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II.-Capítulo 3
Herramientas básicas de ingeniería
genética
Gómez, Marisa; Echenique, Viviana
1 Introducción
Hasta aproximadamente 1970 el ADN era
la molécula de la célula que planteaba más
dificultades para su análisis bioquímico. Excesivamente larga y químicamente monótona,
la secuencia de nucleótidos del ADN sólo
podía ser estudiada por caminos indirectos,
tales como la determinación de la secuencia
de proteínas, del ARN o por el análisis
genético. Actualmente es posible separar regiones determinadas del ADN, obtener cantidades ilimitadas de esos fragmentos y determinar incluso la secuencia de esos
nucleótidos. Estos adelantos técnicos forman
parte de la tecnología del ADN recombinante, constituida por una mezcla de técnicas, algunas de las cuales son nuevas, pero
otras son adaptaciones de procesos naturales de la genética microbiana que han sido
estudiados y se conocen en profundidad.
2 Genética microbiana
En los procariotas existen mecanismos de
intercambio genético que permiten tanto la
transferencia de genes como la recombinación. La recombinación genética en procariotas ocurre porque se transfieren fragmentos
de ADN homólogos desde un cromosoma
donador a una célula receptora por uno de
estos tres procesos:
• Transformación: es un proceso por
cual el ADN libre del medio ambiente se incorpora en una célula receptora, trayendo
aparejado un cambio genético. Esto ocurre
sólo en algunas especies bacterianas. El movimiento de las moléculas de ADN a través
de la membrana y dentro del citoplasma de
la célula receptora es un proceso activo, que
requiere energía. Una célula que es capaz de
tomar una molécula de ADN y ser transformada se dice que es competente. Estas células secretan el factor de competencia, que es
una pequeña proteína que induce la síntesis
de 8 a 10 nuevas proteínas requeridas para
la transformación.
• Transducción: es un proceso por el cual
el ADN se transfiere de una célula a otra por
medio de un virus (que en el caso de
hospedadores bacterianos se denomina
fago). Puede ocurrir de dos maneras. En la
llamada transducción generalizada, una
fracción del ADN celular, que puede proceder de cualquier porción del genoma del
hospedador, pasa a formar parte del ADN
de la partícula vírica madura, reemplazando
al genoma del fago. En la transducción especializada, que ocurre sólo en algunos fagos
atemperados (aquellos que se integran en el
genoma como parte de su ciclo biológico), el
ADN de una región específica del cromosoma
del hospedador se integra directamente en
el genoma del fago, reemplazando algunos
de sus genes. En ambos casos, la partícula
vírica transductora es normalmente defectiva
como virus, ya que los genes víricos han sido
reemplazados. No todos los fagos pueden
transducir, ni todas las bacterias son
transducibles. Pero el fenómeno está lo suficientemente extendido para suponer que
desempeña un importante papel en las
transferencias genéticas que se producen en
la naturaleza.
• Conjugación: es un proceso de transferencia genética que requiere contacto de
célula a célula y que está mediado por un
plásmido. Consiste en la transferencia de
una copia de este plásmido al nuevo
hospedador. Sin embargo, otros elementos
genéticos resultan a veces movilizados durante la conjugación, como pueden ser otros
plásmidos o grandes bloques del cromosoma
del hospedador. La conjugación requiere una
célula donadora, que contiene un tipo particular de plásmido conjugativo, y una célula
receptora que carece de él. El contacto se
realiza a través del filamento o pelo sexual,
que permite el apareamiento específico y que
poseen sólo las células donadoras. Constituye un puente de conjugación a través del
cual pasa el ADN.
3 La clonación molecular
El desarrollo de la tecnología del ADN
recombinante y la clonación molecular han
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
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aportado sofisticados procedimientos que
permiten el aislamiento, purificación y
replicación de fragmentos específicos de
ADN. La finalidad de la clonación molecular
es aislar gran cantidad de genes específicos,
en forma pura. El procedimiento implica esencialmente dos etapas (Fig 1):
• Creación del ADN recombinante, que
consta de dos pasos:
1) Aislamiento del ADN de partida. Este
puede ser ADN genómico, ADN sintetizado
a partir del ARNm por transcripción reversa
(ADNc por «copia»), ADN amplificado por
la reacción en cadena de la polimerasa o sintetizado in vitro. Si se parte de ADN
genómico, generalmente se corta con
enzimas de restricción para obtener los fragmentos a clonar.
2) Unión de los fragmentos de ADN a un
vector de clonación utilizando una ligasa de
ADN. Un vector es una molécula de ADN que
vehiculizará al fragmento de interés. Los
vectores de clonación están diseñados de
forma tal que permiten la recombinación de
ADN foráneo en un sitio de restricción del
vector, sin afectar su replicación. A fin de seleccionar las células que incorporaron el vector,
el mismo lleva genes marcadores (por ejemplo un gen de resistencia a antibióticos).
• Introducción del ADN en una célula
hospedadora donde se replicará (amplificación): éste es realmente el verdadero evento de clonación, en el cual el ADN
recombinante es multiplicado para producir
varias copias idénticas. Involucra tres pasos:
1) Introducción y mantenimiento del
ADN recombinante en un organismo
hospedador. La molécula de ADN
recombinante se introduce en el organismo
hospedador, que puede ser procariota (bacterias) o eucariota (levaduras, células de mamíferos cultivadas). En el caso de la utilización de sistemas bacterianos, la introducción
se realiza por los procesos naturales de la
genética microbiana (transformación,
transducción, conjugación) o modificaciones
específicas de los mismos. También se utiliza
ampliamente la introducción del ADN mediante electroporación (descargas eléctricas
que crean poros en la membrana celular permitiendo la introducción del ADN).
2) Detección y purificación del clon deseado. La transferencia del ADN al hospedador
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a menudo genera un grupo de clones que
portan el vector. A fin de separar las células
que incorporaron el plásmido de las que no
lo hicieron se inoculan las células en un medio sólido (agarificado) que contiene el antibiótico al cual son resistentes las células que
poseen el vector. Sólo éstas sobrevivirán. Luego deberá buscarse específicamente aquellas
células que poseen el fragmento de interés.
Para ello puede utilizarse la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la hibridación molecular con una sonda específica.
3) Crecimiento y amplificación de las células hospedadoras que incorporaron el ADN
recombinante deseado para su aislamiento,
estudio, etcétera
ADN foráneo
a insertar
Ligación
Vector
plasmídico
Gen de resistencia
a antibiótico
Molécula de ADN
recombinante
Introducción en la
célula hospedadora
Selección de las células que contienen moléculas de ADN
recombinante por crecimiento en presencia de antibiótico
Figura 1: Pasos básicos en la clonación de un
fragmento de ADN.. En primer lugar el ADN a clonar y
el vector (plásmido) se cortan con la misma enzima de
restricción. Luego se ponen en contacto en presencia de
una ligasa para obtener una molécula de ADN
recombinante que se introduce en bacterias que
multiplicarán el plásmido junto con el fragmento de
interés (Modificado de Watson y col., 1992).
GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana
4 Herramientas y procedimientos
implicados.
• Endonucleasas de restricción
La habilidad para clonar cualquier gen o
secuencia de ADN de interés, depende, en
gran medida, de un tipo especial de enzimas
denominadas endonucleasas de restricción,
que son enzimas que cortan la molécula de
ADN en sitios específicos denominados sitios
de restricción. Estas enzimas reconocen secuencias específicas de 4 a 8 bases. Las diferentes endonucleasas de restricción son
producidas por distintos microorganismos,
para los cuales constituyen un mecanismo de
defensa contra el ataque de fagos. Cuando
el ADN de un fago ingresa en la célula
bacteriana, ésta lo degrada gracias a su batería de enzimas de restricción. Para proteger su propio ADN, las bacterias contienen
enzimas (metilasas) que se encargan de
modificar (metilar) ciertas bases en los sitios
que reconocen sus propias enzimas de restricción, de manera que ya no pueden reconocer dichos sitios de clivaje. La metilación
ocurre rápidamente después de la replicación,
catalizada por metilasas producidas por el
microorganismo.
