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Efectos de las microondas sobre la sobreviviencia de
algunas bacterias
patógenas en comidas populares costarricenses
Viviana Castro, Ma. Laura Arias* , Florencia Antillón y
Manuel Jimenéz
Resumen
Una de las vías más frecuentes de transmisión de algunas
enfermedades bacterianas es la ingesta de alimentos
contaminados. Actualmente, el uso del horno de microondas
para cocinar o calentar alimentos se ha popularizado bastante,
debido a la rapidez en el calentamiento que brinda. Sin
embargo, es importante evaluar ese efecto térmico en la
sobrevivencia de bacterias potencialmente patógenas, que
frecuentemente se involucran en brotes de origen alimentario.
Se evaluó el efecto de la irradiación con microondas sobre la
sobrevivencia de una cantidad conocida de Bacillus cereus,
Clostridium perfringens, Salmonella spp. Y Staphylococcus
aureus en tres platos de comida popular costarricense.
S. aureus resultó más sensible al tratamiento que Salmonella
spp.; las cepas esporuladas mostraron una tendencia a
aumentar su recuento luego del cocimiento como resultado de
una estimulación de la germinación.
Se determinó que el grado de destrucción que tienen las
microondas sobre los microorganismos depende no sólo del
microorganismo inoculado sino también de la composición de
alimento.
(Rev. Cost.Cienc. Méd. 1997, 18-2:19-27).
Palabras clave
microwave treatment, survival, Staphylococcus aureus,
Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Salmonella spp.
Introducción
En los últimos años, el desarrollo y la proliferación de los hornos
de microondas ha tenido un impacto significativo en la
preparación de los alimentos, especialmente por el ahorro de
tiempo y energía (1). En los establecimientos de comida rápida,
en las instituciones públicas y en los hogares, las microondas se
utilizan ya sea para calentar alimentos precocidos o congelados,
o bien para su cocción cuando se dispone de poco tiempo para
la preparación (2).
En el proceso de cocción es fundamental destruir los posibles
microorganismos contaminantes (3). Actualmente existe gran
variedad de opciones en cuanto al grado de sobrevivencia de
las bacterias presentes en los alimentos preparados en el horno
de microondas. Dessel et al. (4) establecieron que la cocción
por microondas es un poco más eficiente que los métodos
convencionales a la hora de destruir varias especies
bacterianas. Asimismo, Mudget et al. (5) aseguran que el
calentamiento con microondas es más rápido, penetrante y
eficiente que los métodos convencionales de cocción ya que las
primeras son capaces de esterilizar los productos alimenticios
homogéneos, sin recalentar las capas superficiales o internas.
En contraparte, Aleixo et al. (6) señalan que la cocción por
microondas es menos efectiva que las técnicas convencionales
para la destrucción de células vegetativas. En cuanto a esporas
bacterianas, establecen que estas pueden ser inactivas siempre
y cuando se les proporcione el tiempo y la temperatura
suficiente. En este mismo sentido, Rosemberg y Bogl (1982)
aseguran que únicamente los hornos de microondas de tipo
industrial son capaces de esterilizar los alimentos, y que en los
hornos domésticos se estimulan las esporas bacterianas y se
aumenta su geminación, lo que lleva a un incremento en el
recuento final de microorganismos (7).
Tres platos populares elaborados en la cocina costarricense son
el picadillo de vainica con carne molida, el arroz con leche y la
torta de huevo con papa. Existen varios estudios que establecen
que los alimentos actúan como posibles vehículos de bacterias
patógenas (2,8,9). Debido a que estos tres platos presentan la
posibilidad de transmitir enfermedades de origen bacteriano y
considerando que actualmente el horno de microondas brinda
una técnica popular para cocinar alimentos, se justifica evaluar
el efecto de microondas sobre la sobrevivencia de una cantidad
conocida de bacterias patógenas inoculadas en tres platos
populares costarricenses.
Materiales y métodos
Alimentos: Los ensayos se realizaron sobre muestras de
picadillo de vainica con carne molida, arroz con leche y torta de
huevo con papa, utilizando un horno de microondas tipo Amana
Radarange de 2450 Mhz de frecuencia de salida, 1800 watts de
poder y capacidad de 28 litros.
