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METODOLOGÍA DE TRABAJO
EN VIROSIS DE ESPECIES HORTÍCOLAS
PARA SU APLICACIÓN
A LA JUDÍA GRANJA ASTURIANA
SERIE
INFORMES
TÉCNICOS
Nº. 5 / 93
Instituto de Experimentación y
Promoción Agraria.
METODOLOGÍA DE TRABAJO
EN VIROSIS DE ESPECIES HORTÍCOLAS
PARA SU APLICACIÓN
A LA JUDÍA GRANJA ASTURIANA
AUTORA:
ANA JESÚS GONZÁLEZ RODRÍGUEZ
PROGRAMA DE HORTOFLORICULTURA
SERIE
INFORMES
TÉCNICOS
Nº. 5 / 93
INSTITUTO DE EXPERIMENTACIÓN Y PROMOCIÓN AGRARIA
Edita: Consejería de Medio Rural y Pesca
Instituto de Experimentación y Promoción Agraria
D.L.: AS-616-94
Programa de Hortofloricultura
.
METODOLOGIA DE TRABAJO EN VIROSIS DE ESPECIES HORTICOLAS PARA SU
APLICACION A LA JUDÍA GRANJA ASTURIANA.
INTRODUCCION
El objetivo es dar un repaso a las técnicas utilizadas habitualmente en virología vegetal para
su posterior aplicación al programa de investigación que se está desarrollando sobre la judía granja
asturiana en el Instituto de Experimentación y Promoción Agraria. Para lo cual se acudió al
Departamento de Patología Vegetal de la Universidad Politécnica de Valencia (Escuela Técnica
Superior de Ingenieros Agrónomos) ya que la Dra. Concepción Jordá es una referencia obligada en
el tema de las virosis que afectan a especies de hortícolas en España.
INFORMACION
Utilización de la técnica ELISA para el diagnóstico de virosis vegetales.
Las técnicas inmunoenzimáticas ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) se utilizan
profusamente tanto en sanidad humana como animal y vegetal por su alta sensibilidad,
especificidad, rapidez, economía, y gracias a ellas se pueden realizar un gran número de análisis
pues es fácilmente automatizable.
Los inconvenientes que presenta, sin embargo, son que no siempre se encuentran
comercializados los sueros necesarios y también que el diagnóstico de algunos virus, por su poder
inmunogénico, es necesario comprobarlo por otras técnicas.
Actualmente en la Cátedra de Patología Vegetal de la E.T.S.I.A. de la Universidad
Politécnica de Valencia están utilizando la llamada ELISA-DAS (doble sandwich de anticuerpos) de
forma sistemática para detección del virus del bronceado del tomate (TSWV) en la realización de un
trabajo que pretende determinar si existe transmisión por semilla de dicho virus.
Técnicas de inoculación de virus vegetales.
La inoculación de virus se utiliza con varias finalidades:
a)
Mantenimiento de virus, puesto que son parásitos obligados.
Sin embargo, simultáneamente se deben de mantener los virus mediante congelación a 40oC, -80oC o bajo nitrógeno líquido, dependiendo del tipo de virus, puesto que tras repetidos
pases de inoculación en huéspedes pueden cambiar algunas características virales; por tanto, es
necesario conservar los "orígenes" en frío.
b)
Para identificación mediante su pase a plantas indicadoras, utilizado ya desde hace mucho
tiempo.
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c)
Para caracterizar biológicamente los aislados.
La inoculación puede ser mecánica, por injerto o por vectores.
- Inoculación mecánica: Se realiza directamente sobre la planta, utilizando primero un
abrasivo y pasando luego la suspensión del virus, en el tampón adecuado, por las hojas de la planta.
- Inoculación por injerto: Se utiliza para virus sistémicos que no pueden transmitirse
mecánicamente, cuando la planta donante y la receptora sean compatibles. En los casos en los que
se hace transmisión como método de diagnóstico, se utiliza una planta receptora en la que se
produzcan síntomas característicos, es decir, que actúe como planta indicadora.
- Inoculación por vectores: Hay virus que no se pueden trasmitir mecánicamente y es
necesario utilizar su vector natural. También se puede utilizar para regenerar virus que hayan sufrido
sucesivos pases por inoculación mecánica. Para llevarla a cabo hay que tener en cuenta si el virus
es persistente o no persistente pues el tiempo que debe estar en contacto la planta con el vector
dependerá de esta característica.
En la Cátedra de Patología Vegetal de la Universidad Politécnica de Valencia estaban
realizando inoculaciones con vectores por ejemplo para comprobar cultivares resistentes al virus del
amarilleo del melón.
Técnicas de purificación de virus.
En algunas ocasiones es necesario purificar el virus, por ejemplo cuando no se encuentra
suero comercial y es necesario obtenerlo inoculando el virus en un animal de ensayo o bien cuando
se precisa obtener sondas marcadas para realizar el diagnóstico por hibridación de ácidos nucléicos;
esto último es lo que estaban realizando en la Universidad Politécnica para el caso del Tomato
yellow leaf curl virus o virus del enrollamiento en hoja de cuchara del tomate (TYLCV).
Observación de virus por microscopía electrónica.
Por observación al microscopio electrónico se puede conocer la forma de un virus, lo que
constituye una ayuda importante para "orientar" el diagnóstico y también para corroborar el realizado
por serología, aunque no se puede basar un diagnóstico sólo en la observación microscópica.
En el caso de los virus esféricos la observación al microscopio electrónico plantea más
problemas, pues tienen un aspecto similar al de los ribosomas y podrían ser confundidos fácilmente.
Posibles aplicaciones al caso de la judía en Asturias.
Abordar el diagnóstico de virosis podría tener importantes repercusiones en el programa de
trabajo a realizar en judía.
a) Obtención de semilla pre-base libre de virus.
Para eliminar el virus del mosaico común de la judía (BCMV) de las semillas, se podrían
cultivar las plantas en invernadero utilizando mallas anti-pulgones y aplicando los tratamientos
fitosanitarios adecuados. Durante todo el cultivo se realizarían controles de todas las plantas cada 15
días eliminando tanto las que resultasen positivas como las dudosas en el análisis de BCMV.
Una vez obtenida semilla de planta sana, sería necesario multiplicarla de forma adecuada
para que no se infecte. Este es quizá el punto más conflictivo pues sería necesario buscar las
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condiciones para que no se de la enfermedad o bien seguir cultivando en invernadero pero en mayor
extensión.
El inconveniente del método sería que sólo se puede conservar la semilla libre de BCMV si
se mantiene un suministro continuado de semilla sana a los agricultores, pues en el momento en que
esa semilla se siembra en los campos es susceptible de ser infectada de nuevo.
b) Como apoyo al programa de Mejora Genética para chequear los híbridos obtenidos.
c) Puesta a punto de un método de certificación de semillas de judía para BCMV. Este es un trabajo
laborioso pero muy importante para realizar los análisis de virosis en lotes de semillas. Para llevarlo
a cabo habría que estudiar primero la transmisibilidad por semilla del virus lo que se determinaría por
el análisis de, al menos, 10.000 semillas procedentes de plantas que hayan sido infectadas en los
primeros estadíos del desarrollo. También habría que determinar la sensibilidad del test ELISA para
análisis agrupados de varias muestras. Por último, como resolución de un problema estadístico, una
vez conocida la premisa del porcentaje de transmisibilidad, se determinaría el "tamaño mínimo de
muestra".
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