Las enzimas de restricción se denominan
utilizando la primera letra del género y las
dos primeras letras de la especie que la produce, seguidas por un número que indica el
orden en que han sido identificadas las
enzimas correspondientes a la misma especie (Tabla 1). Una interesante característica
de las enzimas de restricción es que común-
mente reconocen secuencias de ADN que son
palíndromes (conjunto de caracteres que se
lee de igual manera de derecha a izquierda
que de izquierda a derecha). Además producen cortes en las dos cadenas. Muchas
enzimas de restricción están compuestas de
dos unidades idénticas, cada una de las cuales reconoce y corta una de las cadenas.
Como las secuencias reconocidas son relativamente cortas y frecuentemente palindrómicas, tales enzimas siempre hacen cortes en
ADN bicatenarios y tales cortes no están sujetos a corrección por enzimas de reparación.
Gracias a este mecanismo pueden destruir el
ADN extraño.
Ciertas enzimas como EcoRI producen
cortes escalonados que crean colas cortas de
cuatro bases de cadena simple en cada extremo del fragmento. Estas colas tienden a
asociarse a una cadena complementaria por
apareamiento de bases, por eso se denominan extremos cohesivos o pegajosos
(«sticky ends») (Fig. 2 A). Los extremos
cohesivos pueden unirse permanentemente
a secuencias complementarias de otro fragmento con colas producidas de la misma
manera (corte con la misma enzima), adicionando la enzima ADN ligasa, que cataliza la
formación de nuevos puentes fosfodiésteres
y las apropiadas condiciones de renaturalización. Esta cohesividad permite unir fragmentos de ADN no homólogos, una característica de relevancia para la creación del ADN
recombinante.
Existe otro tipo de enzimas de restricción,
como HindII, que cortan el ADN en el centro
Organismo
Designación
Secuencia
Nota
Bacillus subtilis
BsuRI
Genera extremos romos
Escherichia coli
EcoRI
Escherichia coli
EcoRII
Escherichia coli
EcoRV
Haemophilus
influenzae
HindII
5’..GG¯CC..3’
3’..CC­GG..5’
5’..G¯AATTC..3’
3’..CTTAA­G..5’
5’..¯CCAGG..3’
3’..­GGTCC..5’
5’..GAT¯ATC..3’
3’..CTA­TAG..5’
5’..GTPy¯PuAC..3’
3’..CAPu­PyTG..5’
Genera extremos
cohesivos
No palindrómica
Genera extremos romos
Pu: cualquier purina
Py: cualquier pirimidina
Tabla 1: Secuencias reconocidas y sitios de restricción de diferentes endonucleasas de restricción
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
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Figura 2: Mecanismo de corte del ADN por las enzimas de restricción.. a. Corte en secuencias palindrómicas
originando extremos cohesivos (ej. enzima EcoRI). b. Corte en el centro de la secuencia de reconocimiento de la
enzima, originando extremos romos (ej enzima Hind II). c. Incorporación de extremos cohesivos a un fragmento de
extremos romos por la transferasa terminal. (Modificado de Watson y col., 1992).
de la secuencia de reconocimiento (en el mismo punto, en ambas cadenas) produciendo
extremos romos («blunt-ends»), es decir que
las bases están apareadas en sus extremos,
y por lo tanto no presentan tendencia para
unirse con las bases complementarias (Fig. 2
B). Esto puede solucionarse adicionando extremos cohesivos por medio de la transferasa terminal, enzima que permite adicionar
colas de «poliA» o «poliT», que se comportarán como extremos cohesivos (Fig. 2 C).
• Vectores de clonación
Como se mencionara más arriba, un
vector es una molécula de ADN que
vehiculizará al fragmento de interés y permitirá su amplificación. Los vectores de
clonación más utilizados derivan del genoma
viral o de plásmidos bacterianos. Un vector
de clonación tiene tres componentes esenciales:
1. Un origen de replicación
2. Un gen marcador fácilmente seleccionable
3. Al menos un sitio único de restricción
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Los vectores de clonación de última generación son muy prácticos y sencillos de
manejar. Incluyen un sitio múltiple de
clonación o sitio de restricción múltiple
(«polylinker»), que es un segmento corto de
ADN con muchos sitios de restricción diferentes, cada uno de ellos único para el vector
(Fig. 3 A). Este sitio suele formar parte del
marco abierto de lectura («ORF») de un gen
responsable de alguna característica
fenotípica, por lo que resulta sencillo confirmar si tras la restricción y ligado se ha insertado efectivamente un fragmento de ADN,
ya que la inclusión de este interrumpe la secuencia del vector, lo cual redunda en la pérdida de funcionalidad del gen mediante
inactivación por inserción.
Los vectores pueden clasificarse de la siguiente manera:
A) Plásmidos: son moléculas de ADN circular, de doble cadena, extracromosómicas,
presentes en las bacterias, que poseen propiedades muy útiles como vectores de clonación:
GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana
Figura 3: Vectores de clonación. a. Sitio de restricción
múltiple: corto segmento de ADN con varios sitios de
restricción, cada uno de ellos único para el vector. b.
Plásmido pBR322 con los sitios de restricción de BamHI
y PstI dentro de los genes marcadores (genes de
resistencia a la tetraciclina y ampicilina, respectivamente).
(Modificado de Watson y col., 1992).
1. Pequeño tamaño que permite mayor
facilidad de aislamiento y manipulación.
2. Son circulares, lo que hace que el ADN
sea más estable durante su aislamiento químico.
3. Su replicación transcurre independientemente del ADN nuclear en la célula bacteriana.
4. Existen múltiples copias en la célula,
dependiendo del plásmido y de la especie
hospedadora, puede haber de varias a numerosas copias (por ej. 1.000 a 3.000 copias
de pBR322 por célula).
5. La presencia de genes de resistencia
a los antibióticos que actúan como marcadores seleccionables facilita la detección y
selección de los clones que los contienen.
6. El tamaño de los insertos que se pueden clonar puede ser considerable; sin embargo, si son mayores de 10 kb, el plásmido
se hace generalmente inestable.
Aunque en el ambiente natural los
plásmidos conjugativos generalmente se
transfieren por contacto célula a célula, los
plásmidos vectores de clonación generalmente han sido modificados a fin de evitar su
transferencia por conjugación y así lograr su
contención biológica. Sin embargo, en el
laboratorio es posible realizar la transferencia a la célula hospedadora por transformación, utilizando choque de calor, o por
electroporación.
Los primeros plásmidos utilizados como
vectores de clonación existían en forma natural. El plásmido pBR322 constituye una generación posterior de vectores construidos in
vitro (Fig 3 B). En este plásmido, el sitio de
restricción de BamHI está dentro del gen de
resistencia a la tetraciclina, y el sitio para PstI
está dentro del gen de resistencia a la
ampicilina. Si se inserta un trozo de un ADN
en uno de estos sitios, la resistencia al antibiótico conferida por el gen que contiene
este sitio se pierde (inactivación por inserción).
Por tanto, cuando pBR322 es digerido con
BamHI y se liga a un ADN, y luego se aíslan
los clones transformados, aquellos
transformantes que posean resistencia a la
tetraciclina y ampicilina no portan ningún
ADN clonado. Aquellas células que continúan
siendo resistentes a la ampicilina pero sensibles a la tetraciclina, contienen el plásmido
con el fragmento del ADN clonado. Como la
resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina
pueden determinarse independientemente
en placas con agar, resulta fácil aislar bacterias que contengan los clones deseados y eliminar las células que no los contengan.
