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XI CONGRESO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOINGENIERÍA
PAPEL DE LA ENZIMA PIRUVATO OXIDASA EN CEPAS DE Escherichia coli QUE CARECEN
DEL SISTEMA DE FOSFOTRANSFERASA DE GLUCOSA DEPENDIENTE DE
FOSFOENOLPIRUVATO.
Noemí Flores, Ramón de Anda, Salvador Flores, Adelfo Escalante, Georgina Hernández, Alfredo Martínez, Octavio T.
Ramírez1, Guillermo Gosset y Francisco Bolívar. Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis. 1Depratamento de
Medicina Molecular y Bioprocesos, Instituto de Biotecnología, UNAM. Av. Universidad 2001. Col Chamilpa C.P.
62210. Tel/FAX: 556227601 [email protected]
Palabras clave: Escherichia coli, piruvato oxidasa, metabolismo de carbono.
Introducción. Escherichia coli es capaz de producir acetato
a través de la conversión de piruvato a acetil-coenzima A
(AcCoA), por medio del complejo de la enzima piruvato
deshidrogenasa (Pdh) bajo condiciones aerobias y
anaerobias, o bien por medio de la enzima piruvato oxidasa
(codificada por poxB) y la AcCoA sintetasa (codificada por
acs), en condiciones aerobias. Observaciones previas han
sugerido que en cepas mutantes de E. coli que carecen del
sistema de fosfotransferasa (PTS¯) de glucosa dependiente
de fosfoenolpiruvato, y que presentan una baja capacidad de
crecimiento en glucosa (PTS¯ Glc+), se producen diversos
autoinductores que permiten a la célula estar en un estado de
alerta en el cual son capaces de detectar la presencia
diferentes fuentes de carbono. Se ha propuesto que el acetato
puede ser uno de los autoinductores presentes en estas cepas,
y el cual es responsable de la sobre-expresión de los
operones aceBAK (vía del glioxalato), acs y glc (1).
En el presente trabajo se analizó la capacidad de las cepas de
E. coli PTS¯ (PB11), PTS¯ Glc+ (PB12) y de sus derivadas
poxB¯, de crecer en medio de cultivo mínimo con glucosa y
acetato como fuente de carbono y el efecto sobre la
transcripción de diversos genes, para determinar la
importancia de la enzima piruvato oxidasa (PoxB) en el
metabolismo de carbono en estas cepas.
Metodología. A partir de las cepas E. coli PTS¯ (PB11),
PTS¯ Glc+ (PB12), se obtuvieron por transducción con el
fago P1 las cepas derivadas PB11 poxB¯ y PB12 poxB¯,
utilizando como donadora a la cepa ATCC47002 poxB::cat.
Estas cepas, junto con la silvestre JM101, fueron crecidas en
fermentadores con 1 lt de medio mineral M9 con glucosa (2
g/l) o glucosa (2 g/l) + acetato acetato (12 mM) como
fuentes de carbono y se determinó la velocidad especifica de
crecimiento (µ) y el consumo de glucosa y acetato. Cuando
los cultivos alcanzaron una D.O.600nm = 1.0, las células
fueron cosechadas y procesadas para la extracción de ARN
total, síntesis de ADN complementario, el cual fue utilizado
como templado para realizar el análisis transcripcional por
PCR en tiempo real (RT-PCR) de varios de los genes del
metabolismo central de carbono (1).
Resultados y discusión. En cultivos en medio mínimo M9
con glucosa como fuente de carbono, la cepa silvestre JM101
presento una µ = 0.7 h-1, mientras que la PB11 y PB12,
presentaron una µ = 0.1 h-1 y 0.4 h-1, respectivamente. En
medio mínimo con glucosa más acetato, la cepa JM101
mostró un consumo preferencial por la glucosa, mientras que
las cepas PB11 y la PB12 consumieron simultáneamente
glucosa + acetato. La inactivación de poxB dio como
resultado una disminución importante de la velocidad de
crecimiento en la cepa PB11 en cultivos en glucosa y
glucosa + acetato, mientras que bajo las mismas condiciones,
las cepas poxB¯ de la JM101 y PB12 no se vieron afectadas.
El análisis transcripcional por RT-PCR de 29 genes
relacionados con la regulación transcripcional de poxB y del
metabolismo central de carbono revelo una disminución de
2× en el nivel de transcripción de los genes que codifican el
complejo de la Pdh en la cepa PB11 y un incremento de 4× 6× en el nivel de transcripción de poxB en la cepas PB11 y
PB12, comparados con la JM101 (Figura 1). Adicionalmente
a este resultado, en las cepas PTS¯, se detectó la sobreexpresión de los factores de transcripcionales de poxB: spoS,
soxS y marA.
Conclusiones. Los resultados presentados en este trabajo
sugieren de forma importante que en la cepas de E. coli
PTS¯ (PB11), la AcCoA se sintetiza principalmente a partir
del acetato producido por la enzima piruvato oxidasa,
mientras que en las cepa silvestre JM101 y la cepa PTS¯
Glc+ (PB12), la AcCoA se sintetiza preferencialmnete a
partir de piruvato por medio de la Pdh.
Agradecimientos. Este proyecto contó con financiamiento
de CONACYT NC230, 4324 y DGAPA-PAPIIT-UNAM
IN2204032, IN218902. Se agradece al Dr. Fernande Valle
(Genencor, Inc), por proporcionar la cepa ATCC47002
poxB::cat.
Bibliografía.
1. Flores, N., Flores, S., Escalante, A., de Anda, R., Leal, L.,
Malpica, R., Dimitris, G., Gosset, G., Bolívar, F. 2005. Adaptation
for fast growth on glucose by differential expression of central
carbon metabolism and gal regulon genes in Escherichia coli strain
lacking the phosphoenolpyruvate:carbohydrate phosphotransferase
system. Met. Eng. 7:70-87.