Todos los ingredientes fueron comprados en supermercados
ubicados en el área metropolitana y tratados en forma aséptica
hasta su preparación. También fueron controlados para la
búsqueda de los microorganismos patógenos por investigar,
tomando como base la metodología de Número Más Probable
(NMP) descrita para cada uno por Vanderzant y Splittstoesser
(10). Los tres platos fueron preparados, por triplicado, siguiendo
las indicaciones de Solórzano MH. (11).
Microorganismos evaluados: Todos los platos fueron
inoculados con suspenciones de células vegetativas o esporas,
según el microorganismo correspondiente y el proceso de
elaboración.
Las cepas de microorganismos empleadas fueron las
siguientes: Staphylococcus aureus aislada a partir de una
muestra de queso blanco, Bacillus cerus (forma esporulada)
aislada a partir de una muestra de cereal infantil, Clostridium
perfringens (forma vegatativa y esporulada) aislado a partir de
carne de res y Salmonella spp. aislada a partir de huevo de
gallina.
Preparación de los inóculos de células vegetativas: Para la
preparación del inóculo final, tanto de Salmonella spp. como de
S. aureus, se tomó una asada de la cepa y se suspendió en 100
ml de caldo tripticasa soya (CTS). Las suspensiones fueron
incubadas 24 horas a 37º C con el fin de obtener inóculos de
una densidad aproximada de 10 6- 10 8 células/ml, mediante la
comparación con el estándar de McFarland (12). Para la
preparación de las células vegetativas de C. perfringens, se
tomó una asada de la cepa que se puso a crecer en agar yema
de huevo en anaerobiosis (Gas Pouch, BBL) durante 24 horas
35º C . luego se tomaron varias asadas y se resuspendieron en
10 ml de CTS.
Preparación de los inóculos de esporas: El B. cereus se puso
a esporular en agar yema de huevo (FDA 1995) 24 horas a 30º
C y en aerobiosis, para posteriormente ser suspendido en CTS.
Se realizó una tinción de esporas con el fin de cuantificar la
cantidad de esporas presentes por campo, según la técnica de
Vanderzant y Splittstoesser, 1992 (10).
Las esporas de C. perfringens, fueron preparadas mediante la
transferencia de un cultivo de formas vegetativas de 24 horas a
un tubo con 10 ml de caldo tioglicolato dextrosa (TBD, Difco)
que se calentó en baño maría a 75º C durante 10 minutos y se
incubó a 35º C por 18 horas. Luego se tomó 0,75 ml del cultivo y
se inoculó en 15 ml de caldo Duncan-Strong, medio ideal para
esporular (13), y se inoculó a 35º C en una atmósfera
anaeróbica (Gas Pack) 24 horas. El cultivo se lavó tres veces
mediante centrifugación (15 min, 10000 x g), se suspendió en
agua desionizada y sonicó (50w) (Ultrasonic Homogenizer, Cole
Parmer Inst) por 20 minutos con el fin de eliminar las células
vegetativas. Se cuantificó el número de esporas mediante una
tinción de esporas.
Preparación de los platos Arroz con leche. (tiempo de
cocción: 24 minutos)
Se inoculó el arroz crudo (2 tazas) con 50 ml de la suspensión
de B. cereus y con 50 ml de la suspensión de S. aureus, con el
fin de obtener cargas aproximadas de 10 6 y 107 UFC/g de cada
bateria. Se homogeneizó con Stomacher y se tomaron 25 g de
la muestra con el fin de realizar un recuento inicial (1a.
muestra). se tomó la segunda muestra después de cocinar el
arroz 15 minutos en 100% de poder, la tercera después de 4
minutos en 100% de poder, la cuarta luego de agregar la
mezcla de leches con vainilla y cocinar por 5 minutos a 40% de
poder y la quinta luego de dejarlo reposar durante 5 minutos. En
todas las tomas de muestra se realizó una medición de la
temperatura intera.
Torta de huevo con papa. (tiempo de cocción: 23 minutos).
A la mezcla de 6 claras de huevo, 3 papas medianas precocidas
4 minutos y ajo se le agregó 50 ml de la suspensión de
Salmonella spp. y 50 ml de la suspensión de S. aureus. Luego
de homogeneizar con Stomacher, se tomó una muestra para
recuento final. Debido a que el tiempo de cocción de esta receta
es continuo y no fraccionado, se realizó una modificación con el
fin de poder obtener la curva de sobrevivencia. Se tomaron
muestras y se midió la temperatura a los 0,4,8,12 y 16 minutos.