B) Bacteriófagos o fagos:
Fago λ: tiene un mapa genético complejo. Se conoce la secuencia completa de sus
48.502 pares de nucleótidos y la función de
sus genes. El tercio central del cromosoma
contiene genes que son requeridos para la
lisogenia (estado integrado) pero no para el
ciclo lítico (ciclo productivo de nuevas partículas virales). Esa parte central (de aproximadamente 15 kb) del cromosoma puede ser
cortada con enzimas de restricción y substituida por un fragmento de ADN foráneo
(Fig. 4 A). La molécula resultante de ADN
recombinante puede ser empaquetada en
las cabezas del fago in vitro. Las partículas
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del fago pueden inyectar el ADN
recombinante en E. coli, que se replica produciendo colonias bacterianas que contienen
los fragmentos a clonar.
El fago l silvestre no es indicado como
vector de clonación porque tiene demasiados sitios para enzimas de restricción. Para
obviar esta dificultad se han construído fagos
l modificados (Charon), en los cuales los sitios de restricción no deseados han sido alterados de manera tal que la correspondiente enzima no los reconozca.
Es un vector de clonación particularmente útil porque:
1. Se conoce bien su estructura, secuencia y funcionamiento
2. Puede insertar mayor cantidad de ADN
que la mayoría de los plásmidos (entre 10 y
20 kb)
3. El ADN puede ser eficientemente empaquetado in vitro dentro de las partículas
del fago
4. Las partículas del fago son mucho más
eficientes en la infección de las células
hospedadoras (transfección) que la transformación.
Fago M13: es un fago filamentoso que
contiene ADN monocatenario y se replica sin
matar a su hospedador. Para poder utilizarlo
como vector de clonación es necesario disponer de una forma bicatenaria, ya que las
enzimas de restricción sólo trabajan sobre
ADN de doble cadena. El ADN bicatenario
de M13 puede obtenerse de células infectadas, donde se encuentra en forma
replicativa bicatenaria. La mayor parte del
genoma del tipo silvestre contiene información genética esencial para la replicación. Existe, sin embargo, una pequeña región llamada secuencia intergénica que puede ser utilizada como sitio de clonación. Es posible
clonar ADN de longitudes variables (hasta
5kb), sin afectar la viabilidad del fago. El ADN
monocatenario de M13 y de sus vectores
derivados ha sido extremadamente útil para
secuenciar ADN.
Tanto en el fago l como en M13 se ha
insertado un fragmento funcional de lacZ, el
gen de E. coli que codifica para la enzima βgalactosidasa (β-gal), que es utilizado como
gen marcador. En el inicio de este gen se ha
insertado un sitio múltiple de clonación. Por
lo tanto, los fragmentos de ADN clonados
en el «polylinker» interrumpen el gen lacZ y
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anulan la actividad de la β-galactosidasa.
Cuando esta enzima hidroliza un compuesto químico denominado X-gal, se libera un
colorante azul relativamente insoluble. El Xgal se incorpora al medio de cultivo en placa
de Petri, donde crecerán las células
hospedadoras del ADN recombinante. Si el
ADN clonado se insertó en el polylinker y
desactivó la β-galactosidasa, no se producirá pigmento azul y las células formarán colonias que se verán blancas en la placa de
Petri. En caso contrario, las colonias de las
células hospedadoras se verán de color azul.
a
C
Figura 4: Vectores de clonación.. a. Utilización del
fagoλ. 1. Dos sitios de restricción EcoRI en el ADN del
fagoλ. 2. Región central no esencial del fago 3. El ADN
foráneo puede reemplazar al segmento no esencial del
ADN del fago 4. Unión con ADN ligasa, se eligen las
condiciones para que el ADN híbrido tenga la longitud
adecuada para ser empaquetada dentro de la partícula
del fago y 5. Empaquetamiento del ADN híbrido
añadiendo extractos celulares que contengan las
partículas de la cabeza y cola para permitir la formación
de partículas viables del fago. b. Cromosoma artificial
de levadura (YAC). ARS: origen de replicación, CEN:
centrómero, TEL: telómeros, URA. gen marcador
seleccionable par el desarrollo en medio con uracilo.
Modificado de Watson et al., 1992). c. Cromosomas
artificiales de bacterias (BAC) (Modificado de Griffith et
al., 2000).
GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana
C) Cósmidos:
Son vectores híbridos, que combinan las
características ventajosas de los plásmidos
bacterianos y del fago λ. Cos proviene de
sitio cohesivo («cohesive site»), en referencia a las secuencias terminales de simple cadena de 12 bases complementarias en el
cromosoma de λ maduro. El sitio cos es reconocido por el sistema de empaquetamiento de ADN de λ, que hace cortes escalonados que originan los extremos
cohesivos complementarios en el cromosoma
maduro del fago. Poseen la habilidad del
plásmido para replicarse autónomamente en
las células de E. coli y la capacidad de
empaquetamiento in vitro del cromosoma
de λ. Contienen el origen de replicación y los
genes de resistencia a los antibióticos de su
plásmido parental. La principal ventaja de los
cósmidos como vectores es su habilidad para
insertar fragmentos de ADN de 35 a 45 kb.
D) Fásmidos (fagémidos):
Son vectores que combinan las características de un fago filamentoso (M13) y un
plásmido (pBR323) y contienen tanto el origen de replicación del fago como del
plásmido. Normalmente la replicación depende del plásmido, pero cuando una célula que
contiene un fásmido se infecta con un fago
de tipo silvestre, el origen del fago es responsable de la replicación y se generan copias
monocatenarias. Este ADN monocatenario
es empaquetado en viriones y puede aislarse fácilmente y ser utilizado para secuenciar.
Habitualmente, los fásmidos pueden transportar de forma estable un fragmento de
ADN clonado mayor que un vector típico
derivado de M13.
E) Cromosomas artificiales:
Estos vectores se desarrollaron con el
objetivo de clonar grandes segmentos de
cromosomas eucarióticos. En la preparación
de mapas físicos de genomas se utilizan
vectores como los cósmidos, los YAC
(cromosomas artificiales de levaduras), los
BAC (cromosomas artificiales de bacterias) y
los PAC (cromosomas artificiales basados en
el fago P1).
Los YAC son minicromosomas de levadura creados por ingeniería genética que
pueden contener insertos de ADN de 200 a
500 kb (Fig. 4 B) y contienen un origen de
replicación y un centrómero de levadura, dos
telómeros en los extremos del cromosoma,
un marcador seleccionable y un sitio múltiple de clonación.
Los BAC se basan en el plásmido F de
7kb de E. coli y pueden llevar insertos de 300
kb, aunque el promedio es de 100 kb (Fig. 4
C). Los PAC son equivalentes. Aunque los BAC
y los PAC aceptan fragmentos menores que
los YAC tienen algunas ventajas:
Figura 5: Método de hibridación de Southern. a. Inclusión del ADN en el gel de agarosa. b. las moléculas de ADN
migran a través del gel dependiendo de su tamaño y forma, c. transferencia de las moléculas de ADN del gel a una
membrana por capilaridad (S. Solución tampón, M: mecha, A gel de agarosa, N: membrana de nitrocelulosa, P:
papel de filtro y peso), d. incorporación de la sonda e hibridación con las moléculas de ADN, f: detección por
autorradiografía, contacto de la membrana con el filme autorradiográfico, g: revelado de la autorradiografía,
observación de las bandas hibridadas. (Modificado de Micklos et al., 1990).
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
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1. Son menos complejos y por lo tanto
más fáciles de construir. Pueden amplificarse
en bacterias y manipularse con la tecnología
básica de los plásmidos bacterianos.
2. Contienen menor cantidad de insertos
híbridos (insertos compuestos por dos o más
fragmentos no contiguos en el genoma) que
los YAC. Estos insertos híbridos pueden entorpecer los intentos de ordenar los clones
Por estos motivos los BAC han reemplazado a los YAC como vectores en la construcción de mapas físicos de cromosomas enteros.
