon (0.45
um), almacenar a 4ºC y proteger de la luz.
3.2. PARA MUESTRAS LÍQUIDAS
1. Tomar 1,5 mL de muestra y centrifugar a 10000 rpm/5 min para remover
residuos sólidos
2. Filtrar una alícuota del sobrenadante a través de una membrana de
nylon (0.45 um), almacenar a 4ºC y proteger de la luz.
3. Hacer 10 diluciones seriadas: (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64…). Para
conocer la concentración de una muestra liquida, pesar un volumen
determinado.
4.
ENSAYO Y REPORTE DE RESULTADOS
En placas de 96 pocillos, adicionar:
- 100 µL de nitrophenyl α-D-glucopiranosidasa 2 mM (sustrato)
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- 20 µL de cada una de las diluciones seriadas de la muestra (por triplicado)
Para el inicio de la reacción adicionar:
- 100 µL de la solución de la enzima
- Leer a 405 nm
- Incubar durante 10 minutos y 37 ºC y leer la nitrofenol liberado a 405 nm.
4.1. CALCULOS
% de inhibición= (ΔAcontrol- ΔAsample)/ ΔAcontrol × 100%
5.
DOCUMENTOS DE REFERENCIA
 Chan, H. H., Sun, H. D., Reddy, M. V. B., & Wu, T. S. (2010). Potent α-glucosidase
inhibitors from the roots of Panax japonicus C. A. Meyer var. major.
Phytochemistry, 71, 1360-1364.
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