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¿Qué genes están alterados en el Síndrome de Rett? Esteban Ballestar Laboratorio de Epigenética del Cáncer Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Madrid ADN Proteínas no reguladoras, con función única Función celular Célula normal Proteínas ADN-reguladoras ADN Proteínas no reguladoras 1 función celular alterada 1 proteína no reguladora alterada Proteínas ADN-reguladoras Proteínas no ADN-reguladoras DNA Varias funciones celulares alteradas i.e. Síndrome de Rett MeCP2 Proteínas ADN-reguladoras 1 proteína reguladora alterada DNA Proteínas no ADN-reguladoras Varias funciones celulares alteradas i.e. Síndrome de Rett Alternativas Terapias para proteínas no reguladoras de alteradas MeCP2 Proteínas ADN-reguladoras Identificar genes alterados por falta de MeCP2 !!!! ¿Cómo funciona MeCP2? ¿Qué funciones celulares son reguladas por MeCP2? MeCP2 MBD1 MBD2 MBD3 MBD4 MBD MBD 52.4 kD TRD CxxCxxC 43.5 / 29.1 kD (GR)nMBD MBD MBD 70 kD (E)12 Repair 32.2 kD 62.6 kD La célula dispone de varias proteínas reguladoras parecidas a MeCP2 MeCP2 CDH13 MBD1 CDH1 RASSF1 CRBP1 RIZ GSTP1 TIMP2 SOCS-1 p14 MBD2 PR MeCP2 MeCP2 MBD3 MBD1 MBD1 RARβ2 p16 p15 SYK p73 MeCP2 MBD2 MGMT CHFR MeCP2 MBD1 MBD2 MBD2 TIMP 3 TMS1 DAPK1 MBD1 ER1 MBD3 Cuando eliminamos MeCP2 de las célula alteramos muchas funciones Objetivo fundamental del proyecto • Determinar qué genes estan afectados por la falta de funcionalidad de MeCP2 en niñas Rett mediante chips de ADN Beneficios del proyecto • La identificación de los genes afectados por la falta de función de MeCP2 es la forma de realizar un diseño racional de terapias Ballestar et al (2005) Hum Genet Chips de ADN para determinación de genes con expresión alterada Obtención de un MAPA de expresión de los pacientes Rett Muestra control Paciente Rett, R255X Ballestar et al (2005) Hum Genet HeLa Control Control MeCP2i MeCP2 - Determinar qué genes estan afectados en tejido nervioso por pérdida de función de MeCP2 PLAN de TRABAJO: 1) Obtención y caracterización de los ratones deficientes en MECP2 Aislamiento de encéfalo, mesencéfalo, bulbo raquídeo 2) Análisis mediante microarrays 3) Análisis de los cambios de expresión mediante RT-PCR 4) Ensayos de ChIP con anticuerpos MeCP2 6) Análisis global de los cambios de modificación de las histonas 7) Análisis de los cambios de modificación de las histonas en promotores MeCP2-null mice as a model for Rett syndrome HDAC HMT MeCP2 HDAC HMT MeCP2 3mK9 H3 AcH3 3mK4 H3 AcH4 Transcriptional silencing Transcriptional activation Looking for transcriptional changes Wild type mice MeCP2-null mice Forebrain Forebrain Midbrain Midbrain Hindbrain Hindbrain RNA Extraction RNA Extraction Amplification Amplification Reverse transcription and labeling Reverse transcription and labeling Hybridization Candidate overexpressed genes in MeCP2-null mice Gen 1 Gen 1 Gen 3 Image scanning Gen 4 Data analysis Gen 5 ChIP assays: direct protein-DNA interactions and activation marks Rett In pu t NA B B M eC P2 In pu B t NA B B M eC P2 H B 2O Sano Gen 1 Gen 1 Gen 3 Gen 4 Gen 5 Laboratorio de Epigenética Manel Esteller Mario F. Fraga Pilar Lopez-Nieva Paz Quesada Esteban Ballestar Agustin Fernandez Lidia Lopez-Serra Santiago Ropero Maria Berdasco Rocio Gonzalez Isabel Lopez de Silanes Cecilia Rosales Sara Casado Filipe Jacinto Amaia Lujambio Fernando Setien Colaboradores Associació Catalana de la Síndrome de Rett. Dr Mercè Pineda Dra Eugènia Monròs Dra Judith Armstrong Asociación Valenciana del Síndrome de Rett