Estos vectores simplifican mucho el proceso de secuenciación, ya que aún organismos simples como el nemátodo
Caenorhabditis elegans poseen enormes
cantidades de ADN (100 Mb). En este caso
se necesitarían 2.500 cósmidos para contener el genoma completo (el inserto promedio de un cósmido es de 40 kb). Los YAC
pueden aceptar 1Mb, por lo cual el proceso
se simplifica.
5 Análisis molecular de ADN, ARN y
proteínas: hibridación.
La hibridación es la construcción artificial de un ácido nucleico bicatenario por
apareamiento (emparejamiento) de bases
complementarias de dos ácidos nucleicos
monocatenarios. Para que exista la formación
de híbridos estables debe haber un alto grado de complementaridad. Se define formalmente como sonda («probe») a un fragmento determinado de ARN o ADN marcado
química o radiactivamente, utilizado para localizar determinadas secuencias de ácidos
nucleicos mediante hibridación.
• Análisis de ADN por hibridaciones
Southern Blot
La electroforesis en gel es una poderosa herramienta para separar macromoléculas
de diferentes tamaños y cargas. Las moléculas de ADN tienen esencialmente una carga
constante por unidad de masa, por lo tanto se pueden separar en geles de agarosa o
acrilamida, casi completamente, sobre la base
de su tamaño o conformación. Los geles de
agarosa o acrilamida actúan como tamices
moleculares, retardando el pasaje de las
moléculas más grandes en relación con las
más pequeñas. Los geles de agarosa actúan
50
como mejores tamices para las moléculas más
grandes, mientras que los de acrilamida separan mejor las moléculas pequeñas. Los procedimientos utilizados, para separar ácidos
nucleicos y proteínas tienen el mismo principio, pero involucran algunas diferencias de
técnicas debidas a las características particulares de cada clase de moléculas.
En 1975 E. M. Southern, publicó un nuevo procedimiento que permitió a los investigadores ubicar los genes y otras secuencias
de ADN sobre fragmentos de restricción
separados por electroforesis en gel. La principal característica de esta técnica es la transferencia de las moléculas de ADN que han
sido separadas por electroforesis en gel a una
membrana de nylon o nitrocelulosa. Esta
transferencia se denomina Southern Blot, en
honor al científico que desarrolló la técnica
(Fig. 5). Para realizarla, el ADN es desnaturalizado (abierto en sus dos cadenas), sea antes o durante la transferencia, ubicando el
gel en una solución alcalina. Una vez completada la transferencia, el ADN es inmovilizado
sobre la membrana por exposición a elevada temperatura o a radiación UV. Una sonda de ADN conteniendo la secuencia de interés es entonces incubada con el ADN inmovilizado. La sonda sólo va a hibridar con
moléculas de ADN que contienen la secuencia de nucleótidos complementaria a su secuencia. El excedente de sonda no hibridada
se elimina mediante repetidos lavados de la
membrana. Las sondas pueden marcarse por
diferentes métodos: con elementos radioactivos, por métodos químicos que producen color o luminiscencia, etc. Luego de la
hibridación, la membrana se somete a diferentes procedimientos para poner en evidencia la sonda, de acuerdo al método con el
que haya sido marcada.
• Análisis de ARN por transferencia e
hibridación: Northern Blot
De manera similar al tratamiento realizado con las moléculas de ADN, las moléculas
de ARN también pueden ser separadas por
electroforesis en geles de agarosa, transferidas a membranas y analizadas. La transferencia de ARN se denomina Northern blot,
en reconocimiento al hecho de que el procedimiento es la imagen de espejo de la técnica Southern blot.
Ambos procedimientos son esencialmen-
GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana
Figura 6: Reacción en cadena de la polimerasa. a) Los tres pasos de un ciclo de PCR. En primer lugar se eleva la
temperatura de la reacción para separar las hebras de ADN (1) y a continuación la temperatura baja nuevamente, lo
que permite que los cebadores o primers se peguen a las regiones adecuadas de la hebra de ADN (2), y entonces
se ensamblan, actuando como límites de la región de la molécula que va a ser duplicada. Para terminar, se eleva la
temperatura nuevamente y la Taq polimerasa comienza a copiar (3), y sobre la plantilla crece una hebra nueva
complementaria (4). Después de varios ciclos se obtienen múltiples copias del fragmento en cuestión. b) La PCR es
una reacción donde el número de copias del gen de interés crece exponencialmente. c) Verificación de un producto
de PCR sobre un gel de agarosa. En primer calle se observa un producto de aproximadamente 1850 pares de bases
(bp) de longitud, en la calles 2 y 4 fragmentos de 800 bp, en la calle 3 falló la amplificación y en la calle 5 se han
formado tres bandas debido a que el primer ha encontrado complementariedad en más de un sitio en el genoma.
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
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te idénticos. Sin embargo, las moléculas de
ARN son muy sensibles a la degradación por
ARNasas. Por lo tanto, se debe tener mucha
precaución para evitar la contaminación de
los materiales con estas enzimas. Además, la
mayoría de las moléculas de ARN contienen
estructuras secundarias (producidas por
apareamiento complementario intracadenas), por lo tanto deben mantenerse desnaturalizadas durante la electroforesis para
poder separarlas sobre la base de su tamaño. La desnaturalización se provoca incorporando formaldehído u otro químico
desnaturalizante a la solución tampón («buffer») utilizada en la electroforesis. Después
de la transferencia a la membrana apropiada, las moléculas de ARN pueden hibridar con
sondas de ADN o ARN.
• Análisis de proteínas por transferencia e inmunodetección o Western Blot
La electroforesis en gel de poliacrilamida
es una herramienta muy importante para la
separación y caracterización de proteínas.
Debido a que muchas de las proteínas están
compuestas por dos o más subunidades, los
polipéptidos individuales son separados por
electroforesis en presencia del detergente
dodecil sulfato de sodio (SDS), que desnaturaliza las proteínas. Los polipéptidos separados por electroforesis también pueden ser
transferidos del gel a una membrana de nitrocelulosa y pueden ser detectados utilizando anticuerpos específicos. Esta transferencia de proteínas se denomina Western
blotting y se realiza utilizando una corriente
eléctrica para trasladar las proteínas del gel a
la superficie de la membrana. Después de la
transferencia, la proteína de interés es identificada colocando la membrana con las proteínas inmovilizadas en una solución que contiene un anticuerpo contra esa proteína. El
anticuerpo está conjugado (marcado) ya sea
con isótopos radioactivos, que permiten la
detección por autorradiografía, o con
enzimas que producen un producto visible
cuando se adiciona el sustrato correspondiente.
6 La reacción en cadena de la polimerasa
(PCR)
La PCR es una tecnología poderosa que
involucra la síntesis enzimática in vitro de
52
millones de copias de un segmento específico de ADN. La reacción se basa en la hibridación y extensión de un par de oligonucleótidos, sintetizados artificialmente, utilizados como iniciadores o cebadores (primers)
que delimitan una secuencia de ADN de doble cadena que se desea amplificar.
Un ciclo de PCR comprende tres etapas
(Fig. 6): desnaturalización de la doble cadena, unión de una secuencia de ADN (primer) a la hebra simple y replicación del
ADN a partir del primer. La doble cadena
de ADN se desnaturaliza por elevación de la
temperatura a 92-95º°C. Luego la temperatura se baja rápidamente a 35-60ºC, dependiendo del tamaño y secuencia del oligonucléotido utilizado, permitiendo la hibridación
ADN-ADN de cada primer con las secuencias
complementarias que flanquean la región
objetivo. Luego, se eleva la temperatura a
72º °C para que la Taq polimerasa (una ADN
polimerasa termoresistente aislada de
Thermus aquaticus, bacteria que vive en
fuentes termales) realice la replicación a partir de cada extremo 3´ de los primers. Este
ciclo es repetido por algunas decenas de veces y, como el producto de cada
polimerización sirve como molde para el siguiente, cada ciclo duplica la cantidad de
producto del anterior. El resultado de la reacción es un fragmento de ADN de doble
cadena, cuyos extremos corresponden a los
extremos 5´ de los primers y su tamaño a la
distancia entre los mismos. A pesar de que
se forman moléculas más largas a partir del
molde original en cada ciclo, se acumulan solo
a una tasa lineal y no contribuyen significativamente a la masa final de secuencia blanco.
