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Modulación de los sistemas del óxido nítrico y endotelinérgico
cardiovascular durante un estado de malnutrición
Rodriguez Myrian, Arza Patricia
Descriptores: Endotelinas, receptores ETS, riesgo cardiovascular
Resumen:
La enfermedad cardiovascular es la principal causa de morbi-mortalidad en
mujeres postmenopáusicas. Hay un incremento del estrés oxidativo causado
por las endotelinas (ETs), entre otras sustancias. Hasta el presente se ha
determinado la existencia de tres tipos de ETs; ET-1, ET-2, ET-3, por su
potente acción vasoconstrictora, las investigaciones se focalizaron en su papel
tanto fisiológico como fisiopatológico a nivel del sistema cardiovascular,
fundamentalmente en la regulación de la presión arterial. Existen dos tipos de
receptores que median sus acciones biológicas y se encuentran ampliamente
distribuidos en el organismo. El receptor ETA une con mayor afinidad ET-1 y
media la acción vasoconstrictora, en cambio el receptor ETB une con igual
afinidad las tres isoformas. La ET-1 producida y liberada por el endotelio actúa
sobre
ETA
localizados
en
las
células
musculares
lisas
produciendo
vasoconstricción. Asimismo actúa sobre ETB promoviendo la liberación de
óxido nítrico (NO). La malnutrición crónica es un modelo experimental que
genera un estado de estrés. Se sabe poco sobre su impacto cardiovascular y
es una problemática en la población geronte. El envejecimiento es un proceso
multifactorial caracterizado por la disminución funcional de órganos del cuerpo.
Para estudiar el posible rol del mecanismo de ETs y NO, se diseño un modelo
biológico basado en la malnutrición de ratas hembras menopáusicas de 16
meses de edad, las cuales fueron sometidas a una malnutrición en el término
de 30 días, mediante el reemplazo del alimento balanceado normal por una
dieta rica en contenido graso. Se pudo observar mediante la técnica de RTPCR que en las muestras de corazón de animales tratados, la densidad de
receptores de ETs estaba incrementada, comprobando su participación en el
modelo crónico estudiado.
Introducciòn
Estudios mostraron que
las células
endoteliales liberaban una
substancia vasodilatadora, inicialmente denominada factor relajante derivado
del endotelio, la que fue posteriormente identificada como el óxido nítrico (NO).
Asimismo, se sabía que las células endoteliales también liberaban substancias
vasoconstrictoras. En 1985 Hickey y colaboradores
describieron un factor
contráctil derivado del endotelio, pero fue recién en 1988 que este factor, al que
se denominó endotelina (ET), fue exitosamente purificado a partir de células
endoteliales porcinas en cultivo. Las ETs son una familia de isopéptidos que se
sintetizan en la mayoría de los tejidos del organismo y participan en la
regulación de distintas funciones biológicas. Las ETs constituyen una familia de
3 isopéptidos (ET-1, ET-2 y ET-3) con acciones presoras potentes y sostenidas
pero que además poseen propiedades mitogénicas y neuroendocrinas. La ET-1
es el isopéptido predominante en el endotelio vascular y el de mayor relevancia
en la regulación del tono vascular. Existen dos tipos de receptores de ET (ETA
y ETB) ampliamente distribuidos en una gran variedad de tejidos. Los
receptores ETA tienen mayor afinidad por la ET-1, mientras que los ETB tienen
la misma afinidad por todas las formas de ET. Las tres ETs muestran diferentes
actividades biológicas en relación a la afinidad y a la distribución de cada
subtipo de receptor. La ET-1 se libera en forma constitutiva en las células
endoteliales contribuyendo de manera significativa al mantenimiento del tono
vascular, también
fisiopatológicos.
puede liberarse en respuesta a estímulos fisiológicos o
En virtud
a
su potente acción vasoconstrictora,
las
investigaciones iniciales acerca de las ETs se focalizaron a nivel del sistema
cardiovascular, fundamentalmente en su participación en la regulación de la
presión arterial y el tono vascular. La mayor parte de la experiencia publicada,
tanto experimental como clínica sugiere que el endotelio vascular funciona
anormalmente en la insuficiencia cardíaca. Diversos estudios han demostrado
que la disfunción endotelial en esta afección aumenta la secreción de ET, lo
cual altera el flujo sanguíneo tanto en la circulación periférica. Varios
experimentos demostraron un aumento de 3 veces en los niveles plasmáticos
de ET-1 en pacientes con insuficiencia cardíaca en comparación con pacientes
normales.