Para cada tiempo se prepraró la receta desde el inicio con el fin
de no interrumpir el tratamiento térmico.
Picadillo de vainicas. (tiempo de cocción: 17 minutos).
La mezcla de carne (300 g), especias, vainicas (500 g) y tomate
fue inoculada con 50 ml de la suspensión de B. cereus, 50 ml de
la suspensión de esporas y 50 ml de formas vegetativas de C.
perfringens y 50 ml de la supensión de Salmonella spp. Luego
de homogeneizar con Stomacher, se tomaron 25 g con el fin de
realizar un recuento inicial (1a. muestra). Se tomó la segunda
muestra luego de cocinar la mezcla durante 6 minutos a 100%
de poder. La tercera se tomó 8 minutos después (100% de
poder) y la cuarta después de 3 minutos de reposo.
Cuantificación de los microorganismos: Cada muestra de
25g fue suspendida en 225 ml de agua peptonada estéril (0.1%)
y homogeneizada en Stomacher. Se prepararon diluciones
decimales hasta 107, las cuales fueron tratadas siguiendo la
técnica de Número Más Probable descrita por Vanderzant y
Splittstoesser para cuantificar cada microrganismo (10). El
siguiente es un resumen de cada técnica:
a. Bacillus cereus se pre-enriqueció cada dilución, por
triplicado, en caldo nutritivo incubado 48 horas a 37º C y
se
confirmó el crecimiento utilizando agar Manitol Yema
de Huevo Polimixina (MYP) incubado 24 horas a 30º C.
b. C. perfringens Se prenriqueció cada dilución, por triplicado,
en caldo de carne picada incubado a 46º C por 4-6 horas, y se
confirmó el crecimiento mediante el rayado de los tubos que
presentaron turbidez en agar Sulfito Polimixina Sulfadiazina
(SPS), incubado a 35º C por 24 horas en anaerobiosis.
c. Salmonella spp. Se preenriqueció cada dilución, por
triplicado, en caldo lactosado (24 horas, 37º C), luego de lo cual
fue enriquecido selectivamente en caldo selenito cistina y caldo
tetrationato incubados a 35º C por 24 horas. El plateo
confirmatorio fue realizado en agar Hecktoen y agar Xilosa
Lisina Desoxicolato (XLD) los cuales fueron incubados a 35º C
por 24 horas. Se consideró positiva la presencia de esta
bacteria cuando uno de los dos medios confirmatorios o ambos
presentaron colonias típicas.
d. S. Aureus Se preenriqueció cada dilución, por triplicado, en
tubos de CTS + 10% NaCl incubados 48 horas a 35º C. Se
confirmó el crecimiento utilizando agar Baird Parker incubado 48
horas a 35º C.
Evaluación de la sobrevivencia de las bacterias: Se evaluó
la sobrevivencia de las bacterias relacionándola con la
temperatura y tiempo de cocción de cada plato.
Resultados
1. Arroz con leche: En el cuadro 1 se muestra el NMP de S.
aureus presente en el arroz con leche antes y después de
aplicado el tratamiento térmico. La carga inicial promedio de S.
aureus presente en el arroz después de inoculado fue de 8x10 5
NMP/g, y esta carga disminuyó a < 3 NMP/g luego de cocinarlo
durante 19 minutos. En dicho período se alcanzó una
temperatura interna de aproximadamente 93 oC.
El NMP de B. cereus inoculado en el arroz con leche disminuye
logarítmicamente a medida que aumentan el tiempo y la
temperatura de cocción (Cuadro 1), no obstante, después de
transcurridos los últimos 4 minutos de cocción y los 5 minutos
de reposo, la población de microorganismo aumentó en 1 log.
2. Torta de huevo con papa: En el cuadro 2 se presentan los
resultados del efecto del tiempo y la temperatura de cocción del
horno de microondas sobre el NMP de Salmonella. y S. aureus.
Como se observa, aún cuando la torta de huevo se cocinó
durante 16 minutos y se alcanzó una temperatura interna de 93º
C, el tratamiento no fue suficiente para eliminar todas las células
de Salmonella presentes. Por otro lado, el comportamiento de
S. aureus es similar al que presentó en el arroz con leche. La
carga inicial de esta bacteria se redujo de 7.4x10 6 a 10 NMP/g.