Después de apenas 20 ciclos se logra más
de un millón de veces la cantidad inicial de
la secuencia de interés. Esta escala de amplificación permite, por lo tanto, iniciar el proceso con cantidades mínimas de ADN (del
orden de pico o nanogramos) y terminar la
reacción con grandes cantidades de una secuencia de interés. La versatilidad de esta
reacción es enorme y la combinación de la
PCR y la secuenciación constituye una poderosa herramienta para el análisis de genes.
La tecnología de PCR es de suma utilidad
para amplificar ADN a partir de fragmentos
clonados en distintos vectores. Solo se nece-
GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana
sita un par de iniciadores complementarios a
los sitios del vector que flanquean el fragmento para amplificar cualquier fragmento independientemente de su secuencia. Puede
amplificarse ADN de material embebido en
parafina por varios años, de material momificado, de restos fósiles, etc. Se utiliza para
detectar enfermedades genéticas, determinar el sexo en embriones humanos, para
clonar genes, para mutagénesis in vitro y para
mapeo y secuenciación de genomas, entre
otras aplicaciones.
• RT-PCR
La reacción de PCR en unión con la transcripción reversa (RT-PCR) puede ser utilizada para el estudio de ARNm casi a nivel de
una célula individual. Esta técnica puede utilizarse para determinar la presencia o ausencia de un transcripto, para estimar el nivel
de su expresión y para el clonado de ADNc
sin la necesidad de construir una genoteca.
Consiste en la síntesis de una cadena de ADN
a partir de ARNm por medio de la
transcriptasa reversa (enzima extraída de
virus tumorales cuyo material genético es
ARN), que utiliza ARN como molde para sintetizar una hebra de ADN. La cadena complementaria se sintetiza por PCR .
Subsecuentes ciclos de PCR nos permiten tener cantidades apropiadas del ADNc para
diversas manipulaciones genéticas.
• PCR cuantitativa
La clave en la PCR cuantitativa es la posibilidad de detectar el nivel de amplificación
de una secuencia de interés, con el objeto
de estimar la cantidad de esa secuencia en la
muestra original. Para llevar a cabo esta detección existen varios métodos pero casi todos basados en la utilización de otro fragmento de ADN (sonda) complementario a
una parte intermedia del ADN que se quiere
amplificar. Esta sonda lleva adherida una
molécula fluorescente y otra molécula que
inhibe esta fluorescencia («quencher»), de
tal forma que sólo cuando la sonda es desplazada de su sitio por acción de la ADN
polimerasa la molécula fluorescente se libera de la acción del «quencher» y emite fluorescencia al ser iluminada con un láser. La
fluorescencia detectada durante cada ciclo
de la PCR será proporcional a la cantidad
de ADN que se está amplificando. En gene-
ral para que sea válida esta técnica requiere
realizar en paralelo una curva patrón en las
mismas condiciones para conocer la cantidad
total de ADN que se está amplificando. Existen varios tipos de PCR cuantitativa. La más
moderna y sofisticada es la llamada PCR en
tiempo real.
• PCR en tiempo real
La PCR en tiempo real es una técnica que
ha ganado mucha importancia en los últimos
años debido a que ofrece la posibilidad de
cuantificar el número de copias de un
transgen incorporadas en un genoma.
Como se explicara más arriba, se basa en la
detección de un informador fluorescente
cuya señal aumenta en proporción directa
con la cantidad de producto de PCR en la
reacción. Se emplea un ciclador térmico que
tiene acoplado un sistema de detección capaz de captar y cuantificar la señal emitida
por el informador al final de cada ciclo. Se
pueden utilizar diferentes reactivos
fluorescentes como agentes intercalantes
(SYBR green®) que se unen a la doble cadena de ADN dando un incremento de la fluorescencia a medida que aumenta la cantidad
del producto de PCR. También se pueden
emplear sondas que tienen unidas un
fotocromo informador y un fotocromo
«quencher» (TaqMan ® ). Cuando ambos
fotocromos están unidos a la sonda, el informador no emite señal, pero cuando ésta
hibrida con la secuencia de interés, durante
la reacción de PCR, la enzima Taq polimerasa,
mediante su actividad de exonucleasa, cliva
al fotocromo informador, liberándolo del
resto de la sonda y permitiendo la emisión
de una señal fluorescente. Se monitorea esta
señal que se va acumulando en los sucesivos
ciclos de PCR. De este modo, es posible estimar la cantidad de la secuencia original
expresada en número de copias por
genoma o en unidad de masa.
En la Parte IX, Capítulo 4, se detalla más
este punto y se aplica esta técnica para la
detección de organismos genéticamente
modificados (OGM).
7 Genotecas
Una genoteca («gene library») es una
colección de fragmentos de ADN clonados
que representan en su conjunto el ADN to-
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
53
tal de un organismo de interés o bien el
ADNc, que representa el conjunto de genes
que se están expresando en un órgano o
tejido determinado o bajo una situación particular o momento de crecimiento o desarrollo. En el primer caso hablamos de una
genoteca genómica, donde se encuentran
todas las secuencias que se expresan y no se
expresan en el organismo y en el segundo
de una genoteca de ADNc, donde se encuentran sólo las secuencias expresadas.
Estas genotecas carecen de un catálogo
a través del cual se pueda saber cuál es el clon
que contiene una secuencia de interés. Por
ello es necesario realizar un relevamiento de
todas las colonias utilizando una sonda con
la secuencia de ácido nucleico que tenga que
sea complementaria a la secuencia o gen
buscados. Parte de esta secuencia puede ser
conocida o puede deducirse de la secuencia
de aminoácidos de la proteína purificada.
Alternativamente, puede buscarse la proteína producida por un gen clonado usando
anticuerpos contra la proteína o a través de
un análisis funcional.
Una de las principales dificultades en el
clonado de ADN genómico es que algunas
secuencias están representadas una sola vez
en el genoma y es difícil hallarlas. Para obviar
esta dificultad puede clonarse directamente
el ADNc, ya que el número de copias del
ARNm en el tejido es más elevado. El problema se plantea cuando no se sabe en qué circunstancias o en qué tejido se expresa un gen
en particular. Pero existen varias formas de
determinarlo. Actualmente es posible clonar
un ADNc a partir de mensajeros poco abundantes en la célula, con concentraciones de
1 a 2 moléculas por célula.
• Genotecas de ADNc
El primer paso en la construcción de una
genoteca de ADNc consiste en el aislamiento del ARN del cual es posible separar el
ARNm tomando ventaja de la característica
cola de poliadeninas que posee en su extremo 3´. Para ello se empaqueta en una columna de celulosa a la cual se unen
oligonucleótidos compuestos sólo por
desoxitimina –oligo(dT)–, a través de la cual
pasa el ARN quedando el mensajero unido a
la timina a través de la cola de poliA. Este es
luego eluido de la columna utilizando una
solución tampón adecuada.
54
Estas colas de poliA también son utilizadas en el próximo paso de clonado. La reacción consiste en poner en contacto el ARNm
aislado con oligo(dT) de 12 a 20
desoxitiminas que actúan como cebadores o
primers para la transcriptasa reversa. El producto de la reacción es un híbrido ARN-ADN.
El problema que tiene esta técnica es que si
el ADNc es muy largo, al comenzar en el extremo 3´, muchas veces no se llega al extremo 5´. Para salvar esta dificultad existe otra
técnica donde se utilizan primers al azar. Estos constan de 6 a 10 nucleótidos de longitud y están confeccionados de manera de
representar muchas secuencias diferentes,
por lo que la reacción comienza a partir de
muchos sitios diferentes, no sólo del extremo 3´. Por cualquiera de los dos métodos se
obtiene un híbrido ARN-ADN, a partir del cual
se obtienen moléculas de ADN de doble cadena que puede clonarse en el vector apropiado.
