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Memorias del XXXIV Encuentro Nacional y III Congreso Internacional de la AMIDIQ
7 al 10 de mayo de 2013, Mazatlán, Sinaloa, México
CLONACIÓN DEL GEN FACTOR DE ELONGACIÓN 1-α (EF-1α) DE
LEISHMANIA MEXICANA
Annete I. Apodaca-Medinaa, Zayda L. Piedra-Quinteroa, Paul E. Montes-Martíneza, José E. EncisoMonárreza, Evangelina Beltrán-Lópeza, Jeanett Chávez-Ontiverosa, Claudia R. León-Sicairosa, Vianney
Ortiz-Navarreteb, Héctor S. López-Morenoa
a
Laboratorio de Biomedicina Molecular, CA Biotecnología Biomédica, Facultad de Ciencias Químico
Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Av. las Américas y Blvd. Universitarios S/N, Cd.
Universitaria, Culiacán, Sinaloa, C.P. 80000, MÉXICO. [email protected]
b
Departamento de Biomedicina Molecular, CINVESTAV, Av. Instituto Politécnico Nacional 2508, San
Pedro Zacatenco, Delegación Gustavo A. Madero, México DF, C.P. 07360, MÉXICO.
Resumen
Las Leishmaniasis son un grupo de enfermedades parasitarias causadas por
protozoarios intracelulares del género Leishmania, transmitidos por la picadura de dípteros
hematófagos del género Lutzomyia. En México, la Leishmaniasis Cutánea (LC) es
endémica en varios estados incluyendo a Sinaloa. Recientemente nuestro grupo reportó
cinco nuevos antígenos derivados de Leishmania mexicana (L. mexicana) detectados
únicamente por sueros de pacientes con diagnóstico de certeza de LC; posteriormente se
aisló y secuenció uno de dichos antígenos (p29), el análisis in silico mostró similaridad con
el Factor de Elongación 1-alfa (EF-1α) de L. mexicana. El EF-1α de L. donovani, se une a
la fosfatasa SHP-1 contribuyendo a la inhibición del macrófago, impidiendo la eliminación
del parásito, además este factor ha sido evaluado como potencial blanco terapéutico contra
la Leishmaniasis Visceral. En L. mexicana el EF-1α no ha sido estudiado y debido a su
posible participación en la relación hospedero-parásito y a su potencial inmunodiagnóstico
se considera de gran relevancia estudiarlo, por ello se planteó clonar el gen EF-1α
empleando el DNA de L. mexicana cepa MHOM/MX/92/UAY68. Nuestros resultados
permiten definir inmunoquímicamente a p29 como el EF-1α de este parásito. Asimismo, se
logró clonar este gen y su secuencia nucleotídica presentó una identidad del 100% con el
EF-1α, finalmente se registró en el GenBank con número de acceso JQ762448.
Introducción
Las Leishmaniasis son un grupo de enfermedades infecciosas causadas por parásitos
intracelulares del género Leishmania que son transmitidos al ser humano y otros mamíferos
mediante la picadura de la hembra hematófaga de insectos dípteros del género Lutzomyia
en América [4]. En el ser humano, la infección por Leishmania puede afectar la piel y las
mucosas o tejidos y órganos como la médula ósea, el hígado y el bazo, produciendo un
espectro de enfermedades con diferentes formas clínicas que son la Leishmaniasis Cutánea
(LC) que puede ser localizada (LCL) o difusa (LCD), Leishmaniasis Mucocutánea (LMC)
y Leishmaniasis Visceral (LV) [6].
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© 2013 Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química (AMIDIQ)
ISBN: 978-607-95593-1-1
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La morbilidad global de esta parasitosis es de 2.4 millones de personas (946,000
para los hombres y 1, 410,000 para las mujeres) en 98 países incluido México y cuenta con
una tasa de mortalidad de aproximadamente 60,000 habitantes por año [1]. Para el caso del
estado de Sinaloa, hasta el 2012 se reportaron aproximadamente 120 casos de LC [7].
La respuesta inmune innata durante la Leishmaniasis es mediada principalmente por
neutrófilos, macrófagos, células dendríticas (DC) y células asesinas naturales (NK) [1]. Sin
embargo Leishmania ha logrado desarrollar diversas estrategias que le permiten evadir al
sistema inmune del hospedero, principalmente mediante la inhibición de funciones críticas
de los macrófagos, como la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y los
productos intermediarios de nitrógeno (NO). Esta inhibición de la activación de los
macrófagos es provocada por una serie de factores de virulencia derivados de Leishmania,
así como por la secreción de un gran repertorio de moléculas [2]. En Leishmania se han
reportado diversos antígenos relevantes, uno de ellos es el Factor de Elongación 1 alfa (EF1α), el cual desempeña un papel central en la biosíntesis de proteínas, además de participar
en una gran variedad de procesos celulares. En L. donovani, el EF-1α funciona como un factor de virulencia mediante la activación de la fosfatasa SHP-1 en los macrófagos
infectados, lo cual permite la regulación negativa de la síntesis de productos intermediarios
de nitrógeno, es decir tiene la capacidad de desactivar el fenotipo efector de estas células
[2].