3. Picadillo de vainica con carne molida: En el cuadro 3 se
presentan los resultados obtenidos con la Salmonella inoculada
en el picadillo de vainica con carne molida al ser tratada en el
horno de microondas. Como se puede observar, después de
cocinar el picadillo durante 14 minutos a 100% de poder, se
redujo la población de 106 NMP/g a 3.9x102 NMP/g, siguiendo
un comportamiento similar a la población de Salmonella
inoculada en la torta de huevo con papa.
Con respecto a las células vegetativas de C. perfringens, éstas
mostraron una reducción de 4 logaritmos después de su
tratamiento en el horno de microondas (cuadro 3). Por otro lado
las formas esporuladas de C. perfringens y . cereus mostraron
un comportamiento similar, dándose una disminución en el NMP
de éstas al aumentar el tiempo y temperatura de cocción, pero
luego el número se mantiene constante.
Discusión
El análisis de los resultados de arroz con leche indican que el
tratamiento térmico aplicado con microondas resulta adecuado
para la eliminación del S. aureus , lo cual concuerda con los
datos expuestos por Marriot (14), Price (15) y Frazier (2), los
cuales aseguran que es posible eliminar a esta bacteria de los
alimentos al aplicar calor a temperaturas superiores a los 66º C
durante 12 minutos como mínimo.
Con respecto a Bacillus cereus, los datos obtenidos concuerdan
con los resultados de Buono et al. (16) quienes también señalan
que las esporas de B. cereus no pueden ser destruídas en su
totalidad en un horno de microondas de tipo casero, por el
contrario, es capaz de estimular la germinación de las esporas
hasta llegar a un aumento en el recuento final (17).
El leve aumento de microorganismos que se presenta puede
deberse a que, al ocurrir un descenso en la temperatura
promedio (de 93º C a 65º C) y existir "puntos fríos" en el
alimento, se dé la germinación de esporas sobrevivientes.
También, es posible que por tratarse de un alimento compuesto
por varios ingredientes, es posible que existan gran cantidad de
fluctuaciones entre la temperaturas internas de alimento (18). El
posible efecto de contaminación a partir de los ingredientes
líquidos es despreciable en vista de que el análisis de la mezcla
control presentó un NMP de < 3/g.
Los resultados sobre la sobrevivencia de Salmonella spp. en la
torta de huevo con papa coinciden con lo que afirmar diversos
autores (18,19), quienes indican que la cocción de los alimentos
con microondas no constituye un método adecuado para
eliminar por completo cargas altas de Salmonella. Aunque el
número de células de Salmonella sobrevivientes detectado es
bajo, la FDA lo considera peligroso (13), ya que se estima que
una sola célula de Salmonella es potencialmente patógena para
el hombre si se almacena a temperatura ambiente por un
período de tiempo suficiente y se alcanzan poblaciones altas. La
sobrevivencia de Salmonella puede constituir un grave peligro
especialmente si el producto va dirigido un consumidor
susceptible.
Con respecto a S. aureus, la torta de huevo con papa puede
considerarse apta para consumo de acuerdo a la norma de
Pascual (20), quien establece que los alimentos preparados
cocinados deben tener < 100 UFC/g de S. aureus.
Según lo establecido teóricamente, se esperaba que el inóculo
inicial de Salmonella se redujera más rápido que el inóculo de
S. aureus, pues este último es más termorresistente (2). Sin
embargo, el comportamiento de ambas bacterias fue similar. El
hecho de que la población de S. aureus se redujera al mismo
tiempo que la población de Salmonella puede deberse a
"efectos atérmicos". Fung et al.(19) establecen que las
microondas afectan al S. aureus de tal forma que no se puede
explicar únicamente con los efectos térmicos producidos por el
horno de microondas.
Los hallazgos encontrados en el picadillo de carne inoculado
con Salmonella spp. concuerdan con las afirmaciones de
diversos autores (18,19), quienes consideran que el microondas
no es un método adecuado para eliminar totalmente niveles
elevados de esta bacteria. Con respecto a C. perfringens se
debe tener en cuenta que el NMP del producto cocinado (36/g)
sobrepasa el límite establecido por Pascual (20) para alimentos
preparados cocinados (30 células vegetativas de C.
perfringens/g). Por lo tanto, este método de cocción no es
adecuado para eliminar el riesgo de intoxicación por esta
bacteria, ya que según Bronswell et al. (21), este bacilo es
capaz de dividirse rápidamente, por lo que se pueden generar
grandes números en un período de tiempo corto.
El recuento final de esporas de C. perfringens no cumple con la
norma de Pascal para alimentos cocinados (máximo 30/g), y
más bien se espera una germinación y multiplicación de las
esporas sobrevivientes si el plato se deja a temperatura
ambiente (21).
Se concluye que la cocción con microondas aplicada al picadillo
de vainica con carne molida no es capaz de eliminar en su
totalidad las células vegetivas de C. perfringens y mucho menos
sus esporas, lo cual concuerda con los resultados de diversos
autores (22,23,24).
El comportamiento de las formas esporuladas de B. cereus
coincide con el descrito por Buono et al. quienes afirman que la
cocción de los alimentos con microondas no es capaz de
destruir las esporas de este bacilo en su totalidad, sino por lo
contrario, es capaz de estimular la germinación de las esporas
hasta llegar a un aumento en el recuento final (16).
Los resultados obtenidos permiten evidenciar que el efecto del
horno de microondas sobre las bacterias depende en gran
medida de la composición del alimento y del tipo de bacteria
tratada, y que las temperaturas internas alcanzadas en los
alimentos no garantizan la esterilización de los mismos.
CUADRO 1
EFECTO DEL TIEMPO Y DE LA TEMPERATURA DE
COCCION EN HORNO DE
MICROONDAS SOBRE EL NMP DE S. AUREUS Y ESPORAS
DE B. CEREUS
INOCULADOS EN EL ARROZ CON LECHE
Tiempo
(minutos)
Temperatura
NMP
o
( C)
S. aureus/g* B. cereus/g*
0
70
15
92
19
93
24
69
5 minutos reposo
71
* Promedio de tres repeticiones.
8 x 105
4 x 101
<3
<3
<3
4 x 104
23
<3
16
87
CUADRO 2
EFECTO DEL TIEMPO Y DE LA TEMPERATURA DE
COCCION EN HORNO DE
MICROONDAS SOBRE EL NMP DE S. AUREUS Y
SALMONELLA
INOCULADOS EN TORTA DE HUEVO CON PAPA
Tiempo
Temperatur
a
NMP
(minutos)
(oC)
S.
Salmonella/g
aureus/g*
*
0
4
25
68
7 x 106
2 x 104
5 x 106
7 x 103
8
84
12
87
16
92
4 minutos
91
reposo
* Promedio de tres repeticiones
8 x 103
6 x 101
2 x 101
7 x 102
1 x 102
2 x 101
1 x 101
4
CUADRO 3
EFECTO DEL TIEMPO Y DE LA TEMPERATURA DE
COCCION EN HORNO DE
MICROONDAS SOBRE EL NMP DE SALMONELLA C.,
PERFRINGENS
(FORMAS VEGETATIVAS Y ESPORAS) Y B. CEREUS
(ESPORAS)
INOCULADOS EN PICADILLO DE VAINICA
Tiempo
Temper
a-
NMP
C.
C.
(minuto tura Salmonella
B.
perfringens/ perfringens/
s)
(oC)
/g*
cereus/g*
g
g
(vegetativa)* (esporas)* (esporas)
0
25
1 x 106
8 x 105
6
65
4 x 105
4 x 105
3
14
87
2 x 10
3 x 102
3
72
4 x 102
4 x 101
minutos
reposo
* Promedio de tres repeticiones.
5 x 104
8 x 102
5 x 102
1 x 106
5 x 104
4 x 104
7 x 102
4 x 104
Abstract
One of the most frequent ways of transmission of some bacterial
diseases is throungh the ingestion of contaminated food.
Actually, the use of microwave ovens for cooking or heating food
is very popular, because of the fast heating provided. However,
it is important to evaluate the thermal effect on the survival of
bacteria, especially pathogens that are usually involved in foodborne outbreaks.
The effect of irradiation with microwaves on the survival of a
known quantity of Bacillus cereus, Clostridium perfringens,
Salmonella and Staphylococcus aureus was evaluated in three
popular Costa Rican dishes.
S. aureus was more sensitive to the treatment than Salmonella
spp.; the sporulated strains showed a tendency to increase its
count after cooking as a result of stimulated to germination.
Key words
Microwave treatment, survival, Staphylococcus aureus,
Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Salmonella spp.
Agradecimiento
Agradecemos a la Sra. Laura Villalobos su valiosa colaboración.
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Editorial Nacional de Salud y Seguridad Social
Apdo. 75-10100
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[email protected]