El primer método desarrollado para obtener la segunda cadena tomaba ventaja de
una «vuelta» o «giro» que da la hebra recién
sintetizada, como un efecto de cambio de
rumbo de la transcriptasa reversa al llegar al
final de la cadena de ARN. Este artefacto provee un cebador adecuado para la síntesis de
la segunda cadena de ADN y puede eliminarse una vez obtenida la segunda cadena, con
una nucleasa S1, perdiéndose parte de la
secuencia correspondiente al extremo 5’ del
mensajero.
Existe una segunda técnica, que presenta dos ventajas sobre la anterior. Una es que
genera moléculas de ADNc más largas y la
segunda es que contiene prácticamente toda
la secuencia correspondiente al extremo 5´.
Se basa en la utilización de la enzima RNasaH,
que reconoce moléculas híbridas ARN-ADN y
digiere la cadena de ARN dejando trozos
pequeños que permanecen unidos a la primera cadena del ADNc y sirven como primers
para la ADN polimerasa I, que usa el ADNc
original como molde para sintetizar la hebra
complementaria de ADN. Sólo queda un pequeño segmento de ARN en el extremo 5´.
La segunda cadena de ADN tiene algunos sectores no unidos que son sellados por una
ligasa de ADN.
Estas moléculas de ADNc de doble cadena están listas ahora para ser insertadas en
GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana
un vector, que puede ser un
plásmido o un derivado del
fago l. Para ello se utiliza la
transferasa terminal, que
adiciona colas de poliA o
poliT, o se agregan
adaptadores, que son sitios
artificiales de reconocimiento de alguna enzima de
restricción que se unen a los
extremos de la secuencia. Se
trata de oligonucleótidos artificiales (8-12 bp) que se
unen al fragmento utilizando una ligasa de ADN y son
cortados con la enzima de
restricción apropiada (Fig. 7
a). Ambos procedimientos
sirven para generar extremos
cohesivos a fin de unir el fragmento al vector, que posee
extremos cohesivos cortados
por la misma enzima.
Los plásmidos son introducidos en bacterias por
transformación (choque térmico o electrofusión), y se seleccionan por la característica del gen marcador del
plásmido. Si se trata de
fagos, los vectores son empaquetados in vitro para
formar partículas víricas, que
introducirán su ADN en el
hospedador apropiado por
infección de un césped de
bacterias crecido sobre la superficie de una placa de agar
(Fig. 7 a). Si bien los vectores
plasmídicos son más fáciles
de manipular, las genotecas
construidas en los fagos poFigura 7: Clonado de ADNc de doble cadena en un fago. a) Para ello se le deben adicionar hebras de cadena
simple complementarias a los sitios de restricción del ADN del fago. El ADN del fago se prepara cortando con una
enzima de restricción, en este caso EcoRI, y se purifican los dos brazos del fago. Mientras tanto se adicionan al ADNc
los adaptadores que llevan sitios EcoRI. Para ello se utiliza una ligasa. Previamente, el ADN se trata con una metilasa,
que metila los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción, a fin de protegerlo de la acción de la enzima. Los
adaptadores se cortan con la enizma de manera de generar extremos cohesivos que puedan acoplarse con el ADN
del fago, cortado con la misma enzima. Se genera así una serie de moléculas recombinantes dispuestas en tandem,
flanquedas por los sitios cos. Este ADN recombinante se empaqueta formando partículas infecciosas del fago, que
se utilizarán para infectar un césped de bacterias. Esto se visualizará como placas o calvas. Cada placa surge de una
molécula recombinante individual, que se propaga ahora como un fago. b) Una vez construída la genoteca puede
localizarse un gen en la misma por hibridación con una sonda marcada apropiadamente (Modificado de Watson et
al., 1992).
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
55
seen fragmentos de mayor tamaño.
Como resultado del cultivo en placa
(plaqueo) de la genoteca, se obtienen cientos de miles a un millón de placas de fagos
(zonas claras o de lisis resultado de la producción de particulas víricas) o, en el caso de
vectores plasmídicos, colonias bacterianas,
cada una conteniendo un fragmento
clonado, distribuidas sobre la placa de agar.
A fin de realizar la búsqueda de un gen particular («screening»), la genoteca es replicada
en membranas de nylon o nitrocelulosa, de
manera tal que el patrón de placas en la caja
original se vea exactamente reproducido en
la membrana de nylon o filtro (Fig. 7 B).
Búsqueda del gen clonado: Elección de
la sonda
La búsqueda se lleva a cabo por hibridación con una sonda de ácido nucleico, lo
cual requiere un conocimiento previo de la
secuencia de interés. En algunos casos, donde parte del gen ha sido clonado, este se
utiliza para buscar las partes faltantes. Si se
usa una sonda donde la homología es completa, el «screening» puede realizarse en condiciones de alta rigurosidad (es decir, con
lavados más fuertes, temperatura elevada y
concentración salina baja, que tienden a despegar lo que se ha unido inespecíficamente).
Si la sonda no es completamente homóloga
el «screening» deberá realizarse a menores
temperaturas y utilizando concentraciones
salinas más elevadas en los lavados. Si no se
tiene conocimiento previo de la secuencia
puede construirse una sonda a partir de la
secuencia de aminoácidos de la proteína.
Cuando se utiliza esta estrategia, el tamaño
mínimo de la sonda debe ser de 15 a 16
nucleótidos (que permite encontrar secuencias únicas en genotecas de ADNc
eucarióticos. Generalmente se utilizan sondas
de 17 a 20 nucleótidos (correspondientes a
6 aminoácidos contiguos). Otra consideración
a tener en cuenta cuando se construye la
sonda es que existe más de un codón o
triplete para definir la mayoría de los
aminoácidos (es lo que se conoce como la
«degeneración» del código genético), por lo
que un aminoácido puede estar especificado por hasta 6 codones diferentes. Por ello,
estas sondas oligonucleotídicas están constituidas por una mezcla de todas las combinaciones posibles. Una de ellas corresponde-
56
rá a la secuencia correcta del gen buscado. El
problema de esta estrategia es el elevado
número de falsos positivos que pueden dar
las secuencias adicionales. Una variante consiste en usar un menor número de
oligonucleótidos o uno solo pero de mayor
longitud (35-75 nucleótidos), eligiendo una
región de la proteína que contenga el menor número posible de codones degenerados, utilizando el conocimiento de los
codones más probables para la especie en
estudio.
Existen otras técnicas para localizar genes
en las genotecas de ADNc, como hibridación
diferencial, si se trata de genes expresados
en diferentes tejidos o la utilización de sondas de regiones conservadas en familias de
proteínas para encontrar genes relacionados
o bien la utilización de vectores de expresión.
• Genotecas Genómicas
Un genoteca genómica puede obtenerse
de cualquier tejido, ya que todas las células
de un organismo tienen la misma constitución genética. Como se mencionara previamente, se encuentran en ella no sólo secuencias expresadas y no expresadas sino también las correspondientes secuencias
regulatorias.
Pueden utilizarse fagos como vectores,
pero sucede que muchos de los genomas
eucariotas son muy grandes, por ejemplo el
de mamíferos contiene 3x109 pb de ADN. Si
el promedio típico de inserto es de 15.000
pb, se necesitarán unos 200.000 fagos para
contener el genoma completo. Para asegurar que todas las secuencias estén representadas al menos una vez, los cálculos estadísticos dicen que deberán analizarse aproximadamente de 1 a 2 millones de fagos.
Muchos genes eucarióticos tienen más de
1000 kb, por lo que deben ser clonados como
un conjunto de fragmentos parcialmente
superpuestos. Para esto pueden utilizarse
cósmidos, que pueden contener unas 45 kb.
