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TECNICAS ACTUALES DE DETECCION DE LA RABIA •
J. LÓPEZ ROS
(del Departamento Antirrábico del Laboratorio Municipal de Barcelona)
Inmunoprecipitación.
rabia continúa siendo una de
Fijación de complemento.
las enfermedades que mayores
Los
segundos, llamados de diagproblemas plantea en cuanto a su
diagnóstico, y este diagnóstico es nóstico lento y de confirmación,
de interés no sólo para las perso- son:
Inoculación a animales y deternas mordidas, sino también para
minación
vírica.
la Sanidad Nacional. Se fundamenta el diagnóstico de la enfermedad
Inoculación a cultivos celulares.
en dos procedimientos. la observación y determinación de lesiones
Impresión y coloración SeIlers
histopa tológicas y las modificaciones séricas debidas al contacto con
Es un método simple y muy ráel virus rábico y la identificación pido aconsejable en aquellos paídel virus por aislamiento del mis- ses endémicos de la enfermedad.
mo.
Con este método un técnico entreLos primeros métodos, también nado pone en evidencia los corllamados de diagnóstico rápido, púsculos de Negri en un 85 % de
son:
los casos.
Impresión y tinción.
Histopatológicos.
M aterrial y métodO'
Prueba de los anticuerpos fluoSe preparan las soluciones:
rescentes.
L
A
A)
B)
So"lución de azul de metileno pUflSlmo .
Alcohol metílico absoluto libre de acetona
Solución de fucsina básica purísima
Alcohol metílico absoluto y puro
10 grs.
1.000 cc.
5 grs.
500 cc.
(*) Comunicación explanada en la Sesión del día 30-IV-68. Presentación de los Académicos Corresponsales Nacionales doctores A. Valls Conforto y 1. Vives Sabater.
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ANALES DE MEDICINA Y CIRUGIA
Estas soluciones se conservan en
refrigerador a .+42 C.
En el momento de su empleo se
mezclan dos partes de la solución
A y una parte de la solución B.
Estas proporciones, sin embargo,
se ajustarán según el aspecto del
frotis. El aspecto ideal es el color
violáceo, aunque en los acúmulos
tisulares se observe una cierta tendencia al color rojizo.
La mezcla de Sellers puede conservarse bien en el refrigerador una
vez ajustada la proporción ideal.
Realizada la impresión del asta
de Ammon sobre portaobjetos, y
aún fresca, se introduce en la mezcla colorante durante dos, tres segundos y a continuación se aclara con agua.
Las preparaciones ya secas o fijadas, no son aconsejables, aunque en estos casos el contacto con
el colorante debe ser de unos cinco minutos.
Se seca la preparación y se observa. Los acúmulos celulares de neuronas muestran un citoplasma de
un color azul pálido, los núcleos
son rojos. Los corpúsculos de Negri toman una forma esferoidal,
granulosa y color violáceo próximo
al rojo. Son únicos o múltiples y
situados en el citoplasma .celular,
generalmente en las proximidades
.
del axon.
Pueden ocasionar dudas los eritrocitos superpuestos, los cuerpos
de inclusión de la enfermedad de
Carré (aunque más pequeños y sin
granulación), los cuerpos de inclu-
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sión de los virus neumo-neurótropos del gato, las células plasmáticas de la panleucopenia felina, etc.
Sin embargo, es de recordar que
estas posibles causas de error no
son muy frecuentes en el asta de
Ammon, y lo son en las neuronas
de la corteza cerebral y en las células de Purkinje del cerebelo.
Métodos histopatológicos
Los métodos histopatológicos,
tan profusamente utilizados en el
diagnóstico de la rabia ,tienen una
utilidad indiscutible, pero teniendo
en cuenta varios puntos de suma
importancia. La lesión tisular producida por el virus rábico en el
cerebro y cerebelo consiste en una
poliencefalitis plurifocal pero con
zonas de preferencia; por lo tanto,
distinta de la encefalitis por arbovirus que verdaderamente· produce
panencefalitis.
En la rabia típica existen: a)
Lesiones en la sustancia gris de
la medula (cuernos ánteroposteriores). b) Lesiones en la parte rostral de bulbo y puente de Varolio,
yo) Lesiones en el asta de Ammon,
hipocampo, células de Purkinje y
ganglios espinales y básicos (Gasser y plexiformes).
N o son frecuentes las lesiones en
la parte ventral del bulbo y puente
de Varolio, en el tálamo y en la
corteza cerebral.
Se distinguen dos tipos de lesión: inflamatoria y celular.
Mayo-Junio 1968
ANALES DE MEDICINA Y CIRUGIA
El complejo inflamatorio está
constituido por infiltrados perivasculares de linfocitos, células plasmáticas e histiocitos con formación
de nódulos gliales (nódulos de Babes).
La lesión celular neuronal consiste en el llamado corpúsculo de
Negri aparente en las células del
sistema nervioso desde el punto de
la mordedura hasta el asta de Ammon y red celular de Purkinje.
Estas lesiones celulares son tanto más intensas cuanto más lenta
es la evolución de la enfermedad,
al contrario de lo que ocurre con
las lesiones del proceso inflamatorio.
En consecuencia, el diagnóstico
histopatológico se basa en la observación de los corpúsculos de
Negri, ya que la lesión inflamatoria es inespecífica.
Dicho diagnóstico puede fundamentarse sobre cualquier método
histológico (congelación o inclusión) y gracias a cualquier método de tinción general o especial
del SNC.
La práctica demuestra la utilidad de dos métodos: el de congelación y tinción Gallego y el de
inclusión y tinción de Mann.
Método de Gallego. - Se obtienen cortes por congelación de los
órganos preferidos por el virus rábico del grosor de 5-10 mm. que se
tiñen libremente o previa fijación
en portaobjetos con albúmina de
Meyer.
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Material y método. - Un minuto en solución nítrico-férrica para
sensibilización. Sin lavar, coloración a la fucsina de Ziehl al 7,5 %
durante cinco minutos. Lavado en
agua durante 30 segundos y virofijación con solución formol-nítricoférrica durante 5 minutos. Sin lavar introducir de uno a dos minutos en la solución de picroindigo
de carmín. Deshidratación en alcoholes y aclaramiento por el carboxilol, montaje al bálsamo.
Los citoplasmas celulares se tiñen de color azul-verdoso, los núcleos toman color violáceo y los
nucleolos un color rojizo destacable. Los hematíes toman un color
verdoso y los granulo citos color
rojo oscuro, los corpúsculos de Negri aparecen rosa pálidos con granulación interna.
Método de Mann. - Obtenidos
los bloques de inclusión (a la parafina) lento o rápido o al dioxano,
y efectuados los cortes al microtomo, se introducen en la solución
al azul de metileno-eosina manteniéndolos 24 horas a temperatura
de laboratorio.
También puede acortarse este
tiempo a 10 horas manteniendo la
preparación en estufa a 37º e, teniendo en cuenta que según este
método la preparación debe pasar
por el etanol-formol para hacer insoluble la gelatina. Lavar al agua
y rápidamente pasar por alcohol
absoluto. Diferenciar en alcohol sódico hasta la aparición de un tinte
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ANALES DE MEDICINA Y CIRUGIA
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rosáceo en la preparación (aproxi- ción durante varios segundos en
madamente unos 10 minutos) y se- alcohol absoluto y tolueno. Monguidamente lavar con agua. Con tar al bálsamo con una pequeña
ello la preparación toma un tinte gota del mismo y presionar para
azulado (sino será menester intro- su perfecto reparto.
El examen se realiza con microsducir el corte en la solución acéticopio
de fluorescencia empleando
ca acuosa). Deshidratar a los alun
filtro
de paso de 5.150 A y uticoholes y xilol y montar al bálsalizando como líquido de inmersión
mo.
Las células toman en su citoplas- el aceite de parafina.
Los corpúsculos de Negri resalma un color azulado con núcleo de
tan
por su fluorescencia de tinte
azul más oscuro y nucleolo rojo.
Los hematíes son rosa y los cor- azulado, sobre un protoplasma amapúsculos de N egri toman color ro- rillo y núcleos azules pálidos. Los
hematíes y nucleolos no se distinjo vivo.
Pudiera sustituirse la eosina por guen de los núcleos.
Este método útil y rápido prela floxina B, que hace resaltar los
corpúsculos pero con pérdida de senta sin embargo los inconvenientes propios de la aparición de fluola limpieza celular.
rescencias inespecíficas y se perfeccionan
por el método de la coloraDiagJllós,tico por fluorescencia e
ción
específica
de anticuerpos coninmunofluorescencia
jugados con la sustancia fluoresLa utilización del microscopio cente.
Este método de anticuerpos fluode fluorescencia permite la obserrescentes
es la prueba microscópivación de los corpúsculos de N egri cuando éstos se impregnan por ca de más alto valor que existe en
un fluorocromo que ha sido exci- la actualidad y que fue puesta en
tado por una longitud de onda de práctica en 1958 por Goldwasser
y Kissling.
4.000 JL
La inmunofluorescencia consiste
Material y métodos. - Se fija el
asta de Ammon y se incluye, cor- en marcar anticuerpos con colorantándola en capas muy finas que se tes fluorescentes y ponerlos en conmontan sobre protaobjetos y se pa- tacto con el antígeno específico, de
san por el xilol, el alcohol absolu- esta manera y por observación en
to yagua para desparafinar per- microscopio de fluorescencia, los
antígenos unidos al anticuerpo
fectamente.
marcado
presentan un brillo verde
Se colorean por inmersión durante 30 minutos en una solución o amarillo verdoso (por el isitiociaacuosa al 0,2 l% de tioflavina S. nato de fluoresceína) sobre fondo
Sin lavar se introduce la prepara- azulado.
..
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Material y método. - En primer lugar debemos disponer del
llamado suero conjugado hiperinmune, cuya obtención es de técnica bastante delicada. Se prepara
un suero antirrábico en conejo o
caballo y se separan la fracción
globulínica por el método del sulfato amónico o mejor la separación
de gammaglobulina según la técnica de Clark y Shepard (Virology,
1963, 20, 642-644).
El marcado de la gammaglobulina, que presenta menos problemas·
de fluorescencias inespecíficas en
comparación con las globulinas, se
efectúa contactando la solución al
1 '% de proteína con la solución
tampón carbonatada de M 0,025 Y
colocando la mezcla en tubo de diálisis para añadir luego 10 volúmenes de la solución de isotiocianato
de fluoresceína al 0,1 mg. por cc.
en la misma solución tampón carbonatada.
Se dializa durante 24 horas en
frigorífico a 4Q C agitando continuamente, continuando luego la
diálisis frente a una solución tampón fosfatada de pH = 7,3 hasta
desaparición de fluorescencia en el
producto.
Con este procedimiento se fija
el isotiocianato en cantidad variable según su calidad (entre los 4,78,1 mg. por gr. de proteína) y se
evitan las coloraciones fluorescentes del núcleo celular y del citoplasma. Numerosas variantes permite la inmunofluorescencia: mé-
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todo directo, método indirecto y
método de coloración del complemento.
Método directo. - Consiste esta técnica en aplicar directamente dos impresiones sobre un portaobjetos, bloques de inclusión o cortes por congelación de material
fresco, la suspensión de anticuerpos marcada por el fluorocromo.
Cuando las muestras vienen con
glicerina deben lavarse con suero
fisiológico dos o tres veces antes
de la aplicación del anticuerpo
marcado, ya que la glicerina es
fluorescente. Los portaobjetos se
secan al aire y se colocan en un
vaso de precipitados o frasco de
Borrell con acetona fría y se dejan en congelador a -20 e durante 2-4 horas y mejor las 24 horas que permiten una fijación perfecta. Se extraen los portas, se expulsa el resto de acetona por sacudida y se dejan secar en el mismo congelador; luego pasan a temperatura de laboratorio para evitar la aparición de agua de condensación. A continuación se introducen en agua destilada calentada
a 37º e y se mantienen durante 10
minutos a dicha temperatura.
Se retiran los portaobjetos, se
lavan con solución tampón fosfatada de pH = 7,4 y se dejan en
esta solución 10 minutos más. Se
secan al aire y se deposita sobre
las impresiones o bloques una gota de glicerol al 50 '% tamponado
Q
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a pH = 7,6. Observar a microscopio.
El anticuerpo marcado se conserva en congelador durante 3-4
meses y si es posible su liofilización, su conservación a 4º C puede
prolongarse unos dos años.
Con la técnica antes mencionada de obtención de gammaglobulina no es necesario fijar el anticuerpo marcado sobre polvo de órganos (hígado o cerebro de ratón
blanco) para su conervación, lo
cual se hace necesario empleando
el método de separación globulínica por el sulfato de amonio (S04
Am2) o el método de electroforesiso
Como comprobación de los materiales de la técnica y evitación de
falsas interpretaciones, es conveniente periódicamente realizar.
pruebas testigo empleando solución de cerebro de ratón normal
(CRN) y solución de cerebro de
ratón infectado (CRI) que se obtienen por suspensión del mencionado cerebro al 20 % en yema de
huevo proveniente de huevos embrionados de 7 días, es decir, saco
vitelina al 10 % en solución tampón fosfatada a pH = 7,6.
Estas soluciones control se depositan en gota sobre portaobjetos, se extienden y se dejan secar,
continuando la marcha de la técnica previo contacto con el anticuerpo marcado.
La solución CRN se emplea sin
necesidad de centrifugación previa,
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,0
mientras que la solución CRI debe
ser siempre centrifugada.
Ambos soluciones se conservan
muy bien en congelador a -20º C.
El método indirecto, que en resumen consiste en poner en contacto anticuerpo no marcado con
antígeno homólogo no marcado para provocar un complejo no marcado y ponerlo en contacto con un
anticuerpo homólogo marcado para reproducir finalmente un complejo marcado, ha sido poco estudiado debido a la necesidad de emplear antígenos y anticuerpos de
la misma especie, lo que también
lo hace poco útil para el diagnóstico.
El método de la coloración del
complemento tiene también muy
poco' interés en el diagnóstico de
rabia.
Consecuencia del método directo
tenemos una variante denominada
de inhibición de la fluorescencia,
útil como control de especificidad
de coloración y evidencia de anticuerpos séricos en personas vacunadas o animales enfermos sospechosos.
Consiste la prueba en aplicar
anticuerpos homólogos no marcados sobre impresiones o cortes de
tejido rábico positivo, que da lugar a una reacción antígeno-anticuerpo normal. Si entonces se añaden los anticuerpos marcados, la
coloración por inmunofluorescencia es inhibida, ya que el antígeno
ha sido bloqueado por los anticuerpos no marcados.
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Inmunoprecipitación en gel de
agar
La reacción entre antígeno-anticuerpo que tiene como consecuencia la precipitación en forma de líneas bien visibles, de gran utilidad en serología, ha sido aplicada
al diagnóstico de la rabia después
de varios ensayos.
Es menester antes de entrar en
detalles de técnica, aclarar algunos conceptos.
Ante todo, es de primordial importancia la utilización de antígenos y anticuerpos de potencia. El
antígeno se puede obtener por inoculación intracerebral en perro con
Naranja de Metilo
Bacto~Agar
Mertiolato de Na .
Agua destilada.
El naranja de metilo permite
muy buenas lecturas, pero también
puede utilizarse el Rojo Congo al
0,02 por 100 y el Azul de Metileno
al 0,03 por 100. El mertiolato impide la contaminación de la placa
que sería causa de dificultad en la
lectura.
El medio se conserva a 4 Q C y se
funde al baño María en el momento de su empleo. Se reparte en placa de Petri estéril y una vez solidificado el medio, se efectúa la extracción de cilindros del medio gracias al empleo de un perforador o
taladrador de tapones. Los orificios efectuados tendrán un diámetro interior de 7 mm. y estarán
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virus calle virulento, o mejor, por
menos peligroso, virus fijo intracerebral a conejos jóvenes, el cual
virus debe ser repetidamente pasado por cerebro de conejos.
El. antisuero se obtiene por hiperinmunización de caballos o conejos con virus fijo y entretenimiento con la cepa Flury HEP o
mejor aún la cepa LEP.
Con esta técnica puede investigarse un antígeno o un anticuerpo desconocido y con ello llegar al
diagnóstico de la rabia.
El medio para la evidenciación de las dos
líneas de precipitación que aparecen en los sujetos rábicos es:
M aterrial y método. -
0.03 gr.
15
gr.
0.2 gr.
1.000 cc.
situados en circunferencia, de forma que tengan por centro otro orificio igual. La separación de los
orificios entre sí será de 5 mm.
Estas medidas han demostrado
ser las ideales en la mecánica de
la prueba.
Por medio de pipeta se añade
una gota de medio fundido en los
orificios para que éstos queden perfectamente cerrados por su parte
inferior y no se mezclen los antígenos y anticuerpos, que impedirían la aparición de las líneas de
precipitación.
La distribución de los anticuerpos o antígenos puede efectuarse
de la forma deseada, ya colocando
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ANALES DE MEDICINA Y CIRUGIA
el antígeno en el orificio central o
en los orificios de la parte exterior. Conjuntamente puede realizarse una prueba control de los
elementos de la reacción.
Se llenan los orificios con el antígeno, los anticuerpos y los controles de ambos y se lleva la placa
a la estufa a. 37 9 e cuidando durante las primeras 8-10 horas que
no se vacíen los orificios por evaporación, añadiendo antígeno o anticuerpo por medio de pipeta.
Las lecturas se realizan a las
24, 48 Y 72 horas, empleando preferiblemente la observación en
campo oscuro.
La línea primera aparece entre
las 24 y 48 horas, mientras que la
segunda, más débil, lo hace a las
72 horas.
Las lÍnea3 aparecen como envolviendo el lugar en donde se encuentra el antígeno virus rábico.
Químicamente la reacción parece ser debida a la aparición en los
sueros antirrábicos de una gran
cantidad de gammaglobulina (/.,2, lo
que indica que cualquier modificación en este sentido puede falsear
el resultado. Su positividad es de
un valor diagnóstico absoluto, hecho que debe invitar a todos a proseguir y experimentar muchas veces una prueba de tal utilidad diagnóstica rápida.
Fijación del complemento
Esta prueba diagnóstica ha sufrido durante los años el interés
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y el abandono periódicos. La causa puede hallarse en el hecho de
tratarse de una prueba de gran
sensibilidad, pero al mismo tiempo una muy escasa especificidad.
Ando y cols., en el Instituto Nacional de la Salud de Tokyo, han
sido los más recientes defensores
de la técnica señalada, pero utilizando como productos problema
sueros de sospechosos y de personas vacunadas. El método es el
general de toda fijación de complemento, pero con la precaución
de preparar los antígenos de la siguiente manera.
5 gr. de sustancia cerebral se
suspenden en 7,5 cc. de suero fisiológico, inmersión durante una hora en baño María a 40º C y centrifugación a 3.000 rpm durante
30 minutos.
El anticuerpo es un suero inmune logrado a partir de cobaya que
se somete a 8 inoculaciones intraperitoneales con virus fijo al 10
por 100 inactivado por los rayos
ultraviolettas y 5 inoculaciones de
2 cc. con varias cepas virulentas
al 10 por 100 también.
Terminada la exposición de los
métodos denominados de diagn6s- .
tico rápido, entramos en el método más antiguo de diagnóstico de
la enfermedad, pero no por ello
menos seguro; su inconveniente ya
lo conocemos, la lentitud. A continuación daremos detalles del esperanzador método de los cultivos
célula-tisulares.
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ANALES DE MEDICINA Y CIRUGIA
Inoculación a animales
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lógico, unido a la seroneutralización, determina la identificación
del virus rábico.
Son útiles la mayoría de los animales de laboratorio, pero prefePropagación del virus rábico
rentemente se utilizan el conejo y
en cultivos celulares
el ratón blanco.
La vía de elección para estos
animales es la intracerebral en doEl estudio del efecto y multiplisis de 0,03 cc. para el ratón blan- cación del virus rábico en cultico y 0,25 cc. para el conejo. Las vos celulares, abre un extenso camsuspensiones a inocular se prepa- po para el trabajo diario del diagran al 10 por 100 de materia ce- nóstico de la rabia. Y no solamente en el campo mencionado, sino
rebral.
La enfermedad tiene una incu- también en las técnicas de prepabación, en el conejo, de 8-20 días, y ración de vacunas para el perro y
se presenta en forma paralítica el hombre.
Disponemos de los siguientes copremortal. En el ratón blanco la
incubación dura habitualmente de nocimientos:
Sistemas de cultivo ce:lular. 5-14 días, y también la presenta1. Células primarias. a) Fibroción es paralítica.
El cobaya, que tiene la ventaja blastos de pollo. El virus rábico se
de responder muy bien a cualquier desarrolla perfectamente en este
vía de inoculación, tiene en contra- tipo de células, pero con el inconposición el inconveniente de pre- veniente de que estas células son
sentar la enfermedad de forma cÍ- portadoras de distintos virus aviaclica en períodos de excitación y res (Cofal y Rif positivos y negade paresia que hacen peligroso su tivos) , de Mycoplasmas. La presencia de estos elementos pudiemanejo.
El hamster responde como el ra- ra falsear la reacción propia del
tón y puede utilizarse la vía intra- virus rábico.
b) Células renales de hamster
muscular. El embrión de pollo, muy
utilizado en las vacunas denomi- y cerdo. Son muy útiles para el
nadas avianizadas, es menos sen- crecimiento del virus que nos ocusible que el ratón para las cepas pa, y previo período de adaptación,
de calle, y no permite la eviden- la conservación del poder antigéciación de los corpúsculos de Ne- nico es perfecta.
e) Células de las glándulas sagri.
La extracción del cerebro de los livares del perro. En estas céluanimales muertos por inoculación las la reproducción del virus rábiexperimental y la preparación de co llega al punto máximo. Cuando
cortes para su estudio histopato- se llevan unos 20 pases por estas
222
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Vol. XLVIII. - N 207
,0
células, aparece un cierto efecto
d) Líneas de células de riñón
citopático.
de perro. Las células epiteliales
2. Líneas celulares continuas. del riñón son un magnífico medio
Este tipo de cultivos presenta cier- para la cultura de varias cepas del
tas ventajas sobre las células pri- virus, que permiten su reinfección
marias: una mejor propagación y continuada.
3. Cepas celulares. La cepa de
mejor conservación, unido a la falcélulas
diploides humanas ha perta de peligro de transmisión de
otros elementos. Sin embargo, tie- mitido el crecimiento de virus ránen un inconveniente, que es el de bico, el cual, una vez adaptado, se
no ser aptas para la preparación hace citopatógeno.
En la mayoría de los casos el
de vacuna humana.
virus necesita un período de adap(1;) Línea celular del epéndimo
tación más o menos prolongado.
de ratón. Utilizada por Atanasiu
Para su titulación dentro de los
y Laurent, ha demostrado poseer
sistemas celulares, la técnica más
al cabo de varios meses un deter- frecuentemente utilizada es la inminado efecto citopatógeno, tanto oculación al ratón, previa congelapara el virus de calle como para ción y descongelación de las céluel virus fijo, pero este efecto es las para que liberen el virus. Tamirregular y se observa una apari- bién puede realizarse por inmunoción de inclusiones parecidas a los fluorescencia y microscopia a la
corpúsculos de N egri.
búsqueda de las inclusiones intrab) Línea derivada de los fibro- citoplasmáticas.
blastos del rifión del hamster
La determinación del virus por
(BHK-21). Estas células han sido el efecto citopatógeno es muy irreutilizadas para el estudio de la gular en su valor diagnóstico, pero
bioquímica y estructura del virus este valor aumenta considerablerábico.
mente cuando a estas células se
les
añaden los anticuerpos marcae) Línea celular del endotelio
de conejo. En estas células el vi- dos por el isotiocianato de fluoresrus se multiplica durante mucho ceína.
De todas formas, estos métodos,
tiempo sin ocasionar alteración. La
adición de anticuerpos antirrábic pese a las dificultades técnicas accos determina la lisis de las célu- tuales, deben experimentarse y eslas infectadas, pero después de su tudiarse para demostrar la posibireproducción mitótica.
lidad de su utilización.