Resulta de importancia desarrollar el concepto acerca de la posibilidad
de acciones terapéuticas más o menos específicas que mejoren la modulación
de la respuesta endotelial ante situaciones patológicas a nivel cardíaco:
antagonistas de los receptores de ETs, l-arginina, inhibidores de la enzima
convertidora de la angiotensina, bloqueantes beta-adrenérgicos, reguladores
de la hiperlipidemia. Todos estos aspectos, tanto fisiopatológicos como
terapéuticos, están siendo estudiados intensamente; es de suponer que en los
años venideros se tendrá un conocimiento mucho más profundo sobre ellos. El
estudio de los receptores de ETs y la relación de éstas con la formación del
NO, en un modelo de ratas menopaúsicas malnutridas contribuiría al desarrollo
de nuevas estrategias terapéuticas para dicha patología. Es muy poca la
información existente respecto a la relación entre el sistema del NO y las
alteraciones cardiovasculares inducidas por malnutrición crónica. El NO se
sintetiza endógenamente a partir de la L-arginina y del oxígeno molecular
mediante una reacción que es catalizada por una familia de enzimas
denominadas óxido nítrico sintasas (NOS). En el sistema cardiovascular al
igual que en otros tejidos, han sido detectadas las tres isoformas de la NOS:
NOS inducible (NOSi), NOS endotelial (NOSe) y NOS neuronal (NOSn), En el
corazón, el NO liberado por prácticamente todas las células que lo constituyen,
ejerce múltiples efectos sobre la función cardíaca. En el sistema vascular el NO
sintetizado por el endotelio, es liberado continuamente en condiciones basales
y su efecto vasodilatador es diferente dependiendo de la situación
fisiopatológica que se establece. Existen numerosos factores de riesgo
cardiovascular en la menopausia, como ser, alteraciones lipídicas, la presión
arterial, el tabaquismo y el envejecimiento. Probablemente con la edad
aumentan los mecanismos de oxidación y ello también se traduciría de forma
negativa en el sistema cardiovascular. Es sabido, que es precisamente el déficit
estrogénico en general el principal responsable de la mayor susceptibilidad
femenina en la época postmenopáusica para padecer enfermedades
cardiovasculares.
Objetivo:

Estudio de la expresión del ARNm de los receptores de endotelinas (ETA
y ETB).
Materiales y Métodos
Se utilizaron ratas de la cepa Sprague-Dawley adultas de 300-360 g de
peso corporal (PC) provenientes del bioterio. Los animales se mantuvieron bajo
condiciones normales de temperatura (22-25° C) y humedad relativa (50±2%)
con ciclos alternados de luz / oscuridad (luz de 7:00 a 19:00 hs.). Se
alimentaron ad libitum con el alimento balanceado normal (grupo control) y
alimento rico en grasas (grupo experimental). Los experimentos se realizaron
acorde a las recomendaciones formuladas por National Institutes of Health para
el cuidado y uso de animales de laboratorio (NIH Publication N85-23, 1985,
revisada en 1996).
Se estudió si el presente modelo modificaba la expresión del ARNm de
los receptores de ETs. Se sacrificaron los animales grupo control y
experimental. Se extrajeron rápidamente muestras de corazón. La variación en
la expresión del ARNm de los receptores se determinó mediante la técnica de
RT-PCR a través de la utilización de primers específicos obtenidos de
bibliografía y cotejados con la base de datos extraídos del programa Primer 3
Software tool. Los primers utilizados fueron los siguientes: ETA: 5´GTTTCCTCCAGCCGAGACTG-3´ (sense); 5´- CACCTTTCCTTCCCCTTAGA3´
(antisense)
y receptor
ETB:
5´-CAAAGACTGGTGGCTGTTCAGTT-3´
(sense); 5´-CACACCTTTCCTTCCCCTTAGA-3´ (antisense).
Extracción de ARN total y RT-PCR
El ARN total se aisló con TRIzol (Invitrogen, USA) siguiendo las
instrucciones especificadas por el fabricante. Para eliminar la presencia de
DNA genómico remanente, el ARN se trató con DNAasa I
(RQ1 DNase-
Promega). La concentración y pureza del RNA obtenido se determinó por
espectrofotometría a 260 nm y a través el radio de las absorbancias a 260 y
280 nm (A260/280.). Posteriormente, se realizó una RT utilizando 200 U MMLV de transcriptasa reversa (Fermentas), 50 pg oligodT15 (Biodynamics), 25 U
de inhibidor de ARNasa (RNasaOUT- Invitrogen) y 2 µg de ARN en un volumen
final de 15 µl. Obteniéndose DNAc de todos los RNAm presentes en las
muestras. Se utilizaron muestras de corazón como control positivo ya que la
presencia de los receptores ETA y ETB fueron previamente reportados en este
tejido. Luego de la desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos, la amplificación
PCR se realizó a 45 ciclos (30 segundos a 94°C, 50 segundos a 59.5°C y 45
segundos a 72°C), seguido por un último paso de extensión (10 minutos a
72ºC). Para la mezcla de reacción de PCR se utilizaron 12.5 μl de Gotaq
mastermix (Promega), 0.25 μl de cada uno de los primers 10mM, 0.5 μl cDNA
corazón y agua libre de nucleasa llevando a un volumen final de 25 μl. La
presencia de los productos de PCR específicos para cada receptor se verificó
por electroforesis en un gel de agarosa al 1%.
Resultados
Expresión de genética receptores ETA y ETB en corazón
Se evaluó mediante primers específicos la expresión de los receptores
de ETs en el corazón en el modelo estudiado. Los resultados mostraron que el
ARNm de los receptores ETA y ETB muestran una mayor densidad en el grupo
experimental. Los productos obtenidos fueron de 133 pb para ET A y 119 pb
para ETB, acorde a lo esperado (Figura 1A y B).
Exp CP CN
ETA
CP Exp CN
ETB
Figura 1: Expresión de ARNm de los receptores ETA y ETB en corazón. A la izquierda del
marcador se observa la presencia de los receptor ET A y ETB. Marcador 100 pb. El
producto obtenido para ETA fue de 133 pb y para ETB fue de 119 pb. CP: control positivo
(corazón); Exp: Experimental; CN: control negativo.
Conclusiones
Los resultados obtenidos en el presente estudio mostraron un importante
incremento en la densidad de los receptores para ETs. Ambos receptores se
hallaron aumentados en las muestras de corazón analizadas. Varios estudios
epidemiológicos han demostrado que las mujeres pre menopáusicas están
protegidas frente a las enfermedades cardiovasculares comparadas con los
hombres de edad similar. Después de la menopausia el riesgo cardiovascular
aumenta progresivamente. Las ETs, en conjunto con el NO, se encargan de la
vasodilatación, donde este efecto es mediado por los receptores ET B
localizados en el endotelio vascular; por el contrario, los receptores ETA y otro
subtipo de población de receptores ETB localizados en la capa de músculo liso
vascular, son los encargados de mediar la vasoconstricción.
Los resultados obtenidos mediante la técnica RT-PCR mostraron un
incremento en los ARNm de los receptores ETA y ETB en las muestras de
aquellos animales alimentados ad libitum con el alimento rico en grasas. Es
sabido que las ETs actúan a través de estos receptores activando diferentes
vías de señalización. Asimismo, la activación del receptor ETB está acoplado a
la formación del NO. Varios estudios han demostrado que en determinadas
patología se encuentra incrementado los niveles de ETs en plasma al igual que
los de NO. El presente estudio muestra claramente que en los animales
tratados con el alimento rico en grasas, la densidad de los ARNm de los
receptores para ETs fue mayor. Este hallazgo sugiere que tanto ETA como
ETB incrementan ante alteraciones alimenticias, teniendo como modelo
individuos gerontes y menopáusicos.
Queda dilucidar la relación del NO en dicho modelo asimismo la
expresión proteica de los receptores de ETs, para cotejar no solo
molecularmente el aumento en los receptores sino de manera proteica. Es
probable que estos péptidos actúen a través del receptor ET B, lo que conlleva,
según la bibliografía a un aumento en los niveles del NO. Aunque no se ha
estudiado aún pero podría ser un próximo análisis a realizar para dilucidar la
relación tanto de ETs como del NO en un modelo crónico con alteraciones
cardíacas. En virtud a los resultados obtenidos y a lo citado anteriormente, se
puede indagar en la utilización de antagonistas de los receptores de ETs
pudiendo lograr un papel beneficioso en la insuficiencia cardíaca.