Para hacer una genoteca con estos vectores
el ADN se corta con enzimas de restricción
de manera de dejar fragmentos de tamaño
apropiado. El cósmido se empaqueta in vitro
en fagos que se usan para infectar E. coli .
Una vez dentro de la célula el cósmido se replica y puede recuperarse de la célula como
un plásmido.
GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana
Cuando se trata de genomas muy grandes, como es el caso del humano o de varias
especies vegetales y animales la utilización de
cósmidos resulta ineficiente. Por ello en estos casos se utilizan los YAC y BAC.
A) Genotecas genómicas en cromosomas artificiales
La capacidad de clonar fragmentos de
más de 100 kb es crucial para la genómica
estructural, funcional y comparativa de organismos complejos. El primer sistema de
clonado de grandes fragmentos de ADN fue
informado en 1987 por Burke y colaboradores. Este sistema estaba basado en YAC, que
permitían clonar y mantener fragmentos de
más de 1000 kb en levaduras. Debido a esta
ventaja el sistema fue rápidamente adoptado para los proyectos de genómica. Sin embargo, tienen algunos problemas que limitan
su utilización, como el alto nivel de
quimerismo o insertos híbridos (artefacto
que resulta de la unión de fragmentos no
contiguos en el genoma original en un mismo clon), la inestabilidad de los insertos y la
dificultad de purificar los
insertos clonados.
Para minimizar estos
problemas se desarrollaron
sistemas alternativos que
utilizan bacterias en lugar
de levaduras: los BAC y los
PAC, que son vectores de
clonación de copia simple.
Cuando se los utiliza para
transformar plantas se los
llama BIBAC. BAC y PAC
pueden contener establemente fragmentos mayores de 300 kb en E. coli.
Para preparar una
genoteca genómica, el ADN
se corta con enzimas de
restricción o, para evitar la
presencia de fragmentos
demasiado largos o cortos,
se fragmenta al azar. Un
paso crítico en el proceso es
el aislamiento de moléculas
intactas de ADN de elevado peso molecular, esencialmente ADN cromosómico. Para ello las células se
embeben en bloques de
agarosa de baja temperatura de gelificación y se
tratan con en-zimas y otros
Figura 8: Búsqueda de imágenes en una genoteca genómica. Utilización de la reacción en cadena de la polimerasa
para buscar un gen específico en una genoteca de BACs. Las 180 placas de cultivo, de 96 pocillos, contienen un
genoma vegetal completo. Estas placas se replican, de a 4, en filtros o membranas. Todos los clones de un mismo
filtro son juntados y varios de estos conjuntos de clones son agrupados para preparar agrupaciones de conjuntos.
El ADN de estos conjuntos se aisla y se amplifica por PCR utilizando primers específicos para el gen de interés. Como
control positivo se utiliza un ADN vegetal, también amplificado por PCR. La reacción se analiza sobre un gel de
agarosa. Un resultado positivo indica la presencia del gen en el ADN genómico del vegetal y también en uno de los
clones. En este caso en el conjunto que contenía los filtros 1-3. Cuando se chequean los conjuntos individuales se
encuentra que el clon positivo pertenece al filtro 1. El producto de PCR se hibrida luego con este filtro y esto nos dará
la posición exacta en la placa de 96 pocillos donde se encuentra el gen de interés (Modificado de Watson et al.,
1992).
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
57
reactivos para separar el ADN de las proteínas celulares y del RNA. La función del bloque de agarosa es proteger a las grandes
moléculas, que, embebidas en esta matriz,
se someten a la digestión con enzimas de
restricción que realicen cortes poco frecuentes («rare cutters»). La preparación de
ADN de alta calidad en plantas es más complicada que la correspondiente para el caso
de animales debido a la presencia de la pared celular, que dificulta el embebido en
agarosa de bajo punto de gelificación. Para
obviar esta dificultad se aíslan los núcleos y
se trabaja con ellos directamente. Si se desea separar estos fragmentos por
electroforesis, los bloques de agarosa conteniendo el DNA digerido pueden ser directamente embebidos en la matriz del gel que
se correrá.
B) Separación de grandes trozos de
ADN: electroforesis de campo pulsátil
Las técnicas estándares de separación de
ADN en geles de agarosa no son adecuadas
para moléculas mayores de 10 kb. Esta limitación ha sido subsanada con una técnica llamada electroforesis de campo pulsátil, por
la cual el campo eléctrico que conduce a las
grandes moléculas de ADN a través del gel
cambia periódicamente de orientación. De
esta manera pueden separarse moléculas tan
grandes como los cromosomas de levaduras
(200 a 3000 kb) (ver VII.-1). La separación de
las moléculas de este tamaño depende de
su relativa facilidad o dificultad para reorientarse en respuesta a direcciones cambiantes
de un campo eléctrico. Esta técnica puede
utilizarse para hacer mapas físicos a gran escala.
C) Preparación de una genoteca de BAC
El procedimiento consiste en 4 pasos,
preparación del vector, aislamiento y digestión del ADN y selección de los fragmentos por tamaño, transformación de las bacterias y ensamblado de la genoteca
El vector debe estar bien purificado, digerido y defosforilado (cuando se corta con
una sola enzima, se eliminan los fosfatos terminales, para evitar la recircularización). La
digestión del ADN es crítica para obtener fragmentos adecuados para clonar. Los fragmentos son seleccionados por electroforesis de
campo pulsátil y se separan de la matriz de
agarosa por digestión de la misma con
58
agarasa o gelasa, o por elución del ADN
desde el gel. Esto permite construir
genotecas con fragmentos de tamaños similares, de aproximadamente 150 kb.
Estas genotecas de grandes insertos son
consideradas recursos de largo plazo para investigación genómica y deben ser mantenidas continuamente, especialmente cuando
son utilizadas para proyectos de secuenciado
y mapeo a gran escala. En general, cuando
se va a construir una genoteca debe elegirse
cuidadosamente el genotipo de la especie
utilizada como fuente de ADN, el tipo de inserto, etc. ya que la misma puede utilizarse
para variados propósitos. Si en lugar de una
genoteca de BAC se hace una de BIBAC, se
tiene la ventaja adicional de poder usar directamente los fragmentos para transformar
plantas
utilizando
Agrobacterium
tumefaciens
En la Fig. 8 se esquematiza la búsqueda
de un gen en una genoteca de BAC. Más
detalles acerca del ensamblado de los distintos fragmentos clonados pueden encontrarse en el capítulo correspondiente a genómica.
· Genotecas de cromosomas específicos o de segmentos de cromosomas
Cuando se busca un gen que se sabe está
ubicado en un cromosoma específico simplifica mucho el trabajo hacer una genoteca de
ese cromosoma solamente. Se trata de una
técnica que permite separar cromosomas
metafásicos teñidos con un colorante fluorescente (Hoechst 33258) (para regiones ricas en AT) y cromomicina A (para regiones
ricas en GC) y tratados de manera que el ADN
no se desnaturalice. Los cromosomas teñidos
fluorescerán cuando se expongan a luz UV
(de longitudes de onda de 361 y 363 nm)
(Hoechst 33258) o 458 nm (cromomicina A).
Las cantidades y proporciones de colorantes
varían para cada cromosoma y una computadora reconoce el patrón fluorescente típico de cada cromosoma. Algunos
cromosomas son muy similares, por lo que
no pueden ser separados. Se necesita un
millón de cromosomas para hacer una
genoteca. Equipos automáticos pueden hacer este trabajo en unas pocas horas.
También puede microdisectarse un
cromosoma, tomando un segmento del mismo que tenga la región de interés. En principio se utilizó esta técnica para cromosomas
GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana
grandes, fácilmente distinguibles por
microscopía de contraste de fase. Actualmente, la combinación con PCR posibilita la
aplicación de la técnica a cualquier
cromosoma. Estos son teñidos con Giemsatripsina y las bandas deseadas son cortadas
con agujas de vidrio ultrafinas y clonadas.
