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EL GÉNERO ARMILLARIA SPP EN EL PAÍS VASCO.
CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y MOLECULAR
Aseginolaza, J, Albaina, J.e Iturritxa, E.
[email protected]
NEIKER. Granja Modelo – Arkaute. Apdo. 46. 01080 Vitoria-Gasteiz
Resumen
El género Armillaria se comporta como un patógeno primario, aunque puede actuar como parásito
secundario o saprofito, suele matar a lo árboles que ataca siendo especialmente dramático en los primeros 7
años tanto en plantaciones como en zonas forestales naturales. En geneal los síntomas tardan en hacerse
patentes, a medida que evoluciona la destrucción del sistema radical se evidencian los síntomas en las
copas. A partir de ese momento la enfremedad evoluciona rápidamente produciendose aparentemente la
muerte súbita del árbol.
Se realiza un muestreo dirigido en plantaciones de Pinus radiata, viñas y árboles procedentes de
áreas urbanas y periurbanas, realizándose una prospección en función de la presencia de síntomas
asociados a la enfermedad provocada por este hongo. Se estima el nivel de afección en los diferentes
hospedadores recogiéndose una muestra de estos y aislando el hongo en laboratorio para su posterior
estudio morfológico y molecular.
Entre los aislados estudiados, se detectan las siguientes especies de Armillaria:
A. ostoyae, A. tabescens. A. bulbosa, A. mellea, A. gallyca aisladas a parti de los hospedadores:
Pinus radiata, Chamaecyparis lawsoniana, Quercus robur, Fagus silvatica, Salix babilonica, Pinus nigra,
Vitis vinifera
Palabras Clave: RFLP-PCR, rizomorfos, Armillaria ostoyae, Pinus radiata
INTRODUCCION
Muchas especies de Armillaria son patógenos facultativos, pero otros saprófitos obligados o
simbiontes. Este género tiene un amplio rango de hospedadores arboreos. Son capaces de sobrevivir largos
periodos de tiempo sobre madera muerta, en forma de rizomorfo.
Excepto pos un corto periodo durante el otoño, cuando estos hongos desarrollan carpóforo, las hifas
y rizomorfos han de ser clasificados por otros métodoscomplementarios de los métodos morfológicos.
Los métodos tradicionales para la identifiación de Armillaria spp.son lentos y en ocasiones
problemáticos, ésta ha sido una de las limitaciones que han conducido a la identificación de este género
utilizando técnicas adicionales de biología molecular.
METODOLOGÍA
Durante los meses de verano y otoño se llevó a cabo un muestreo, siguiendo un itinerario de pistas
forestales por áreas boscosas del País Vasco, algunos de los aislados se localizaron en jardines urbanos. Se
realizó un muestreo dirigido a la selección de árboles con síntomas. Los aislados fúngicos de partida fueron
en su mayoría obtenidos a partir de rizomorfos localizados en areas subcorticales del árbol, también se
obtuvieron una minoría a partir de carpóforos y esporas
Las muestras se cultivaron sobre medio agarizado selectivo BDS (Worral, 1991).
Una vez obtenido el aislado, se realizó un seguimiento del desarrollo y estructura de los rizomorfos.
La identificación se realizó mediante el análisis de las características morfológicas del aislado en cultivo in
vitro (Malt Agar) y mediante el análisis morfológico de carpóforos si estaban presentes. Finalmente se
realiza la identificación de aislados mediante técnicas moleculares.
La extracción del ADN se llevo a cabo mediante el uso del kit de extracción EZNA, fungal DNA
minprep (Omega Bioteck) siguiendo el protocolo especificado en las instrucciones de utilización del kit. Se
utilizaron como cebadores dos oligonucleótidos utilizados por Mansilla et al. (2000), el LR12R (Veldman
et al., 1981) y el O-1 (Duschesne & Anderson, 1990).
La reacción de PCR, la amplificación, visualización de los productos resultante y etapas de
digestión posteriores, se llevo a cabo siguiendo literalmente el procedimiento propuesto por Mansilla et al.
(2000)
RESULTADOS
El género Armilaria se encuentra ampliamente dipersado en masas forestales del País Vasco.Figura
1.
En la Tabla 1 se muestra la relación de especies de Armillaria identificadas y los hospedadores a
partir de los cuales fueron obtenidos los aislados. Destaca la amplitud de hospedadores así como la
diversidad dento del género fúngico estudiado considerando la limitada extensión en estudio.
Entre las especies detectadas se encuentran: Armillaria mellea (Figura 2 y 5), A. tabescens (Figura
3), A. ostoyae, A. gallica y A. bulbosa
En la Figura 4 se muestran las bandas de restricción de aislados de Armillaria sp. en 14 muestras
estudiadas, tras la digestión con la enzima AluI, separadas mediante gel de agarosa.
CONCLUSIONES
Armillaria muestra una amplia distribución en las masas forestales del País Vasco, en áreas de ubicación y
diversidad específica habiéndose detectado 5 especies diferentes.
Los métodos moleculares son una herramienta de identificación muy valiosa en la caracterización e
identificación de las especies de Armillaria, clarificando dudas planteadas al considerar exclusivamente los
datos morfológicos
BIBLIOGRAFÍA
DUSCHESNE & ANDERSON, 1990. Location and direction of transcription of the 5S rRNA gene in
Armillaria. Mycological Research 94: 266-269.
MANSILLA, P.; AGUIN, A.; ABELLEIRA, A.; SAINZ, M.J.; 2000. Adaptación de la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) para la identificación de especies de Armillaria en Galicia. Boletín de Sanidad
Vegetal y Plagas. 26: 79-98, 2000.
VELDMAN ET AL.; KLOOTWIJK, J.; DE REGT, V.C.H.F. & RUDI, R.J.; 1981. The primary and
secondary structure of yeast 26SrRNA. Nucleic Acids Research 9: 6935-6952.
WORRAL, J.J.; 1991. Media for selective isolation of Hymenomycetes. Micología, 83 (3), pp. 296-302.
MUESTREO DE FOCOS DE Armillaria spp. (30/07/03 – 05/12/03)
Figura 1. Localización de focos de Armillaria en el País Vasco (puntos azules y rojos), puntos de
procedencia de los aislados de laboratorio llevados a estudio.
Hospedador
Pinus radiata
Quercus robur
Pinus nigra
Castanea sativa
Salix babilonica
Corylus avellana
Vitis vinifera
Pradera
Focos detectados
82
15
3
2
1
1
2
1
Focos aislados en micoteca
21
5
1
0
1
0
2
1
sp. Aislada
A. Mellea
6
A. Ostoyae
11
A.tabescens
0
A.bulbosa
4
A. Gallica
0
A. Mellea
2
A. Ostoyae
1
A.tabescens
1
A.bulbosa
1
A. Gallica
0
A. Mellea
0
A. Ostoyae
1
A.tabescens
0
A.bulbosa
0
A. Gallica
0
A. Mellea
0
A. Ostoyae
0
A.tabescens
0
A.bulbosa
0
A. Gallica
0
A. Mellea
0
A.tabescens
0
A. Ostoyae
1
A. Gallica
0
A. Mellea
0
A.tabescens
0
A. Ostoyae
0
A. Mellea
2
A.tabescens
0
A.bulbosa
0
A. Ostoyae
0
A. Gallica
0
A. Mellea
0
A.tabescens
0
A.bulbosa
0
A. Ostoyae
1
A. Gallica
Robinia pseudacacia
Fagus sylvatica
Fraxinus excelsior
Chamaecyparis lawsoniana
1
1
1
2
0
1
1
2
1
A. Mellea
0
A.tabescens
0
A.bulbosa
0
A. Ostoyae
0
A. Gallica
0
A. Mellea
0
A. Ostoyae
1
A. Gallica
0
A. Mellea
0
A.tabescens
A. Ostoyae
0
A. Mellea
2
A.tabescens
0
1
A. Ostoyae
TOTAL
112
35
0
35
Tabla 1 Muestra la relación de especies de Armillaria identificadas y los hospedadores a partir de
los cuales fueron obtenidos los aislados
Figura 2. Carpóforos y micelio de Armillaria mellea sobre madera en descomposición
(Localidad,Urkiola)
Figura 3. Cuerpos de fructificación de Armillaria tabescens (Localidad,Laukiniz)
Figura 4: Bandas de restricción de aislados de Armillaria sp. en 14 muestras estudiadas, tras la
digestión con la enzima AluI, separadas mediante gel de agarosa.
Figura 5: Aislados de Armillaria mellea creciendo sobre material vegetal, pino insignis, in vitro,
método de mantenimiento de aislados.