El EF-1α en todas las células tiene una naturaleza altamente conservada, sin embargo se ha demostrado que existe una deleción de 12 aminoácidos en la proteína de
Leishmania comparada con la secuencia proteica en mamíferos, lo que sugiere que las
diferencias en las propiedades de éstos dos factores se debe al distinto plegamiento de la
proteína, pero además esta ausencia de 12 aminoácidos expone una región del EF-1α que se
propone como un potencial blanco farmacológico contra Leishmania [3].
Para el caso de L. mexicana el EF-1α no ha sido estudiado, sin embargo recientemente nuestro grupo de investigación reportó un set de cinco nuevos antígenos
derivados de L. mexicana evidenciados mediante western blot de doble dimensión
empleando como antígeno un extracto crudo de L. mexicana (ECLm) y sueros de pacientes
con diagnóstico de certeza de LC [5]. La secuencia de aminoácidos del más prominente de
ellos, llamado p29, permitió identificarlo in silico como el EF-1α, por lo que en este trabajo se plateó confirmar su naturaleza inmunoquímica y clonar el gen EF-1α de L. mexicana
empleando iniciadores específicos y secuenciar el amplicón resultante para verificar la
identidad de este factor.
Metodología
Para identificar la naturaleza inmunoquímica de p29 se realizó un Western blot 2D
con anti-EF-1α comercial (SIGMA) así como suero de un paciente con diagnóstico de LC y
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utilizando como antígeno extracto crudo de L. mexicana de la cepa
MHOM/MX/92/UAY68. Para el diseño de los iniciadores específicos (Z-EF1a-F y Z-EF1aR) se utilizó el programa OLIGO® versión 7 y la secuencia del genoma completo de L.
mexicana cepa MHOM/GT/2001/U1103 (GenBank: FR799570.1). Se estandarizó una PCR
empleando los iniciadores Z-EF1a-F y Z-EF1a-R y como DNA templado DNA genómico
de L. mexicana aislado mediante el kit comercial PureLink Genomic DNA (Invitrogen). El
amplicón de 1300 pares de bases (pb) fue purificado con el kit de extracción QIAQUICK
GEL (QIAGEN). El producto de PCR purificado fue enviado para su secuenciación al
Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad (LANGEBIO) en Irapuato,
Guanajuato.
Resultados
El Western blot 2D reveló la naturaleza inmunoquímica de p29 como el EF-1α
(Fig.1).
Se
diseñaron
los
iniciadores
específicos
Z-EF1a-R
(5´
ATGGGCAAGGATAAGTG-3´) y Z-EF1a-F (5´-TTACTTCTTCGCAGCCTT-3´). Con
estos iniciadores y DNA de L. mexicana se realizo PCR obteniendo un producto con un
peso molecular de aproximadamente 1300 pb (Fig. 2) el cual fue purificado y enviado a
secuenciación. La secuencia obtenida mostró un tamaño de 1261 pb (Fig. 3) y se registró en
GenBank con número de acceso JQ762448. Esta secuencia se sometió a un análisis
BLAST el cual mostró que el fragmento amplificado tiene una identidad del 100% con el
Factor de Elongación 1-α de L. mexicana (Fig. 4).
Figura 1. p29 es el EF-1α de Leishmania mexicana. A) Reactividad del suero de un
paciente con LC empleando como antígeno ECLm. B) p27 y p29 evidenciados con un antiEF-1α comercial (Sigma) empleando como antígeno ECLm, confirmando con estos datos
que p29 es el EF-1α de L. mexicana.
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Figura 2. Amplificación del Gen EF-1α de L. mexicana. Línea 1) Marcador de peso
molecular 1 Kb; 2-6) productos de PCR donde se evidencia un amplicón de
aproximadamente 1300 pb; 7) DNA irrelevante de Salmonella Typhimurium; 8) Control
negativo con H2O.
TGTCGACGCCGGCAAGTCCACCGCCACTGGCCACTTGATCTACAAGTGCGGTGGCATCGACAAGCGCACGATCGAGAAGTTCGAG
AAGGAGGCCGCCGAGATCGGCAAGGCGTCCTTCAAGTACGCGTGGGTGCTCGACAAGCTGAAGGCGGAGCGCGAGCGCGGCATCA
CGATCGACATTGCGCTGTGGAAGTTCGAGTCGCCGAAGTCCGTGTTCACGATCATCGATGCGCCCGGCCACCGCGACTTCATCAA
GAACATGATCACGGGCACGTCGCAGGCGGACGCGGCCATCCTGATGATCGACTCGACGCATGGTGGCTTCGAGGCTGGCATCTCG
AAGGACGGCCAGACCCGCGAGCACGCGCTGCTTGCCTTCACTCTTGGCGTGAAGCAGATGGTGGTGTGCTGCAACAAGATGGACG
ACAAGACGGTGATGTACGCGCAGTCGCGCTACGATGAGATCAGCAAGGAGGTGAGCGCGTACCTGAAGCGCGTGGGCTACAACCC
GGAGAAGGTGCGCTTCATCCCGATCTCGGGGTGGCAGGGCGACAACATGATCGACAAGTCGGACAACATGCCGTGGTACAAGGGT
CCCACGCTGCTGGACGCGCTCGACATGCTGGAGCCGCCGGTGCGCCCGGTGGACAAGCCGCTGCGCCTGCCCCTGCAGGACGTGT
ACAAGATCGGCGGTATCGGGACGGTGCCCGTGGGCCGCGTGGAGACCGGGATCATGAAGCCGGGCGACGTGGTGACGTTCGCGCC
CGCCAACGTGACGACTGAGGTGAAGTCGATCGAGATGCACCACGAGCAGCTGGCGGAGGCGCAGCCCGGCGACAACGTCGGCTTC
AACGTGAAGAACGTGTCGGTGAAGGACATCCGCCGTGGTAACGTGTGCGGCAACTCGAAGAACGACCCGCCGAAGGAGGCGGCCG
ACTTCACGGCGCAGGTGATCGTGCTGAACCACCCCGGCCAGATCAGCAACGGCTACGCGCCGGTGCTGGACTGCCACACGAGCCA
CATCGCGTGCCGCTTCGCGGAGATCGAGTCCAAGATCGACCGCCGCTCCGGCAAGGAGCTGGAGAAGAACCCCAAGGCGATCAAG
TCTGGCGACGCCGCGATCGTGAAGATGGTGCCGCAGAAGCCGATGTGCGTGGAGGTGTTCAACGACTACGCGCCGCTGGGCCGCT
TTGCCGTGCGCGACATGCGGCAGACGGTCGCCGTGGGCATCATCAAGGGCGTGAACAAGAAGGAGAGCAGC
Figura 3. Secuencia de p29 de L. mexicana. Secuencia nucleotídica de 1261 pb obtenida
del amplicón de p29 de L. mexicana.
Figura 4. Alineamiento BLAST. El alineamiento in silico de p29 mostró una similaridad
del 100% con el EF-1α de L. mexicana.
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Conclusiones
1. Se confirmó la naturaleza inmunoquímica de p29 como el Factor de Elongación
1alfa de L. mexicana.
2. Se obtuvo la secuencia parcial del gen Factor de Elongación 1 alfa de L. mexicana.
3. La secuencia génica del Factor de Elongación 1 alfa de L. mexicana se registró en
GenBank con el número de acceso JQ762448.
Referencias
1. Das A, Ali N, “Vaccine development against Leishmania donovani” Frontier in Immunology, Vol. 3,
No. 1, p. 1-19, 2012.
2. Lambertz U, Maxwell J, Nandan D, Robert W, Clos J, Foster L, Reiner N, “Secreted virulence factors and immune evasion in visceral leishmaniasis”, Journal of leukocyte biology Vol. 1, No. 91,
p. 887-899, 2012.
3. López M, Cherkasov A, Nandan D, “Molecular architecture of Leishmania EF-1α reveals a novel site that may modulate protein translation: A possible target for drug development”, Biochemical and
Biophysical Research Communications, Vol.1, No. 356, p. 886-892, 2007.
4. Ochoa-Díaz Y, López-Moreno C, Rendón-Maldonado J, López-Moreno H, “Molecular diagnosis of
Leishmania mexicana in a cutaneous leishmaniasis case in Sinaloa México”, Vector borne and
zoonotic diseases, Vol. 12, No. 1, p. 78-80, 2011.
5. Salazar-Mejía P, Tejada-Aguirre C, López-Moreno H, “Reacción de antígenos de Leishmania
(Leishmania) Mexicana con sueros de pacientes con leishmaniasis cutánea de Sinaloa, México”, Salud Pública de México, Vol. 52, No. 2, p. 165-169, 2010.
6. Vélez I, Robledo S, “Leishmaniasis”, Revista Leprologie Fontilles, Vol. 27, No. 4, p. 367-396, 2010.
7. www.saludsinaloa.gob.mx
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