Primers posicionados en el vector permiten
amplificar secuencias desconocidas. El ADN
amplificado se clona en un vector apropiado
y la localización cromosó-mica de cada clon
se determina utilizando hibridación in situ
(ver III.5)
8 Secuenciación
Una vez que se ha obtenido el clon con
el fragmento de interés, el paso siguiente es
secuenciarlo. La determinación de la secuencia puede realizarse por el método químico
de Maxam y Gilbert o por el método
enzimático de Sanger. El primero consiste
en la utilización de un compuesto que destruye selectivamente una o dos de las 4
bases que constituyen el ADN. Se realizan
4 reacciones de síntesis de ADN, marcando
un extremo de las moléculas, dependiendo
de la base a destruir (G, A+G, T+C, C). De esta
forma, se generan fragmentos de distinto
tamaño en función de la distancia de la base
destruida al extremo marcado radiactivamente del fragmento a secuenciar. Los productos de las 4 reacciones se corren lado a
lado en un gel de poliacrilamida y la secuencia del fragmento se determina a través del
patrón de bandas, después de efectuada una
autorradiografía para revelarlas.
El método de Sanger, se basa en el mismo principio y consiste en preparar 2´,3´didesoxinucleótidos (ddNTP) de cada una
de las 4 bases. Estas moléculas pueden ser
incorporadas al ADN por el ADN polimerasa
de E.coli porque tienen un 5´trifosfato normal, pero no pueden formar un enlace
fosfodiéster con el nucleótido siguiente,
por lo que el crecimiento de la cadena se
detiene. En la mezcla de la reacción se incluye la cadena a secuenciar, una proporción
controlada de uno de los 4 ddNTP con su
desoxinucleótido normal y los otros 3 dNTP.
Cuando se agrega polimerasa la reacción
comienza a partir del primero hasta que se
introduce en la cadena un ddNTP, con lo
cual su crecimiento cesa. Con una proporción correcta ddNTP:dNTP, se generan una
serie de fragmentos de distinta longitud,
dependiendo de la distancia de la última base
incorporada al extremo marcado del ADN.
Estos fragmentos son separados en un gel
de poliacrilamida, donde, previa autorradiografía, se determina el patrón de bandas, que
refleja la secuencia del ADN. Al principio, la
posición de cada banda revelada en la película radiográfica se anotaba manualmente,
luego, los digitalizadores de imágenes posibilitaron la lectura directa de la película. Existen actualmente secuenciadores automáticos que realizan la electroforesis en gel y determinan automá-ticamente la secuencia utilizando un sistema de detección con láser.
Messing desarrolló una serie de vectores
de clonado basados en el fago filamentoso
M13, muy útiles para el secuenciado
enzimático. La ventaja es que sólo una de
las cadenas del vector es empaquetada en
las cabezas del fago (ver Vectores de
clonación). Este ADN de simple cadena es
ideal para utilizar con el método de Sanger.
Clonando el inserto en M13, en las dos
orientaciones posibles, se obtiene una o la
otra hebra del ADN a secuenciar. Para ello se
utiliza un primer que se posiciona en un lugar adyacente a la región de policlonado de
M13, que se llama «primer universal», ya que
se puede utilizar para secuenciar cualquier
clon recombinante.
Actualmente se utilizan fásmidos (ver
Vectores de clonación). La adición de un
«fago ayudante» («helper phage») a las células que lo contienen, hace que el ADN del
mismo, de simple cadena, sea replicado,
empaquetado y extraído de la célula. Al ser
de menor tamaño (aprox. 3000 bp) que M13
permite la inserción de fragmentos de ADN
más largos.
Los proyectos de secuenciación
genómica han requerido métodos de
secuenciado más veloces y económicos. Para
ello se ha desarrollado una técnica llamada
Multiplex, que permite manejar mayor cantidad de muestras en menor tiempo. Se utilizan 20 vectores plasmídicos que permiten
construir 20 genotecas diferentes a partir del
mismo ADN. Cada vector lleva dos secuencias únicas que flanquean al sitio de
clonado, que pueden ser usadas como eti-
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
59
quetas («tags») para el ADN clonado y estarán presentes sobre cada fragmento a ser
secuenciado. Se toma un clon de cada una
de las genotecas plaqueadas (20 colonias) y
se mezclan. Se hace crecer el cultivo, se aísla
el ADN y se secuencian los plásmidos utilizando el método Maxam y Gilbert. Los productos de 12 conjuntos de reacciones de
secuenciación se corren en un gel y se transfieren a una membrana de nylon. El filtro se
hibrida secuencialmente (es decir, se despega una sonda para luego hibridar con las siguiente y así sucesivamente), utilizando como
sonda la etiqueta de cada uno de los 20
vectores. En cada caso se van leyendo las
secuencias correspondientes a cada uno de
los distintos vectores. De esta manera, una
sola reacción produce datos de 20 clones a
la vez.
Actualmente existen equipos robotizados que pueden llevar a cabo dos de las reacciones más limitantes en el proceso de
secuenciado: la detección de las bandas de
ADN y la traducción de un patrón de bandas en uno de secuencia. Estos equipos utilizan nucleótidos marcados con fluorocromos.
Se utilizan 4 colorantes diferentes, que al ser
exitados por láser emiten luz de diferente
longitud de onda. Los colorantes pueden
utilizarse para marcar el primer universal de
secuenciación de M13 o cada uno de los 4
terminadores de cadena didesoxi. En este
caso, cada mezcla de reacción con un
terminador diferente se marca con un colorante diferente. Cuando la reacción es completada, los productos de las 4 reacciones se
mezclan y se corren en una sola calle de un
gel, en un secuenciador automático. A medida que los fragmentos pasan a través del lá-
60
ser, sus marcas fluorescentes se excitan y
emiten luz que se detecta mediante un
fotomultiplicador. Después de ser procesada
por una computadora, la secuencia es mostrada como una serie de picos o cromatograma, donde cada uno de los 4 colores representa a un nucleótido diferente (rojo:
timina, verde: adenina, negro: guanina y
azul: citosina).
9 Lecturas Recomendadas
FÜTTERER, J.; GISEL, A; IGLESIAS, V.; KLOTI, A.; KOST, B.;
MITTELSTEN SCHEID, O.; NEUHAUS, G.; NEUHAUS-URL,
G.; SCHROTT, M.; SHILLITO, R.; SPANGENBERG, G.;
WANG, Z.Y. 1995. Standard Molecular Techniques for
the Analysis of Transgenic Plants. En Gene Transfer to
Plants. Potrykus, Y.; Spangenberg, G. (eds.). Springer Lab
Manual.
GRIFFITHS, A.; MILLER, J.; SUZUKI, D.; LEWONTIN, R.;
GELBART, W. 2000. An introduction to the genetic
analysis. Séptima Edición. W:H:Freeman, N:York. 860 pp.
MICKLOS, D. ; FREYER, G. 1990. DNA Science. Cold Sprong
Harbor Lab. Press. Carolina Biol. Supply Comp. 477. pp.
MADIGAN, M.; MARTINKO, J.; PARKER, J. BROCK. 1998
(Octava Edición). Biología de los Microorganismos.
Prentice Hall.
NEWTON, C.; GRAHAM, A. 1997 (Second Edition). PCR.
Springer. N. York.
SAMBROOK, J.; SMITCH, E.F.; MANIATIS, T. 1989 (Second
Edition). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratomy Press. Cold spring Harbor.
SOUTHERN, E.M. 1975. Detection of specific sequences
among DNA fragments separated by gel electrophoresis.
J.Mol. Biol. 98:503-517
WATSON, J. D.; GILMAN, M.; WITKOWSKI, J.; ZOLLER,
M. 1992 (Second Edition). Recombinant DNA. Scientific
American Books. N. York.
GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana